Abstract

ativação anormal do Sonic hedgehog (SHH) via tem sido descrito em uma grande variedade de cancros humanos e em células-tronco cancerosas (CSCs), no entanto, o papel do SHH percurso em CSCs gástrica tem não foram relatadas. Neste estudo, investigou-se a possibilidade de que a activação anormal da via SHH mantidas as características de CSCs gástricas. Primeiro, identificamos câncer de células estaminais-like (CSLCs) das linhas humanas gástricas celulares de cancro (HGC-27, MGC-803 e MKN-45) usando tumorsphere cultura. Em comparação com células aderentes, as células tumorsphere flutuantes tinha mais capacidade de auto-renovação e chemoresistance. As células que expressam marcadores CSCs (CD44, CD24 e CD133) foram também significativamente mais em tumorsphere células do que em células aderentes. Mais importante ainda, os estudos in vivo mostraram que os tumores de xenoenxerto pode ser gerado com 2 × 10

4 tumorsphere células, o que era 100 vezes menos do que as necessárias para os tumores de contaminação por células aderentes. Em seguida, RT-PCR e transferência de Western demonstrou que os níveis de Ptch e Gli1 (genes-alvo via SHH) expressão foram significativamente maiores no tumorsphere células do que em células aderentes. Os resultados de quantitativa PCR em tempo real foram semelhantes aos de RT-PCR e transferência de Western. Uma análise mais aprofundada revelou que via SHH bloqueado por cyclopamine ou 5E1 causou uma redução maior na capacidade de auto-renovação do HGC-27 tumorsphere células do que a de células aderentes. Nós também descobrimos que via SHH bloqueando fortemente reforçada a eficácia dos medicamentos quimioterápicos no HGC-27 tumorsphere células in vitro e in vivo, mas não teve efeito significativo em células aderentes. Finalmente, foram isoladas as tumorspheres da amostra de cancro gástrico, essas células também teve chemoresistance ea capacidade tumorigénica, e SHH percurso manteve as características CSLCs gástricos de tumorsphere células de amostras de tumores primários. Em conclusão, nossos dados sugerem que SHH percurso era essencial para a manutenção da CSLCs no cancro gástrico humano

Citation:. Canção Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) o Sonic Hedgehog via é essencial para a manutenção de células estaminais-como o câncer no câncer gástrico humano. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10.1371 /journal.pone.0017687

editor: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de novembro de 2010; Aceito: 10 de fevereiro de 2011; Publicação: 04 de março de 2011

Direitos de autor: © 2011 Song et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de alta Tecnologia de Pesquisa e Desenvolvimento da China (# 2006AA402A04, # 2006AA02A107), o Programa Estadual major Pesquisa básica da China (# 2009CB521704), eo National Nature Science Foundation da China (# 30.872.468, # 30873031). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

CSCs desempenham um papel importante no desenvolvimento do cancro, esta subpopulação dentro do tumor possui as características de capacidade de auto-renovação, quimiorresistência e a capacidade tumorigénica, assim, podem desempenhar um papel crucial na iniciação, progressão e recorrência de cancro. Examinar e manipular as vias bioquímicas envolvidas nessas características é uma das melhores formas de contribuir para os CSCs, levando ao desenvolvimento de novos medicamentos e os procedimentos de tratamento. via SHH desempenha um papel crítico em diversos CSCs, tais como células estaminais glioblastoma [1], [2], células CD34 + de leucemia [3], [4] e CSCs de mama [5], Além disso, é essencial para o desenvolvimento e homeostase da glândula gástrica [6], a activação anormal da via SHH pode resultar em cancro gástrico [7], [8], no entanto, o papel da via de SHH em CSCs gástrica não é clara.

na via de SHH células de mamífero é mediada por ligandos Shh [9]. Na ausência de Shh, o receptor transmembranar patched (Ptch) inibe a actividade de outra proteína transmembranar, smoothened (SMO), resultando na inactivação da via de SHH [9], [10]. A ligação de Shh para Ptch anula o efeito inibitório de Ptch e Smo é desreprimida, activando deste modo factor de transcrição Gli (Gli1, Gli2 e Gli3) [9], [10]. Gli1 é um forte activador positivo de genes alvo a jusante e é ela própria um alvo transcricional de SHH via [11]. Portanto, Gli1 é considerado um marcador de activação anormal SHH via de [10], [12]

