Abstract

As alterações na expressão de miRNA são uma característica comum em cancro do cólon. Essas mudanças que ocorrem na transição do normal para o adenoma e de adenoma para carcinoma, no entanto, não foram bem definidas. Além disso, miRNA mudanças entre os subgrupos de tumores de câncer de cólon também não foram adequadamente avaliados. Neste estudo, nós examinamos a expressão global de miRNA em 315 amostras, que incluiu 52 mucosa normal do cólon, 41 adenoma tubuloviloso, 158 adenocarcinomas com proficiente de reparo incompatível DNA (pMMR) selecionados para estágio e idade de início, e 64 adenocarcinomas com DNA defeituoso de reparo incompatível (dMMR) seleccionado para esporádica (n = 53) e herdou o cancro do cólon (n = 11). tumores esporádicos dMMR todos tinham

MLH1

inactivação devido à hipermetilação do promotor. PCA sem supervisão e análise de agrupamento demonstrou que tecidos normais do cólon, adenomas, carcinomas pMMR e carcinomas dMMR foram todos claramente perceptíveis. A maioria dos miARNs que foram diferencialmente expressos entre normal e também pólipos foram diferencialmente expressos com uma magnitude similar na comparação do normal para ambos os grupos e pMMR tumorais dMMR, sugerindo uma progressão gradual de transformação a partir de cólon normal a de carcinoma. Entre os miARNs demonstrando a maior dobrar para cima ou para baixo-regulados mudanças (≥4), quatro novel (miR-31, o miR-1, miR-9 e miR-99a) e duas relatado anteriormente (miR-137 e miR-135b miARNs) foram identificados em comparação normais /adenoma. Todos menos um destes (o miR-99a) demonstrou diferenças de expressão semelhantes nas duas comparações normais /carcinoma, o que sugere que estas alterações tumorais precoces são importantes tanto na pMMR- e cancros dMMR-derivados. A comparação entre tumores pMMR e dMMR identificou quatro miRNAs (miR-31, miR-552, miR-592 e miR-224) com as diferenças de expressão estatisticamente significativas (mudança ≥2 vezes)

Citation:. Oberg AL , Francês AJ, Sarver aL, Subramanian S, Morlan BW, Riska SM, et al. (2011) Expressão miRNA em pólipos do cólon fornece evidência para um modelo multihit de cancro do cólon. PLoS ONE 6 (6): e20465. doi: 10.1371 /journal.pone.0020465

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de março de 2011; Aceito: 26 de abril de 2011; Publicação: 09 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Oberg et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Parceria Minnesota for Biotechnology and Medical Genomics [Fundação médica 2006-100412]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do cólon (CC) é uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo, com cerca de 148.000 novos casos notificados nos Estados Unidos em 2009 [1]. A progressão de CC é considerado um processo passo a passo com a acumulação de alterações genéticas diferentes e epigenética levando a uma transformação de uma célula normal para um tumor pré-maligno e, finalmente, a um tumor maligno e potencialmente metastático (normal para a sequência de adenoma carcinoma). Os dados atuais demonstram claramente a presença de heterogeneidade nesta seqüência de eventos. Estes incluem: (i) o desenvolvimento de diferentes tipos de lesões pré-cancerosas, tais como adenoma viloso, adenoma tubular, adenoma tubuloviloso e pólipo serrilhada com as diferenças presumidas em defeitos moleculares; (Ii) transição para câncer invasivo demonstrando anormalidades moleculares muito diferentes (por exemplo, tumores com e sem defeito de reparo incompatível DNA); e finalmente, (iii) o desenvolvimento de esporádica contra várias formas de CC hereditária. Os factores subjacentes responsáveis ​​por esta heterogeneidade, no entanto, estão ainda em grande parte desconhecida.

