Abstract

Positron espectroscopia de aniquilação vida (PALS) fornece uma medida direta da volume livre tamanhos vazio em polímeros e sistemas biológicos. Este volume livre é fundamental para explicar e compreender as propriedades físicas e mecânicas dos polímeros. Além disso, PALS foi recentemente proposto como uma potencial ferramenta na detecção de câncer em estágios iniciais, sondando as diferenças entre os espaços vazios volume livre escala subnanometer entre as amostras cancerosas /saudáveis ​​da pele de um mesmo paciente. Apesar de várias investigações sobre o volume livre em tecidos cancerosos complexos, têm sido relatados há estudos Pósitrons de culturas de células de câncer de estar. Nós demonstramos que o PALS poderá ser aplicada ao estudo de culturas de células em 3D de vida humana. A técnica é também capaz de detectar alterações de escala atómica no tamanho dos espaços vazios volume livre devido às respostas biológicas ao TGF-β. PALS podem ser desenvolvidos para caracterizar o efeito de diferentes condições de cultivo nos vazios volume livre de células cultivadas

in vitro

Citation:. Axpe E, Lopez-Euba T, Castellanos-Rubio A, Merida D, Garcia JA, Plaza-Izurieta L, et al. (2014) Detecção de escala atômica Mudanças na gratuito Volume Vazio Tamanho da Cultura celulares de cancro colorrectal tridimensional com Pósitrons Lifetime Spectroscopy. PLoS ONE 9 (1): e83838. doi: 10.1371 /journal.pone.0083838

editor: Varda Rotter, Weizmann Institute of Science, Israel

Recebido: 12 Julho, 2013; Aceito: 17 de novembro de 2013; Publicação: 02 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Axpe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Departamento Basco da Indústria conceder nenhuma. SAI11 /263 – PRODETEC e do Departamento de Educação, Universidades e Investigação Basco conceder nenhuma. TI /443/10. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

vazios volume livre desempenhar um papel fundamental em uma variedade de propriedades mecânicas de polímeros [1] e processos dinâmicos em sistemas biológicos, incluindo a permeabilidade de moléculas pequenas e de difusão de drogas através das membranas celulares [2]. espectroscopia de Pósitrons vida (PALS) fornece uma medida direta dos tamanhos vazios volume livre em polímeros e sistemas biológicos a nível molecular, e este volume livre é fundamental para entender as propriedades físicas e mecânicas de sistemas biomoleculares complexas como colágeno [3], suínos lente do olho [4], secções de cérebro de rato [5] e a pele humana [6].

Demonstrou-se recentemente que o PALS é sensível a alterações no tamanho de volume de vazios livres que estão associadas com certos tipos de tumores e é capaz de discriminar entre amostras de pele saudável e cancerosas do mesmo paciente. Assim, o PALS tem sido proposto como uma potencial ferramenta para detectar a formação de cancro em fases iniciais do desenvolvimento do tumor [6], [7]. No entanto, a composição celular de amostras de tecido varia a partir do mesmo organismo e podem envolver alterações nos tamanhos void [8].

A nossa hipótese é a de que as respostas biológicas a factores ambientais, tais como a diferenciação celular e alterações na estrutura de colónias de células são acompanhadas por mudanças em escala atômica no tamanho livre volume vazio das células, e que essas mudanças podem ser caracterizados por PALS. Para testar essa ideia, foi utilizado um modelo de cultura T84 humano câncer de cólon celular 3D sob duas condições diferentes que resultam em distintos

in vitro

organização multicelular de colônias. As células foram cultivadas numa matriz de colagénio tipo I de gel com ou sem transformar β factor de crescimento (TGF-beta), factor derivado de fibroblastos que afectam a proliferação de células epiteliais, diferenciação, motilidade, e a diferenciação das células T84. As células em forma de cachos de células 3D colagénio desorganizadas dentro dos geles, mas, quando cultivada na presença de TGF-β, células epiteliais T84 são capazes de organizar e diferenciam-se em um fenótipo distinto que se assemelha criptas intestinais [9]. Mostramos que as medições PALS são capazes de detectar mudanças em escala atômica de tamanho vazios em humanos adenocarcinoma do cólon culturas de células 3D em desenvolvimento ao longo do tempo e quando tratados com TGF-β.