Recentemente, vários tipos de CSCs ou CSLCs foram identificados e isolados a partir de tumores malignos [13] -. [25]. No cancro gástrico, metodológico, que é difícil de isolar e amplificar CSCs partir de linhas celulares ou amostras de tecido de tumor. No presente momento, CD44 parece ser o marcador mais útil para a purificação em perspectiva de CSCs gástricas, no entanto, não é altamente específica para os CSCs gástricas [26].

Neste estudo, foi isolado a partir de CSLCs gástrico humano linhas celulares de cancro (HGC-27, MGC-803 e MKN-45) usando tumorsphere cultura em meio isento de soro e identificada a capacidade de auto-renovação, quimiorresistência e a capacidade tumorigénica de células tumorsphere; Em seguida, examinámos a expressão de Shh moléculas relacionadas às vias, incluindo Shh, Ptch, Smo, Gli1 Gli2 e em tumorsphere células e as células aderentes, especialmente a expressão de Ptch e Gli1.Then, que bloqueado por via SHH ciclopamina tomatina ou controlo, 5E1 ou controlo de PBS para investigar se as características de CSLCs em tumorsphere células foram mantidas pela activação anormal da via SHH. Finalmente, utilizou amostras de câncer gástrico primários para analisar os aspectos funcionais do SHH percurso em CSLCs gástricas.

ciclopamina é um alcalóide esteroidal de células-permeável. Que perturba o colesterol bio-síntese e antagoniza especificamente via de sinalização SHH através da interação direta com Smo (alisado), um parente distante de receptores acoplados à proteína G. É uma ferramenta valiosa para estudar o envolvimento da sinalização SHH no desenvolvimento de vários tumores. Tomatina é um alcalóide esteroidal que estruturalmente se assemelha cyclopamine, mas não tem a capacidade de inibir a sinalização de SHH. Ele pode ser usado como um controlo negativo. 5E1 é um anticorpo monoclonal anti-HH, que neutraliza a actividade SHH e IHH.

Resultados

1. células Tumorsphere possuía as características de CSLCs

Nós crescemos HGC-27, MGC-803 e MKN-45 células aderentes em meio isento de soro descrito na secção de métodos. Após 7 dias, foram observadas tumorspheres consistindo de aproximadamente 50 a 100 células (fig. 1A).

(A) Tumorspheres formado depois de 14 dias. (B) A capacidade de formação de sub-tumorspheres tumorsphere células (barras brancas) e células aderentes (barras pretas). * = P 0,05. Bares = 1000μm. (C) A capacidade de formação de colónias de células tumorsphere (barras brancas) e células aderentes (barras a preto) sob condições independente de ancoragem por ensaios de agar mole. * = P 0,05. (D) Efeito de 48 horas de exposição de células tumorsphere (barras brancas) e células aderentes (barras pretas) para 1,000 uM fármaco quimioterapêutico. Ox = oxaliplatina, Mi = mitomysin. * = P . 0,05

A capacidade de auto-renovação desses tumorspheres foi avaliada por dissociar-los em uma única célula e crescendo a uma densidade clonal de 1.000 células por mililitro. Após 2 semanas, uma única célula derivada de HGC-27 tumorsphere células geradas sub-tumorspheres em 41,83% ± 3,13% em comparação com 8,17% ± 2,40% das células aderentes, por outro lado, em MGC-803 e MKN-45, a formação de sub-tumorspheres taxa de tumorsphere células foram também mais elevados do que a de células aderentes. (Fig. 1B). Estes dados sugerem que a capacidade de auto-renovação de células tumorsphere foi significativamente maior do que a de células aderentes. células Tumorsphere também mostrou um aumento da capacidade de formar colônias em condições independente de ancoragem em um ensaio em agar mole padrão após 14 dias no HGC-27 e MKN-45 (Fig. 1C).