Uma das diferenças mais claras demonstradas até agora para CC esporádica baseia-se na presença ou ausência de reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN funcional (MMR) [2] , [3], [4]. Os tumores com MMR defeituoso (dMMR) foram identificados em ~ 20% de CC esporádica e são caracterizados pela presença de um fenótipo tumoral específico, denominado instabilidade microssatélite (MSI). Em CC esporádica, três fenótipos MSI distintos foram descritos: MSS, MSI-L e MSI-H [5]. O fenótipo MSI-H está associado com características clinicopatológicas distintas [2], [3], [4], incluindo um resultado mais favorável [6]. Entre CC esporádica, a maioria das vezes MSI-H resulta de inactivação de

MLH1

devido à hipermetilação do promotor (-95%) [2], [3], [4]. O restante -80% do CC com MMR proficiente (pMMR), por outro lado, segue uma instabilidade cromossômica (CIN) via e estão associadas a uma elevada frequência de aneuploidia e alélicas desequilíbrio [7].

Embora a maioria dos CC parece ser esporádica com uma média de idade no momento do diagnóstico, em meados da década de 60 s, aproximadamente 15-20% dos casos surgem dentro de agregados familiares, com condições genéticas conhecidas que representa apenas uma pequena fracção destes. Enquanto CC hereditária foi reconhecido durante algum tempo, a identidade de genes envolvidos no processo da doença foi apenas recentemente identificados para muitas das condições hereditárias. A forma hereditária mais prevalente de CC é hereditário não-polipose cancro do cólon (HNPCC), representando ~2-3% de todos os casos [8].

Para HNPCC, mutações germinativas nos genes DNA MMR também são responsável por esta condição, com

MLH1

e

MSH2

representando a maioria dos casos (~ 40% cada) e

MSH6

e

PMS2

contabilidade para uma menor percentagem, -10% e 5%, respectivamente, [2], [8]. Os tumores dos doentes estes também são caracterizados pela presença de MSI-H e pela perda de expressão da proteína MMR para o gene afectado. Assim, a etiologia molecular de tumores envolvendo dMMR é muito heterogêneo, envolvendo vários genes diferentes e inúmeros mecanismos de inativação gênica, incluindo alterações epigenéticas, somáticas e germinativas.

Parece haver pelo menos duas vias significativas levando a esporádica e CC hereditária. A primeira via, envolvendo dMMR, é pensado para originar em um precursor serrilhada (adenoma serrilhado sessile) e é responsável por todos os esporádicos MSI-H CC (embora nem todos os tipos de câncer que surgem através da via serrilhada são MSI-H). HNPCC também dá origem a MSI-H CC. A segunda via é pensado para surgir de túbulo /vilosidades adenomas e leva a CC esporádica ou CC relacionados com o FAP caracterizada por tumor CIN e pMMR. A nossa compreensão destas vias em um nível molecular e o seu envolvimento no processo de transição do normal para o pólipo para carcinoma, embora tenha aumentado, continua incompleta.

abordagens (perfil de expressão ampla Genome-, análise de SNP do genoma, aCGH, próxima sequenciamento geração) continuam a refinar nossa compreensão do processo de desenvolvimento de neoplasias. A descoberta de uma crescente classe de RNAs não-codificantes pequenas, incluindo miRNAs, revelou um nível ainda maior de complexidade para a biologia do câncer [9], [10], [11]. microRNAs (miRNAs) são 18-24 nt pequenas moléculas RNA não codificante que inibem predominantemente a expressão do gene ao nível [9] pós-transcricional. Como miARNs regular a expressão de um grande número de genes que codificam proteínas, uma vasta gama de processos biológicos são afectados, tais como o metabolismo, organogénese, desenvolvimento, e a determinação do destino celular, incluindo morte [10]. expressão alterada de miARNs também tem sido associado com uma variedade de doenças humanas, incluindo o cancro [11]. Embora um número crescente de estudos têm abordado expressão miRNA em CC [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], poucos têm foi publicada em lesões pré-malignas no cólon [21], [22], [23], [24], [25]. Em particular, o papel de miARNs na transição entre cólon normal e pólipos e entre pólipos e cancro não é compreendido.