Materiais e Métodos

cultura celular

linha de células T84 adenocarcinoma de cólon humano (CCL 248, ATCC Rockville, MD, EUA) foi gentilmente cedido pelo Prof. Markku Maki (doença celíaca Grupo de Estudo da Universidade de Tampere, Finlândia). As células foram mantidas em cultura em laboratório. mistura de Eagle modificado por Dulbecco F12 nutriente (01:01) (DMEM-F12 ref 31330), penicilina-estreptomicina (ref 15070) e bicarbonato de sódio foram adquiridos a Life Technologies (Espanha). soro inactivado pelo calor fetal bovino (F9665 ref), 10 × meio RPMI-1640 (ref R1145), tripsina /EDTA (T4049 ref), Triton X-100 (T9284 ref), albumim a partir de soro de bovino (B4287 Ref) e ribonuclease A (ref R6513) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (Espanha). O colagénio de cauda de rato I (ref 354236) foi adquirida da Beckton Dickinson (Espanha). Factor de crescimento transformante beta-1 humano recombinante (rhTGF-β, Ref 240-B) foi adquirido a R D systems (Reino Unido) e paraformaldeído (ref 15710) a partir de Ciências de microscopia electrónica, Hoetch 33342 e faloidina-PE foram obtidos a partir de Sigma- Aldrich (Espanha). Pratos de plástico foram obtidos a partir de Corning Costar (Espanha) e placas de Becton Dickinson (Espanha).

As células foram mantidas em meio de cultura composto por DMEM-F12, soro de bovino fetal inactivado pelo calor a 5% e 1% de penicilina-estreptomicina [9]. As células T84 foram cultivadas em frascos T75 de cultura de tecidos a 37 ° C em 5% de CO

2 ambiente e passadas uma vez por semana, ao atingir 80% de confluência. O meio de cultura foi mudado a cada 2 dias. As células T84 foram removidas dos frascos com 6 ml de 0,25% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 15 minutos. Em seguida, foram lavadas em meio, recolhidos por centrifugação a 450xg durante 5 minutos e subcultivadas em placas de 24 poços com colagénio. As células em suspensão foram contadas com um contador celular (

contagem Coulter partícula e analisador de tamanho de

, Beckman Coulter). As células T84 foram plaqueadas em placas de 24 poços a uma densidade de 1,5 x 10

5 células /poço.

Para gerar 3-D agregados da cauda de rato O colagénio I foi usado. O colagénio foi misturado com ácido acético, 10 × RPMI-1640 e bicarbonato de sódio. Em cada experiência utilizou-se 1 ml de colágeno, 125 ul de meio RPMI-1640 e 10 × 125 mL de bicarbonato de sódio.

para criar a cultura 3D, 300 ul da mistura de colagénio (3 mg /ml de concentração final) foram adicionados a cada poço e incubou-se a 37 ° C a gelify. Após 20 minutos de incubação, as células foram ressuspensas em 200 ul adicionais de colagénio e a mistura foram semeadas em géis de colagénio. Por fim, um meio de cultura ml de DMEM-F12 foi adicionada para cobrir culturas 3D.

Para determinar o comprimento óptimo das experiências (isto é, o tempo adequado nas culturas de células para medir o seu volume livre médio através PALS) temos escolhidos tempos de cultivo diferentes para fazer medições:. 6-13-20-27-34-41 dias

estimulação celular

para induzir mudanças na morfologia das células, agregados T84 foram incubadas com 10 ng /ml hrTGF-β1 adicionado ao meio de cultura [9]. Estas culturas foram cultivadas em cultura até 41 dias, e o meio de cultura foi mudado de dois em dois dias.

Microscopia de imunofluorescência

7 e 17 dias de idade, culturas de células 3D foram fixadas com paraformaldeído a 4% na sala temperatura durante 30 minutos. Após lavagem três vezes com PBS, as culturas foram permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 a 4 ° C durante a noite e lavou-se novamente com PBS. Após bloqueio com 3% de BSA em PBS à temperatura ambiente durante 2 horas, as culturas foram incubadas com ARNase 1 × (1:1000) à temperatura ambiente durante 1 hora [10]. actina filamentosa foi marcado com faloidina-PE (1:1000) a 4 ° C durante a noite [11]. núcleos celulares foram corados com Hoechst 33342 (1:1000) a 4 ° C durante 3 horas.

As amostras foram analisadas com um microscópio confocal Olympus FluoView FV500. deconvolução pilha e reconstrução 3D de imagens tiradas no eixo z para construir vídeos de movimento foram realizadas com o software ImageJ.

volume livre medições de tamanho vazio

Com relação ao espectrômetro, ORTEC (EUA) eletrônico módulos foram equipados com duas BC-422 cintiladores plásticos, a partir de Saint Gobain (EUA) e dois multiplicadores H1949-50 Hamamatsu (Japão) foto adequados na posição vertical dentro de uma geladeira FFD-1402 feita por Radiber SA (Espanha). A fonte de positrões era

22NaCl da PerkinElmer (EUA) de cerca de 15 uCi, evaporou-se entre duas folhas de Kapton de 7,5 mm de CS Hyde (EUA) e de 75 mm a partir de DuPont (EUA) selada por uma dupla face fita Kapton de CAPLINQ (Canadá). Desde que pretende medir fresco, vivendo culturas de células, que projetou e fabricou um detentor específico amostra para o estudo (fig suplementar. 1).