Também foi realizada uma diluição limitante ensaio para a formação de esferóides utilizando HGC-27 e células tumorsphere células aderentes, respectivamente. Como mostrado na Tabela S1, cerca de 27-35% de células tumorsphere poderia produzir esferóides, enquanto que menos de 5% de células aderentes pode gerar esferóides, após 3 semanas de cultura. Portanto, nos tumorsphere células HGC-27, podemos estimar que os esferóides formadoras população de células composto por um máximo de 35%.

chemoresistance é outra característica de CSCs, então nós investigamos se uma diferença de chemoresistance existia entre tumorsphere células e as células aderentes. Os resultados mostraram que, após 48 horas, as células tumorsphere demonstraram significativamente maior resistência a drogas em comparação com as células aderentes nas mesmas condições (Fig. 1D). Foram também avaliadas quimiorresistência de HGC-27 tumorsphere células aderentes e células a diferentes concentrações de drogas, no entanto, ambas as células tumorsphere e células aderentes não mostraram significativamente quimiorresistência de medicamentos de uma forma dependente da dose (Fig. S1).

em seguida, examinámos a expressão de CD44 em células tumorsphere dissociadas e as células aderentes utilizando um ensaio de imunofluorescência e western blot. Os resultados mostraram que as células que expressam CD44 eram significativamente mais em tumorsphere células do que em células aderentes (Fig. 2a). Além disso, a expressão de outros CSCs marcadores (CD24 e CD133) em tumorsphere células e as células aderentes foi analisada por Western blot, em comparação com tumorsphere células, a expressão de CD24 foi significativamente menor em células aderentes, enquanto a expressão de CD133 foi semelhante (Fig . 2B). Além disso, nós fraccionado HGC-27 de células por separação por FACS para CD44, descobrimos que fracção de células CD44 (+) poderia gerar mais colónias esferóides em comparação com CD44 (-) fracção de célula, além disso, o tamanho das colónias de esferóide a partir de CD44 (+) células era maior do que os de CD44 (-). células (Fig. 2C)

(A) imunofluorescência (painel esquerdo) e western blot (painel da direita) análise do CD44 (cor verde) em células tumorsphere mecanicamente dissociadas e células aderentes. Os núcleos foram contrastadas por DAPI (cor azul). TCs células = tumorsphere, a ACS = células aderentes. Barras = 100 um. (B) A expressão de CD24 e CD133 no tumorsphere células e as células aderentes por Western blotting, β-actina foi fornecida como um controlo. (C) A capacidade de formação de tumorspheres HGC-27 CD44 (+) CD44 e células – células (). * = P 0,05. Bares = 1000μm.

2. células Tumorsphere poderia gerar tumores sobre xenotransplante

Para os estudos de xenotransplante, número igual (2 × 10

4, 2 × 10

5, 2 × 10

6, 2 × 10

7) de recém-dissociado tumorsphere células aderentes ou células de controlo foi injectado SC em cada rato (seis ratos por grupo). Os resultados mostraram que os tumores foram gerados com 2 × 10

4 tumorsphere células, o que era 100 vezes menos do que as necessárias para a propagação do tumor por células aderentes (Tabela 1). Além disso, as células tumorsphere gerado tumores subcutâneos com maior volume e tempo mais curto em comparação com os que são gerados a partir de células aderentes (Fig. 3A, B). Assim, a injecção subcutânea de baixo número de células tumorsphere confirmou que as células mantidas esferóides capacidade mais forte tumorigénico em ratinhos nus de células aderentes.