Neste estudo, miARN (735 alvos de miARN) expressão global, foi avaliada em 315 amostras (52 normais mucosa do cólon e tumores do cólon 263), utilizando a plataforma BeadArray ™ (Illumina, Inc.) [26]. Amostras seleccionadas para análise foram categorizados por uma série de critérios clínicos e moleculares para explorar a heterogeneidade do tumor em mais detalhes, para descobrir miRNAs biologicamente relevantes e de reagir às alterações transitórias do normal para adenoma e adenoma para carcinoma. tipos de tumores incluídos adenoma tubuloviloso, adenocarcinomas com dMMR selecionados para ambos os casos esporádicos e hereditários e adenocarcinomas com pMMR selecionados para a fase (A, B, C e D) e idade de início (old- versus jovem de início).

Métodos

Declaração de Ética

a Mayo Clinic Institutional Review Board revisto e aprovado para estudos em humanos o protocolo intitulado “a identificação e validação da miRNA Profiles assinatura como biomarcadores para Colon Cancer Progression” do Dr. Stephen N. Thibodeau. A Comissão observou que aspectos os estudos em humanos envolvem o uso de amostras recolhidas no âmbito de protocolos IRB-aprovados. A Comissão determinou que o processo de consentimento permite a utilização futura das amostras como exemplificado no protocolo atual. A maioria dos pacientes forneceram consentimento informado por escrito. Para aqueles que não o fizeram, as amostras foram anónimos.

Seleção de Amostras

As amostras de pacientes com CC ou pólipos foram selecionados a partir de dois registros de tumores separados. A primeira coleta de amostras foi obtido de todos os pacientes que foram submetidos à ressecção cirúrgica para CC, durante um período de três anos 1995-1998 (não selecionado). A segunda coleção, iniciada em 2000, é uma coleção em curso de biospecimens de pacientes Mayo Clinic Rochester com neoplasia colorretal. Para o registro mais tarde, não há critérios de pré-selecção foram utilizados pelo registo exceto que apenas os pólipos com um diâmetro de ≥ 7 mm são recolhidos para uso futuro.

Todas as amostras de tecidos foram congelados em nitrogênio líquido a o tempo de recolha e, em seguida, armazenada a -80 ° C para uso posterior. zonas normais do epitélio do cólon foram obtidos a partir de qualquer margem de ressecção ou adjacente ao tumor. Todos, mas uma das amostras normais de tecidos utilizados para este estudo foram combinados com tumores. Foram excluídos os cancros rectais. Os pólipos foram avaliados para o tipo histológico, com adenomas única tubuloviloso selecionados para o estudo. estadiamento do tumor patológico foi classificada de acordo com critérios Dukes ‘[27]. Carta paciente avaliações foram realizadas para obter as características clínicas do tumor, incluindo local do tumor, estágio e idade no momento do diagnóstico.

Processamento de Tumor e RNA Extração

tecido congelado foi cortado em um criostato para gerar hematoxilina e eosina (H e) corado lâminas. Para pólipos, áreas com pelo menos 50% adenoma foram macro-dissecados. Nos cancros, as áreas que contenham pelo menos 70% de células neoplásicas ou superior foram macro-dissecados. Tissue tamanho equivalente a 7 mm

2 e 10 microns de espessura foram cortados e colocados em um frasco contendo 400 uL de tampão de RLT (Qiagen, Chatsworth, CA), incluindo 4 mL de β-mercaptoetanol. O frasco foi em seguida armazenada a -80 ° C até ser utilizado para extracção de ARN usando TRIzol ® © LSTrizol (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

ADN MMR Estado

a maioria dos tumores com DNA defeituoso reparação de emparelhamentos seleccionados para este estudo foram os mesmos que os previamente relatados em cima e têm sido extensivamente caracterizados [28]. MSI tumor foi avaliada por comparação do tumor emparelhado e ADN isolado mucosa normal (estojo de extracção de ADN Qiagen) a partir de materiais fixados com formalina, embebidos em parafina (FFPE) com a utilização de marcadores microssatélites 3-18, como anteriormente descrito [28]. Os tumores foram classificados como MSI-H se ≥30% dos marcadores demonstraram a instabilidade, MSI-L se. 30% apresentaram instabilidade e MSS, se nenhum dos marcadores demonstraram instabilidade

imuno-histoquímica (IHQ) Análise para a proteína expressão foi realizada em amostras de FFPE para MLH1 e MSH2 (todos os casos) e MSH6 e PMS2 (subconjunto), como previamente descrito [29]. ADN dMMR foi definida pela presença de MSI (MSI-H) e /ou a ausência de expressão de proteína de MLH1, MSH2, MSH6 ou PMS2. ADN pMMR foi definido pela ausência de níveis elevados de instabilidade microssatélite (MSS /MSI-L) e por a presença da expressão da proteína normal para MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2.

