Abstract

Desmogleína 3 (Dsg3) é um componente do desmosome, que confere adesão célula-célula forte. Anteriormente, uma função oncogénica de Dsg3 foi encontrado em câncer de cabeça pescoço (CCP). Aqui, nós investigamos como esta molécula contribui para o fenótipo maligno. Porque Dsg3 está associada com placoglobina, nós examinamos se a estas alterações fenotípicas eram mediados através da molécula placoglobina. A imunoprecipitação e imunofluorescência revelou que Dsg3 silenciamento interrompido sua interacção com placoglobina e placoglobina induzida translocação desde o citoplasma para o núcleo. Knockdown de Dsg3 aumentou significativamente a interacção de placoglobina com o factor de transcrição TCF e suprimiu o TCF /LEF actividade transcricional. Estes efeitos conferidos ainda mais a redução da expressão de genes alvo a jusante TCF /LEF, incluindo c-myc, ciclina D1, e a MMP-7. análises funcionais mostrou que Dsg3 silenciamento reduziu o crescimento celular e células na fase G0 /G1 preso. Além disso, a capacidade de migração celular e invasão também tiveram uma diminuição. Estes resultados foram confirmados celulares utilizando xenoenxertos de tumores em ratinhos, como Dsg3 silenciamento levou ao crescimento do tumor suprimido, placoglobina translocação e redução da expressão de genes alvo TCF /LEF em tumores. Portanto, nosso estudo mostra que o Dsg3 proteína desmossomal adicionalmente funções de regular fenótipos malignas via de sinalização nuclear. Em conclusão, verificou-se que as funções Dsg3 como um oncogene e facilita o crescimento do câncer e invasão em células HNC através da via Dsg3-placoglobina-TCF /LEF

Citation:. Chen YJ, Lee LY, Chao YK, Chang JT , Lu YC, IC Li, et ai. (2013) Dsg3 facilita o crescimento de células cancerosas e invasão através do Dsg3-placoglobina-TCF /LEF-Myc /ciclina D1 /MMP via de sinalização. PLoS ONE 8 (5): e64088. doi: 10.1371 /journal.pone.0064088

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de dezembro de 2012; Aceito: 10 de abril de 2013; Publicado em: 30 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações de Chang Gung Memorial Hospital (números de subvenção CMRPD1A0641 e CMRPD190391-2) e do Departamento de Saúde de Taiwan (número de concessão DOH99-TD-C-111-006). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

3 Desmogleína (Dsg3) é um dos componentes do desmossoma. Desmososmas pontos são semelhantes a botões de contacto intercelular que permitem a fixação de elementos do citoesqueleto para a membrana plasmática em locais de célula-célula. Ao ancorar a filamentos intermediários portadores de estresse, desmosomes fornecem forte adesão intercelular para manter a integridade dos tecidos e homeostase [1] – [3]. Desmososmas são compostas de proteínas a partir de pelo menos três famílias de genes distintos: caderinas (por exemplo, DSG1-4 e DSC1-3), proteínas do tatu (por exemplo, placoglobina e vários Placofilinas), e Plaquinas (por exemplo, desmoplakins, envoplakin, e periplaquina). Estas proteínas desmossômicas são coordenados e associados um ao outro para formar o desmossoma. O andaime supracellular resultante desempenha um papel chave no fornecimento de integridade mecânica para os tecidos [1] – [3]. Em adição ao seu papel na adesão célula-célula, as proteínas de caderina e tatu transdutores podem funcionar como moleculares para converter um acontecimento extracelular em sinais intracelulares [4]. Por exemplo, a cauda de Dsg3 foi mostrado ligado placoglobina [1] – [3]. Placoglobina está intimamente relacionada com a p-catenina, que é uma molécula efectora a jusante bem conhecida na via de sinalização Wnt canónica [5]. Portanto, é possível que Dsg3 podem transduzir mensagens molecular, através da via de sinalização placoglobina.

Vários relatórios têm encontrado que as proteínas desmossômicas são anormalmente expressos em vários cancros. Enquanto alguns investigadores relataram que a expressão de proteínas desmossômicas é diminuída em cancros, outros descobriram que a expressão é aumentada. Por exemplo, tem sido relatado regulada negativamente de DSC2 em cancro colo-rectal [6], em DSC3 da mama e cancro da cavidade oral [7], [8], e cancro gástrico DSG2 em [9], [10]. No entanto, a sobre-expressão de DSG2 ou Dsg3 também tem sido demonstrado em vários cancros, incluindo a pele, da próstata, do pulmão e cancro da cabeça-pescoço [11] – [14]. Todos estes estudos indicam que a desregulação de proteínas desmossômicas desempenha um papel durante a carcinogénese. Consistente com outros relatórios, temos encontrado previamente que as funções Dsg3 como um oncogene no cancro da cabeça e pescoço e está associada com a fase clínica avançada [15]. Neste estudo, foram investigados mais como esta molécula contribui para a formação de cancro. Os nossos resultados mostraram que Dsg3 promove o crescimento de células de cancro e invasão por meio de uma via de sinalização mediada por placoglobina. Estes efeitos resultou em alteração do TCF /LEF actividade transcricional alterada e, assim, as expressões de moléculas a jusante, incluindo c-myc, ciclina D1, e MMP-7, o que pode levar a fenótipos malignas.