(A) o crescimento de tumores subcutâneos em ratinhos nus após a injecção de 27 HGC-tumorsphere células ( 2 × 10

5) no flanco traseiro esquerdo de cada rato e o mesmo número de células aderentes no flanco traseiro direito de cada ratinho. (B) O tamanho do tumor subcutâneo após a injecção de 2 × 10

5 HGC-27 tumorsphere células, 2 × 10

5 HGC-27 células aderentes e 2 × 10

6 HGC-27 células aderentes. (C) H E análise de coloração de xenotransplantes derivados de HGC-27 tumorsphere células. Barra = 100 um. (D) Tumorspheres derivado de xenoenxertos. Barra = 1,000 uM. (E) o crescimento do tumor subcutâneo em ratinhos nus após a injecção de células tumorsphere (2 × 10

5) derivado de xenoenxertos

H . E exame de xenotransplantes derivados de HGC-27 células tumorsphere mostrou que estes tumores se assemelhava muito o tumor humano original, principalmente contendo células diferenciadas (Fig. 3C). Importante, tumorspheres poderia ser re-derivados dos tumores xenotransplantadas (Fig. 3D), e que poderia formar de novo tumor (Fig. 3E). Esses dados, portanto, indicam que as células tumorsphere representada CSLCs que tinham capacidade tumorigénica.

3. via SHH foi expressa superior em tumorsphere células do que em células aderentes

Para investigar a ligação entre a via SHH e CSLCs características de tumorsphere células, examinamos primeiro a expressão mRNAs de Shh moléculas relacionadas às vias, incluindo Shh, Ptch, Smo, Gli1 Gli2 e por RT-PCR. Os resultados mostraram que todos os ARNm foram alta expresso em HGC-27 tumorsphere células. Comparado com tumorsphere células, os níveis de Shh, Ptch, Smo e Gli1 expressão foram significativamente mais baixos em células aderentes, enquanto que os níveis de expressão foram semelhantes Gli2 para tumorsphere células. No MGC-803 e MKN-45, os níveis de Shh, Ptch e Gli1 expressão também foram significativamente mais baixos em células aderentes que em tumorsphere células, enquanto que os níveis de Smo e Gli2 expressão teve nenhuma diferença significativa entre as células aderentes e tumorsphere células (Fig . 4A).

(A) A expressão de ARNm de Shh, Ptch, Smo, Gli1 Gli2 e em tumorsphere células e as células aderentes foram analisados ​​por RT-PCR. A expressão de GAPDH foi usada como um controlo. (B) A expressão de proteínas de genes alvo via SHH (Ptch e GLI1) foi analisada por Western blotting, β-actina foi fornecida como um controlo. TCs células = tumorsphere, a ACS = células aderentes. analisa (C) quantitativo em tempo real de RT-PCR dos genes alvo via SHH (Ptch e GLI1) mostraram os mesmos resultados do semi-quantitativa por RT-PCR. Os resultados foram calculados como significava + D.P. valores a partir de medições em triplicado de três experiências separadas. células TCs = Tumorsphere, a ACS = células aderentes.

Em SHH percurso, Ptch e Gli1 são genes-alvo, eles são considerados como importantes marcadores de ativação anormal via SHH. Então, examinamos ainda mais os níveis de expressão de Ptch e Gli1 por Western blot e quantitativa PCR em tempo real.

Ao usar o Western Blot, descobrimos que os níveis de Ptch e Gli1 expressão também foram maiores no tumorsphere células do que em células aderentes (Fig. 4B). A seguir avaliou os níveis de Ptch e Gli1 expressão em xenoenxertos de HGC-27 por quantitativa PCR em tempo real. As análises quantitativas-PCR em tempo real dos genes alvo (SHH PTCH e GLI1) mostraram os mesmos resultados acima de semi-quantitativo de RT-PCR (Fig. 4C).

4. via SHH bloqueio reduziu a capacidade de auto-renovação e chemoresistance de HGC-27 tumorsphere células

Para testar para um possível papel do SHH percurso na capacidade de auto-renovação das células tumorsphere, usamos cyclopamine ou controlo tomatina, 5E1 ou controlo PBS para bloquear a via.

os resultados mostraram que o tratamento ciclopamina levou a uma redução significativa na capacidade para a formação de sub-tumorspheres em 27 HGC-tumorsphere células de uma forma dependente da dose, mas tal efeito foi observada em células aderentes (Fig. 5a). Nós ainda avaliada se o tratamento com cyclopamine afetaria a capacidade de formação de colónias de HGC-27 células tumorsphere pelo ensaio de crescimento independente de ancoragem. Do mesmo modo, a capacidade para formar colónias foi reduzido mais nas células tumorsphere de uma forma dependente da dose em relação às células aderentes (Fig. 5B).