Tumores com dMMR mostrando uma ausência de MLH1 foram ainda testados para se determinar a causa da inactivação do gene, isto é, epigenética (esporádica) versus o da linha germinal (herdada). Quer um ensaio baseado em PCR específica-metilação ou uma enzima Hpall digerir ensaio baseado foi utilizado para testar a hipermetilação do promotor [30]. Além disso, foi também realizado um ensaio baseado em PCR para alterações dentro da mutação V600E no gene BRAF. casos MLH1 demonstrando

MLH1

hipermetilação do promotor foram classificados como esporádicos (dMMR1). casos MLH1 com tipo selvagem BRAF e sem

MLH1

hipermetilação do promotor foram classificados como de linha germinativa (dMMR2). Casos envolvendo MSH2, MSH6 ou PMS2 (pela perda de expressão da proteína por IHC ou por meio de testes de linha germinativa) também foram classificados como de linha germinativa (dMMR2).

miRNA Profiling

Global miRNA (735 alvos miRNA) expressão foi avaliada utilizando a plataforma BeadArray ™ (Illumina, Inc.) essencialmente como descrito por Sarver et al. [16]. Para cada amostra testada, 200 ng de RNA total foi utilizado para a análise.

Análise Estatística

desenho do estudo.

esquemas aleatórios separados foram criados para determinar a ordem de tecido cryosectioning, extração de RNA e da alocação de amostras para os 96 poços Matrix placas Sentrix array (SAM) para garantir que os grupos de amostra de interesse e demográficas características foram bem equilibradas ao longo de vários efeitos experimentais potenciais.

as avaliações de qualidade.

Um total de 336 amostras de tecido (281 tumores e 55 amostras de tecidos normais) a partir de 282 indivíduos foram inicialmente testados com a plataforma Illumina. Para 54 dos doentes, ambos os tecidos normal e de tumor foram obtidas a partir do mesmo indivíduo (Tabela 1). Para fins de controle de qualidade, 8 amostras foram testadas uma vez adicional e 5 amostras foram testadas mais três vezes (teste para a reprodutibilidade), resultando em um total de amostras de 23 réplicas testadas (total testado = 359). Vinte e cinco controles negativos e corte adicionais também foram utilizados para avaliar a qualidade geral.

Além das avaliações de controle de qualidade de laboratório, qualidade e viés global, foram avaliadas através de várias técnicas de plotagem. Todas as análises foram realizadas no log

2 escala e os resultados são apresentados na escala fold-change. parcelas Box-e-suiça foram utilizados para avaliar as mudanças médias globais na distribuição de miRNA ou de concentração entre as amostras e SAMs. menos de pares contra médios (MVA) parcelas para duas amostras, definida como a diferença por sonda entre as duas amostras (eixo vertical) versus a média por sonda (eixo horizontal) para as duas amostras de [31], foram utilizados para avaliar a concordância entre réplicas técnicas. parcelas MVA residuais para um dado espécime, definidos como a diferença entre o referido espécime e a média de todas as amostras (eixo vertical) versus a média de todas as amostras (eixo horizontal) [32], foram utilizados para avaliar a existência de e forma funcional , por exemplo, vícios (não) da linearidade em função da abundância. Parcelas de análise de componentes principais (PCA) resultados foram utilizados para examinar (dis) similaridade de espécimes para espécimes de controlo negativo e existência de efeitos SAM. Os diagramas de caixa e gráficos de pontos foram utilizados para avaliar a natureza e consistência dos efeitos SAM per-sonda. As taxas de detecção foram avaliados para cada amostra, com detecção de sonda definida como valores de p . 0,01

Com base nestas análises de avaliação de qualidade, um total de 21 das 359 amostras (incluindo algumas repetições) foram removidos de mais estude. Doze foram encontrados para ser mais semelhante na distribuição de expressão a amostras de controlo negativas com base em diagramas de caixa, taxas de detecção e parcelas PCA e um espécime teve um extremamente alta, mas estreita gama de expressão. Um adicional de sete espécimes teve, obviamente, diferentes efeitos de piso e teto em parcelas MVA residuais e agrupados mais perto das amostras de controlo negativo em PCA. Uma amostra adicional foi eliminado, uma vez que era o único em sua classe. Assim, existiam 338 amostras (318 única e 20 repetições) a partir de 268 indivíduos restantes para análise.

pré-processamento.