A microscopia confocal de T84 7 e 17 dias de idade na cultura tridimensional . Todas as imagens são de 20 × ampliação. Barra de escala representam 50 mm. A) T84 colónias são observados com contraste de fase. núcleos B) de células coradas com Hoechst. C) actina filamentosa está manchado com faloidina-PE. Em D, fundiu imagens de B e C.

PALS experimentos foram realizados por um sistema de cronometragem coincidência fast-rápido com uma largura à meia altura resolução (FWHM) de 0,260 ns. As medições foram realizadas a 4 ° C. O tempo de vida de pósitrons permaneceu inalterada ao longo do tempo, a exposição à radiação de origem durante três medições. Os espectros de vida recolhidas com mais de 3 × 10

6 contagens por espectro foram analisados ​​usando o programa LT_polymers [12]. Depois de se subtrair a contribuição fonte (31,6%, 0,382 NS), de positrões vidas espectros foram decompostas em três componentes. A distribuição de componentes mais longa duração foi atribuído ao

orto

-Positronium (

o

-PS) distribuição de vida útil como descrito anteriormente [6]. O tamanho médio do raio do volume de vazios em culturas 3D foram estimados por meio da equação Tao-Eldrup [13], [14], com base na positrônio aprisionamento nos espaços vazios esféricos em polímeros: em que

R

0 = I +

Δ

R

, e Δ

R

é um parâmetro empírico ajustado para ser 1.66 a [15].

Resultados

T84 células epiteliais do intestino crescido três colónias redondas desorganizados dimensionalmente formados em 7 e 17 culturas um dia de idade (Figura 1. controle). As células foram unpolarized e reuniu em torno de aglomerados globulares sem orientação organizada. núcleos de células foram distribuídos em torno da colónia, mas de uma forma desorganizada (Video S1, Vídeo S2). No entanto, quando as células T84 foram cultivadas em três dimensões na presença de TGF -β, colónias de células apresentada uma estrutura altamente organizada, como uma camada de uma célula em torno de um lúmen (Figura 1. TGF-β, Vídeo S3, S4 de Vídeo) em torno de um lúmen central. distribuição actina filamentosa (Figura 1.C) localizada no revestimento dos lúmens esfera, reflectindo TGF-β diferenciação mediada (Vídeo S3, S4 de vídeo). Esta estrutura altamente organizada é bem entendido por várias videos na informação complementar.

Os dados obtidos por PALS estão resumidos na Tabela 1. Em termos de volume de vazios livres tamanhos, tanto em condições de crescimento não estimuladas e de TGF-p no vazio volumes das culturas 3D aumentada até atingir um máximo (Figura 2); Para condições normais de crescimento do volume vazio média no pico foi de 102 ± 1 A

3 a 34 dias, enquanto que para a cultura com TGF-β foi de 111 ± 1 A

3 a 20 dias. Como mostrado na Figura 2, uma vez que o tamanho médio de vazio atingiu um Maximun, este valor começou a diminuir gradualmente: o volume vazio médio diminuiu em 7%, em condições normais, em uma semana, e 16% em 3 semanas em condições de TGF-β

a curva azul representa culturas de controlo e a curva vermelha representa culturas tratadas com TGF-β.

o tempo de vida médio e distribuição

o

-PS em três culturas de células dimensionais foram, respectivamente, 2-12% e 20-120% maiores do que no colagénio (Tabela 1). Dependendo do ponto de tempo de crescimento, o

o

distribuição vida -PS para culturas de TGF-beta foi entre 0,11 ± 0,08 ns para 0,26 ± 0,07 ns maior do que sob condições de crescimento não estimuladas.

Discussão

Temos demonstrado que o modelo de cultura T84 3D permite o estudo específico de volume livre em células vivas por PALS. Descobrimos que PALS detecta alterações em escala atômica de o volume livre tamanho médio nulo em culturas de células 3D humana de adenocarcinoma do cólon ao longo do tempo. As alterações morfológicas observadas por microscopia de imunofluorescência em culturas de células em diferentes condições são certamente a consequência de eventos moleculares que estão ocorrendo nas células e também são refletidos em medidas PALS. Embora os eventos de desenvolvimento de culturas de células não pode ser correlacionado directamente com o volume livre, os resultados sugerem que as alterações celulares são, de facto reflecte-se na nanoestrutura destas culturas. O

o

-PS mudanças ao longo da vida, provavelmente emergir dos processos dinâmicos de culturas celulares (crescimento, divisão e morte). Além disso, o TGF-β induz a diferenciação celular, e este é acompained por um aumento na distribuição de

O tempo de vida

-PS (e, portanto, do tamanho de volume livre) nas culturas de células em 3D. Este resultado implica uma maior dispersão do tamanho do furo em amostras tratadas com TGF-β em comparação com condições não estimuladas. A morte celular pode estar envolvido na queda no

o

-PS vidas.