Materiais e Métodos

As linhas celulares, construção shRNA e transfecção celular

Duas linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço, OECM1 e SAS [16], foram utilizados. As células OECM1 foram mantidas em RPMI 1640, e as células foram cultivadas em SAS modificação meio de Eagle da Dulbecco. Todos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e antibióticos (penicilina 100 U /mL, 100 U /mL de estreptomicina, e 0,25 g /ml de anfotericina B), e linhas de células foram cultivadas numa atmosfera humidificada a 37 ° C com 5% de CO

2.

O shRNA sequência de direccionamento Dsg3 (shDSG3), que foi previamente descrito [15], foi subclonado num plasmídeo pCI-neo e utilizado para estabelecer as células estavelmente transfectadas shDSG3 . Placoglobina alvo shRNA foi concebido como um sensor 22 nt anti-sentido e de gancho de cabelo que era complementar à sequência de ARNm placoglobina 5′-GGA CCA TGC GCG CCA CGT AGC T-3 ‘e foi clonado no vector plasmídeo pTOPO-U6, como anteriormente descrito [15].

para a transfecção do plasmídeo, as células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

5 em uma placa de 100 mm e cultivadas durante 16 horas. Quando as células atingiram 60% de confluência, elas foram transfectadas com 6 ug do plasmídeo shRNA ou o plasmídeo vector vazio utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) em reduzido OPTI-MEM meio de soro (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após 16 horas, o meio Opti-MEM foi substituído com meio completo fresco. Os clones celulares transfectadas estáveis ​​foram selecionados usando um reagente de neomicina, solução de antibiótico G418 (Sigma, St Louis, MO, EUA).

Pacientes e determinação da expressão de proteínas em tecidos clínicos

O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. Foram obtidos nove tecidos de biópsia de pacientes com câncer de cabeça-pescoço visitados nas clínicas de cirurgia cabeça-pescoço no Chang Gung Memorial Hospital (Taoyuan, Taiwan), incluindo quatro amostras de mucosa e cinco câncer grosseiramente normais. proteínas teciduais foram extraídos e submetidos a uma análise de imunotransferência para a determinação de Dsg3, placoglobina, c-myc, ciclina D1, e MMP-7, como descrito abaixo.

extracção de proteína celular, imunoprecipitação e análise de imunotransferência

Os métodos de extracção de proteína, imunoprecipitação e imunotransf erência foram realizadas de forma semelhante como descrito anteriormente [17], [18]. Resumidamente, as células foram homogeneizadas em tampão de lise de CHAPS, incubadas em gelo durante 30 minutos, e centrifugou-se para obter as proteínas celulares. Para o fraccionamento das proteínas nucleares, foram usados ​​os reagentes de extracção commencial NE-PER nucleares e citoplasmáticos (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Para preparar os grânulos de imunoprecipitação, 30 ul de proteína A /esferas de proteína G-Sepharose foram conjugados com 4 ug de anticorpos específicos (clone 5H10 para Dsg3, H80 clone para placoglobina, H125 clone para TCF4, Santa Cruz Biotech, CA). Para imunoprecipitação, 1 mg do extracto de proteína celular foi incubado com 30 ul de proteína A /G proteína específica grânulos durante 4 horas a 4 ° C. As esferas foram recolhidas por centrifugação, ressuspensas num tampão de amostra e sujeito a análise de imunotransferência. IgG de ratinho não imunizado ou soro de coelho foram utilizados como um controlo negativo para determinar o efeito específico de imunoprecipitação.

Para a análise de imunotransferência, 30 ^ g de proteína celular foi separada através de electroforese em gel de 8% SDS-poliacrilamida e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi hibridada com um dos seguintes anticorpos primários: clone 5H10 para Dsg3, H1 clone para placoglobina, clone M-20 para ciclina D1, 9E10 clone de c-myc (Santa Cruz Biotech, CA), ou MAB3315 clone para MMP- 7 (Millipore, MA). A membrana foi subsequentemente incubada com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Santa Cruz Biotech, CA). A imagem proteína foi desenvolvido usando um Kit de Renaissance Western Blot Reagente de Quimioluminescência (NEN Life Science Products, MA) e autorradiografia. A densidade de cada banda de proteína foi determinada após a normalização para uma banda de controlo de actina utilizando Gel Sistema de imagem e software Image J. (Scion Corporation, MD).