A distribuição abundância do 735 miRNA e 20 sondas de controlo abrangeram uma vasta gama, com 40% -60% de sondas detectados em amostras que passam a avaliação da qualidade (usando um limiar de valor p de 0,01 detecção). Além disso, não houve

a priori razões para esperar uma distribuição assimétrica de mudanças [16]. Assim, dos 338 espécimes que passam a avaliação inicial de qualidade foram normalizados em conjunto através de normalização quantil [31]. Pós-normalização parcelas MVA residuais mostraram que o preconceito não-linear média foi removido com sucesso. No entanto, os gráficos da PCA resultados demonstraram que um efeito permaneceu SAM. estimativas de contraste e gráficos de pontos revelou que, enquanto não havia quase nenhum efeito SAM para a maioria das sondas, um punhado apresentaram alterações até 2 vezes entre SAMs que foram consistentes em todos os espécimes em cada SAM e não foram impulsionadas por pontos isolados. Isto é, foram observados consistentes interacções SAM-por-sonda. Assim, resíduos de modelos lineares com SAM no modelo de ajuste em uma base per-sonda para QUANTILE dados normalizados foram utilizados como, dados finais normalizados SAM-ajustadas. Estes modelos lineares deu resultados dentro de poeira decimal de métodos empíricos de Bayes uma vez que o tamanho da amostra é grande [33].

parcelas MVA residuais, diagramas de caixa e gráficos de pontos por sonda não mostrou nenhuma tendência ao longo do tempo para a uma amostra servindo como um controlo de corte com o tecido cortado sete vezes ao longo dos dois meses, necessária para processar todas as amostras de tecido. parcelas MVA residuais e de pares mostrou boa concordância geral entre repetições técnicos colocados em diferentes SAMs. O maior efeito SAM observada foi de 2,33 vezes (log diferença

2 escala de 1,22), e apenas um punhado de sondas teve efeitos SAM de 2 vezes. 91,5% (691/755) das sondas tinham SAM efeito estimativas. 1,2 vezes

taxas de detecção Por-sonda juntamente com parcelas de per-sondar desvio padrão (SD) ao longo de todas as amostras normalizadas (n = 338 ) versus expressão média ao longo de todas as amostras normalizadas demonstrado efeitos claros piso e teto na distribuição abundância. A SD limiar per-sonda de ≤0.4 nestes espécimes no log

2 escala foi usada para filtrar as sondas “não informativas” de uma forma agnóstica para grupo [34]. Isto resultou em 123 sondas com taxas de detecção de 0%, 37 sondas saturadas, e 376 sondas meados de abundância com baixa SD sendo filtrados, deixando 199 sondas informativas com um SD . 0,4

A expressão diferencial

modelos de efeitos lineares misturado Por-sonda com declarações de contraste foram utilizados para avaliar a expressão diferencial usando os, dados SAM-ajustados quantílicas normalizados. Assunto foi incluído como um efeito aleatório, a fim de explicar correlação entre várias observações por assunto (repetições técnicas, à natureza emparelhado de todos, mas uma amostra normal). Um efeito SAM foi incluído no modelo para explicar os graus de liberdade usados ​​na remoção por sonda do efeito SAM. As distribuições de p-valores e taxas de descoberta de falsas [35], [36] (calculado com base em resultados do modelo para todas as 735 sondas de miRNA) foram utilizados para dar uma sensação geral de saber se existem verdadeiras diferenças. significado real foi avaliada usando o Bonferroni mais conservadora corrigido p-valores com base em 0,05 /735 = 6,8 × 10

-5 para cada comparação, juntamente com cortes de dobra de mudança para incorporar significado biológico. Seis grupos principais foram comparados: normal, pólipo, pMMR1 (início de idade), pMMR2 (nova do início), dMMR1 (esporádica) e dMMR2 (linha germinal). comparações adicionais incluídos pMMR1 Estágios B, C e D (Fase A com n = 3 foi deixado de fora desta comparação, devido ao pequeno tamanho da amostra), bem como os grupos pMMR1 MSS e MSI-L.