Estamos no alvorecer de aplicações PALS em sistemas de células complexas, mas nossos resultados mostram que as culturas de células 3D (

o

-PS vida é medido em uma mistura de células e colágeno) pode ser um bom ponto de partida para este tipo de pesquisa. Atualmente, PALS só permite medições de massa que não oferecem resolução suficiente para distinguir

o

-PS vidas em células individuais de toda a cultura. No entanto, o aumento medido em vidas e distribuições deve ser devida a alterações estruturais e moleculares que afectam o volume livre das células e, por conseguinte, o de cultura 3D. Além disso, PALS é uma técnica não-perturbativa; que perturba nem a estrutura da cultura nem 3D dinâmica de células. Usamos o modelo Tao-Eldrup para polímeros ao calcular os tamanhos dos espaços vazios volume livre da

o

-PS vida, como feito anteriormente em muitos estudos PALS em sistemas biológicos [3] – [7].

Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo da aplicação do PALS em 3D vivendo culturas de células e, na verdade, mais medições em diferentes linhas de células e condições de cultura que modificam diferentes parâmetros biológicos são necessários antes que este método pode ser considerada uma ferramenta de diagnóstico potencialmente úteis na doença humana. Juntamente com a pesquisa experimental, os estudos para mostrar se os campos elétricos locais causadas pela tensão transmembranar das células estão afetando o sinal de pósitrons, ou que partes da célula são alvos preferidos para a aniquilação de pósitrons também deve ser realizada. Além disso, as simulações computacionais para avaliar o ajuste do modelo de Tao-Eldrup (implementado para caracterização-volume livre em polímeros) em matéria biológica mais complexa será necessário.

Em conclusão, este é o primeiro estudo a aplicação PALS para a caracterização de células vivas. Nossos resultados demonstram que as culturas de células em 3D são úteis para medir volume livre em células vivas por PALS de uma forma realista e controlada, e para a observação de mudanças no volume livre tamanhos vazio em culturas de células devido a factores específicos (por exemplo, tempo de crescimento e TGF-β). Este estudo está de acordo com a técnica PALS como um instrumento válido para a caracterização de sistemas biológicos e pode fornecer informações úteis para a investigação do cancro em escala atômica e molecular.

Informações de Apoio

Figura S1.

concepção e montagem do suporte da amostra e fonte de positrões para a aplicação do PALS em amostras biológicas e líquidos. Nós projetou e fabricou um porta-amostras de alumínio para a medição de amostras biológicas e líquidos. Os cintiladores e fotomultiplicadores utilizados neste trabalho foram colocados numa posição vertical. A figura mostra a secção longitudinal do suporte de amostras (1). Em (2) descreve-se a amostra encher o lado inferior do suporte. Em (3), que posiciona a fonte de Kapton sobre a amostra, senta-se na projecção de alumínio. Nós também podemos ver como o

22Na é depositado anteriormente apenas no meio do Kapton, para que todos os pósitrons aniquilar na amostra, e não no suporte. Esta fonte kapton precisa ser robusto, por isso usamos uma folha de Kapton mais grossa de 75 mm para a parte sentado na projeção titular (Kapton folha B), em comparação com os 7,5 mícrons folha de Kapton A. In (4) que mostram como o fonte de pósitrons é colada por duas amostras idênticas líquido /biológicos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083838.s001

(TIFF)

Vídeo S1.

confocal de imunofluorescência de colônias T84 tridimensionais após 7 dias em cultura

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083838.s002

(AVI)

Vídeo S2.

confocal de imunofluorescência de colônias T84 tridimensionais após 17 dias em cultura

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083838.s003

(AVI)

vídeo S3.

confocal de imunofluorescência de colónias T84 tridimensionais após 7 dias de cultura com 10 ng /ml de TGF-β

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083838.s004

(AVI)

vídeo S4 .

confocal de imunofluorescência de colónias T84 tridimensionais após 17 dias em cultura com 10 ng /ml de TGF-β

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083838.s005

(AVI)

Agradecimentos

O apoio técnico e humano fornecido por SGIker (UPV /EHU, MICINN, GV /EJ, FEDER e FSE) é reconhecido agradecimento.