(A) A capacidade de formação de sub-tumorspheres de HGC-27 células tumorsphere e células aderentes tratados com diferentes concentrações de cyclopamine ou controlo tomatina (círculo aberto = cyclopamine; círculo fechado = controle tomatina). linhas pretas são células tumorsphere, vermelho são células aderentes. * = P 0,05. células TCs = tumorsphere. Bares = 1000μm. (B) O colônias formação de HGC-27 tumorsphere células e células aderentes tratados com diferentes concentrações de cyclopamine ou controlo tomatina em condições independente de ancoragem (círculo aberto = cyclopamine; círculo fechado = controle tomatina). linhas pretas são células tumorsphere, vermelho são células aderentes. * = P 0,05. células TCs = tumorsphere. (C) Percentagem de viabilidade celular foi analisada em HGC-27 tumorsphere células e células aderentes (D) após a exposição a diferentes concentrações de ciclopamina ou 5 uM ciclopamina com diferentes drogas durante 48 horas. grupo de controle é tomatina. Cyc = cyclopamine, Ox = oxaliplatina, Mi = mitomysin. * = P . 0,05

Em seguida, investigamos o efeito de SHH percurso em chemoresistance de HGC 27 tumorsphere células, nós tratamos as células dissociadas com cyclopamine ou tomatina controle por 48 horas e, em seguida drogas foi avaliada a resistência de células tumorsphere. Quando ciclopamina foi seguido por drogas, o tratamento resultou numa taxa de morte celular global significativamente melhorada. Os melhores resultados foram obtidos quando foi combinado com ciclopamina oxaliplatina mais Mitomicina (Fig. 5C). Não se observou qualquer efeito sinergético em tais células aderentes após a exposição à droga com ciclopamina durante 48 horas (Fig. 5D).

também ensaiado o efeito de diferentes concentrações de ciclopamina (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) em morte celular. Os resultados mostraram que ciclopamina sozinho para células tumorsphere poderia fazer uma pequena mas consistente diminuição do número de células viáveis. Comparado com HGC 27 tumorsphere células, o efeito da ciclopamina na morte celular para células aderentes foi mais significativa (Fig. 5C, D).

Quando SHH via foi bloqueada por 5E1 ou controlo de PBS, os resultados de auto capacidade -renewing e quimiorresistência de tumorsphere células e as células aderentes foram semelhantes aos bloqueados pelo ciclopamina tomatina ou de controlo (Fig. S2).

5. via SHH bloqueando a resposta do tumor reforçada a drogas in vivo

Para testar esta hipótese in vivo, analisamos se via SHH bloqueio reforçada a eficácia da quimioterapia, cyclopamine ou controlo tomatina foi usado para inibir as respostas da via SHH. HGC-27 tumorsphere células foram deixadas a crescer em ambos os flancos traseiros de ratinhos nus até que o diâmetro maior do tumor atingiu cerca de 2 mm. Os ratinhos foram então tratados duas vezes por semana durante 3 semanas com ciclopamina ou controlo tomatina 24 horas antes do parto oxaliplatina. Em todos os ratinhos tratados, os tumores tratados com oxaliplatina foram significativamente menores do que os não tratados com oxaliplatina. Além disso, os tumores apresentaram significativamente maior inibição do crescimento tumoral, quando foram tratados com oxaliplatina em combinação com ciclopamina, a resposta do tumor à droga quimioterapêutica foi reforçada por ciclopamina (Fig. 6A, B). Investigou-se também se via SHH bloqueada por 5E1 ou controlo de PBS eficácia melhorada quimioterapia, in vivo, os resultados mostraram que 10 ug de tratamento /ml 5E1 conduziu a uma inibição do crescimento do tumor significativamente maior do que aqueles tratados apenas com oxaliplatina (Fig. 6A, B).

(a) tumores subcutâneos derivados de 2 × 10

5 HGC-27 tumorsphere células cultivadas em ratos sem pêlo de 4 semanas depois de IP tratamento com PBS ou oxaliplatina em combinação com 10