Ajustar variáveis ​​foram incluídas sempre que necessário para evitar uma possível confusão com a histologia. estágio do tumor foi incluída como co-variável em modelos que avaliam diferenças entre os tipos de tumores para ajustar possíveis desequilíbrios de gravidade da doença devido ao palco. Localização no cólon não foi incluída como co-variável em modelos comparando tumores pMMR e dMMR como esta foi considerada como sendo parte da biologia dos tumores. Nenhum co-variáveis ​​foram incluídas em modelos comparando os grupos de pólipos ou normais com outros grupos, já que nem palco nem localização no cólon são relevantes para esses grupos.

Visualização de Dados.

Visualization para a presença de efeitos globais foi realizada por meio de agrupamento não supervisionado e PCA utilizando amostras de tecidos exclusivos apenas (318 de 338 amostras); as repetições técnicas foram excluídos dessas análises. Para amostras com múltiplas repetições técnicos, o espécime replicadas identificada como “1” foi escolhido. PCA foram conduzidas por sonda significa centrado e os dados em escala SD utilizando Partek [37] e a função R prcomp [38]. análises de agrupamento não supervisionado foram realizadas em dados centrada no mediana per-sonda no Partek usando a matriz de dissimilaridade de Pearson para o cálculo das distâncias entre amostras individuais e o método average linkage para o cálculo das distâncias entre dois clusters. Pontos ou espécime rótulos foram coloridas em lotes de informações de agrupamento clínica conhecida

Resultados

Características da amostra

Na sequência da avaliação da qualidade exaustiva dos resultados de perfis de miRNA (ver Métodos), 338. amostras de tecido a partir de 268 pacientes foram utilizados para análises posteriores. amostras normais e tumorais de tecido (não incluindo qualquer uma das repetições técnicos) incluiu 52 mucosa normal do cólon, 41 adenoma tubuloviloso, 158 adenocarcinomas com pMMR selecionados para a fase (3 Fase A, 72 Estágio B, 43 Estágio C e 30 Stage D) e idade de início (148≥50 anos versus 10 50 anos), e 64 adenocarcinomas com dMMR selecionada para ambos esporádica (53 dMMR1) e herdou CC (11 dMMR2), conforme descrito na Tabela 1.

Todos os casos com esporádica dMMR (dMMR1) tiveram

MLH1

inactivação devido à hipermetilação do promotor. O grupo dMMR herdada (dMMR2) foi composta de casos que possuem: (i) uma mutação germinativa conhecida em qualquer

MLH1

(n = 1) ou

MSH2

(n = 3); ou (ii) perda de expressão da proteína de MSH2 (n = 3), MSH6 (n = 2) ou PMS2 (n = 2) por IHC e presume-se que têm uma mutação da linha germinativa nestes genes. Vários casos com dMMR não foram facilmente categorizados (dMMR3) e por causa do número pequeno, estes foram eliminados a partir de uma análise mais aprofundada. Dos 268 pacientes, 119 eram do sexo feminino e 149 do sexo masculino.

diferenças de expressão global miRNA entre cólon normal, adenoma e carcinoma

PCA e de agrupamento hierárquico análises, ambos sem supervisão, foram usados ​​para visualizar miRNA padrões de expressão presentes em um nível global em nosso conjunto de dados de expressão. Em geral, houve uma clara separação entre grupos compostos por, adenoma, pMMR1 e dMMR1 tecidos derivados normais quando examinado por ambos sem supervisão PCA (Figura 1A) e de agrupamento hierárquico (Figura 1B), utilizando o conjunto de 199 sondas “informativo” obtidos como descrito no Métodos. De interesse, no entanto, o agrupamento hierárquica também sugere a presença de duas sub-populações para o grupo dMMR1 de tumores, o que parece ser accionado por um conjunto de miARN (a maioria do cromossoma 14) apresentando uma baixa expressão de um grupo e de elevada expressão em a outra (indicada pela seta na Figura 1B).

(a) a parcela de componentes principais de APC análises. eixo horizontal corresponde ao principal componente 1 (PC1), eixo vertical corresponde a PC2, eixo de profundidade corresponde ao PC3. A percentagem de variação explicada por um computador particular é indicada no rótulo do eixo. Pontos são coloridos por status do grupo com o azul epitélio representando normal, roxo pólipo representando, verde representando pMMR1 e vermelho que representa dMMR1. Duas orientações diferentes são fornecidos. (B) de agrupamento hierárquico não supervisionado de perfis de miRNA usando o conjunto de 199 sondas “informativo” obtidos como descrito em Métodos. As amostras são indicadas ao longo do eixo horizontal e incluem cólon normal, adenomas, carcinomas pMMR1 e carcinomas dMMR1 com membros de grupo indicado pela barra de cores entre o dendograma eo mapa de calor. miARNs são indicados pelo eixo vertical. A barra de cor abaixo indica o nível de expressão.

Os padrões de expressão miRNA globais foram, então, examinados visualmente em vários sub-grupos de tumores pré-definida para determinar se estes podem ser distinguidos. As parcelas PCA para estas análises são mostrados na Figura 2 (dados não mostrados para as análises de agrupamento hierárquico). Dentro do grupo pMMR1 de tumores, não houve diferenças discerníveis aparentes com base no palco, quer em todas as três fases ou entre quaisquer duas fases (Fase A não incluídas devido a pequenos números), ou com base no sexo. Além disso, nenhuma separação dos grupos era visível entre os tumores com uma idade mais avançada de início (≥50 y /o, pMMR1) e aqueles com uma idade mais jovem de início ( 50 y /o, pMMR2). Uma análise de tumores dentro de cada um dos dois subtipos dMMR, dMMR1 (somática) versus dMMR2 (linha germinal), também não mostraram diferenças discerníveis.

de eixo horizontal corresponde a um componente principal (PC1), eixo vertical corresponde à PC2 e eixo de profundidade corresponde a PC3. Pontos são coloridos por status do grupo. A percentagem de variação explicada por um computador particular é indicada no rótulo do eixo. (A) pMMR1 avaliadas pela fase Dukes; (B) a avaliação pela idade de início (pMMR1 – antigo e pMMR2 – jovem). (C) a avaliação de 2 agrupamentos de casos dMMR (dMMR1 – epigenética silenciados MLH1 e dMMR2 – germinal); (D) os grupos pMMR1 MSI-L e tumores MSS. Cores para cada um dos grupos que estão sendo comparados são mostrados na caixa de legenda superior direito.

Como os tumores são geralmente classificadas pelo seu estatuto MSI (MSS, MSI-L e MSI-H), estes três grupos foram ainda examinadas as diferenças de expressão em conjunto, em seguida, sistematicamente em pares. Como esperado, o grupo MSI-H (definida como dMMR) agrupadas em separado de ambos os grupos MSS MSI-L e (ambas definidas como pMMR). No entanto, a grupos de MSS MSI-L e não mostraram diferenças discerníveis (Figura 2).

A expressão diferencial entre cólon normal, adenoma e carcinoma

Realizamos comparações estatísticas com base em grupos em um probe- by-sonda base usando modelos lineares para diversas análises pré-definidas em um esforço para identificar os miRNAs diferencialmente expressos estatisticamente significativos. No geral, altamente foram observadas diferenças significativas entre os vários grupos de miRNAs específicos usando um Bonferroni corrigido limiar de valor-p para significância (6,8 × 10

-5). A Tabela 2 fornece uma contagem dos miRNAs demonstrando expressão significativa dobre mudanças em cortes variados (≥2.0 e ≥4.0). A Tabela 3 mostra os nove miARNs expressos diferencialmente estatisticamente significativas a maior mudança de dobragem (dobra mudança de ≥4), enquanto que a Figura S1 mostra os gráficos de pontos para cada um deles entre os vários subgrupos de tecido.

a alteração no nível de expressão que ocorre na posição normal de adenoma a sequência de carcinoma para cada um dos nove miARN pode ser claramente visto na Figura S1. Cinco dos nove mostrar mudanças consistentes em todos os grupos comparados ao normal, com miR-135b e miR-31-regulada e miR-1, miR-137 e miR-9 regulada para baixo em todas as amostras. HS_29 é regulado para cima em todos os carcinomas mas não nos pólipos, miR-552 e miR592 são up-regulada nos pólipos e tumores pMMR mas não os tumores dMMR e, finalmente, miR99a é regulada em pólipos com níveis intermediários em ambos os grupos de tumores e pMMR dMMR.

Usando o limiar de Bonferroni P-valor, juntamente com uma mudança vezes no nível de expressão ≥2, um total de 54 miARNs foram identificados entre as várias comparações (Tabela 2, Tabela S1). Trinta e um miRNA foram diferencialmente expressos entre o tecido do cólon normal e adenomas. Uma comparação do tecido do cólon normal os dois principais grupos de carcinoma (pMMR1 e dMMR1) identificou 31 e 28 miRNAs significativas, respectivamente, utilizando estes critérios. Finalmente, foram identificados 6 e 11 miARNs significativas quando adenomas foram comparados com os dois grupos de carcinoma. O mapa de calor, mostrada na Figura 3, ilustra as diferenças de expressão relativa destes miARNs entre os grupos em estudo.

As amostras são indicados ao longo do eixo horizontal e incluem normal do cólon, adenoma, carcinoma pMMR (1 e 2 combinados ) e carcinomas dMMR (1 e 2 combinado) com membros de grupo indicado pela barra de cores entre o dendograma eo mapa de calor. miARNs são indicados pelo eixo vertical. A barra de cor abaixo indica o nível de expressão.

De interesse, a maioria (23 dos 31) de miRNAs que foram diferencialmente expressos entre o normal eo adenoma com as mudanças vezes de ≥2 também foram diferencialmente expressos em a comparação do normal para ambos os grupos de tecidos e pMMR dMMR, por exemplo miR-135b e miR-31 (Tabela S1). Além disso, os níveis e direção das mudanças em relação ao normal para a maioria destes eram consistentes entre adenoma e carcinoma. Em adição às semelhanças observadas para os grupos de adenoma e carcinoma, no entanto, as diferenças de expressão foram também identificados. Dos 43 miARNs que foram diferencialmente expressos significativamente com as alterações de dobragem de ≥2 nos dois grupos de tumor, 20 não cumpram estes critérios do grupo de pólipo (por exemplo, o miR-375, miR-147, etc.), embora várias outras miARNs tinham níveis significativas mas mais pequenas de diferença de expressão no grupo pólipo (por exemplo, o miR-188-5p, miR-210) (Tabela S1). Quando os grupos de tumor foram comparados directamente para o grupo de pólipo, foram identificados 20 miARNs; 9-regulados (por exemplo, miR-483-3p, miR34b) e 11 regulada para baixo (por exemplo, miR-552, miR-592).

Apesar de PCA e análise de cluster foi capaz de separar o pMMR1 e dMMR1 subgrupos (Figura 1), foram surpreendentemente poucos miARNs que foram significativamente diferencialmente expressos entre os dois grupos (Tabela 2 e Tabela S1). Apenas quatro miRNAs (miR-31, miR-224, miR-552, miR-592,) foram encontrados em uma mudança de 2 vezes ou mais. Como observado para as comparações adenoma, a maioria dos miARNs que foram diferencialmente expressos entre o tecido do cólon normal e o grupo pMMR1 com mudanças de dobragem ≥2 também foram expressas diferencialmente no comparador de tecido do cólon normal ao grupo dMMR1 tecido. Mais uma vez, os níveis e direção dessas mudanças relativas ao normal para a maioria destes miRNAs foram consistentes entre estas duas comparações (Tabela S1).

Uma série de comparações pré-planejadas adicionais mostraram diferenças mínimas entre subgrupos específicos.