O crescimento celular, formação de colónias, e citometria de fluxo análise

os ensaios de crescimento e de formação de colónias foram realizados como previamente descrito [19], [20] as células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

5 em placas de 100 mm, e a extensão do crescimento celular foi determinada usando diariamente um hemocitômetro. Para a análise de formação de colónias, num total de 1000 células foram semeadas em placas de 6 poços e deixou-se crescer sem ser movido durante 7 dias em meio de cultura completo contendo 20% de FBS. O número de colónias de células foi contado após coloração com violeta de cristal a 5% durante 15 min.

citometria de fluxo foi realizada como previamente descrito [21]. Resumidamente, após a sincronização das células na fase G0 /G1 por privação de soro, as células foram subsequentemente colhidas em diferentes pontos de tempo (intervalo de 6 horas por células OECM1 e um intervalo de três horas para células SAS). Os sedimentos de células foram fixadas com etanol, permeabilizadas com Triton X-100 e de RNase, e em seguida, incubadas com iodeto de propídio (PI) para a coloração nuclear. As amostras foram imediatamente analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). A distribuição das fases do ciclo celular foi determinada utilizando o Cell Quest Software Pro eo ModiFit. Duas experiências independentes foram realizados para cada conjunto de dados.

A migração celular e ensaios de invasão

A migração celular e ensaios de invasão foram realizados como previamente descrito [19]. Resumidamente, os ensaios de migração de células foram realizados utilizando câmaras de policarbonato Transwell (Becton Dickinson Biosciences). As células foram semeadas numa placa de 6 poços com inserções Transwell que tinham uma membrana de policarbonato porosa (8 um de tamanho) e incubadas em meio regulares. Após 24 horas, as células que tinham migrado para o lado de baixo das inserções Transwell foram fixadas com glutaraldeido, coradas com violeta de cristal, e fotografados.

O ensaio de invasão de células foi realizada utilizando as câmaras de invasão de Matrigel BioCoat BD (Becton Dickinson Biosciences, Bedford, MA) e a câmara de invasão Millicell (Millipore Corporation, Bedford, MA). A membrana do inserto Millicell câmara superior, que tem um tamanho de poro de 8 um, foi colocado numa placa de 24 cavidades e revestidas com Matrigel. As células foram semeadas em câmaras superiores com meios contendo 1% de FBS. As câmaras inferiores continham meio de cultura completo (10% FBS) para prender as células invasoras. A capacidade de invasão das células foi determinada a cada 24 horas por contagem de células as câmaras inferiores que passaram com sucesso através da membrana Matrigel-revestidas.

imunofluorescência e microscopia confocal

A análise de microscopia de imunofluorescência e confocal foi realizada como previamente descrito [22]. Resumidamente, as lamelas de vidro foram primeiro revestidos com poli-L-lisina e formaldeído. As células fixas foram subsequentemente permeabilizadas com Triton-X-100 e bloqueadas com soro fetal de bovino. As lamelas foram incubadas com um anticorpo anti-Dsg3 (clone 5H10), um anti-placoglobina (clone H-80, Santa Cruz Biotech), um anti-β-catenina (clone E5), ou um anticorpo anti-TCF4 (cloneD4), e corado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) – ou um anticorpo secundário conjugado com rodamina. As lamelas foram montadas com meio de montagem contendo DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). A fluorescência foi visualizada usando um microscópio confocal a laser (Leica TCS SP2 MP).

ensaio de repórter de luciferase de atividade do promotor TCF

Para determinar a atividade do promotor TCF, o TOPflash (TOP) eo negativo foram utilizados controle de contrapartida FOPflash (FOP) plasmídeos repórter (Millipore, Corporation, Bedford, MA). O plasmídeo TOP contido TCF sítios de ligação, enquanto que a FOP contido, sítios de ligação TCF inativos mutantes. As células estáveis ​​ou células shDSG3 knockdown placoglobina foram transfectadas com plasmídeos repórter TOP ou FOP, juntamente com o promotor da timidina-cinase-Renilla plasmídeo repórter luciferase (Promega, Madison, WI) como controlo interno. Após 48 horas, as células foram recolhidas, e as actividades TOP /FOP foram medidos utilizando a luciferase dupla Reporter Assay System em combinação com o Luminómetro GloMax 20/20 de acordo com as instruções do fabricante (Promega). O TOPflash ou actividade FOPflash foi normalizada contra a actividade da luciferase de Renilla, e as vezes de aumento no TOP em comparação com o plasmídeo repórter FOP (TOP /FOP) foi relatada.

Mouse modelos de xenoenxerto e análise imuno-histoquimica de tumores xenoenxertados

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo IACUC (Institutional animal Care e do Comitê Use) no Chang Gung University e seguiram as orientações do Conselho de pesquisa da nossa instituição para o cuidado e uso de animais de laboratório. Um número mínimo de ratos foram usados ​​para o estudo e todos foram feitos esforços para minimizar o sofrimento. O método de geração de xenoenxertos foi realizada como previamente descrito [23]. Em resumo, um total de 6 ratinhos macho nula BALB /C a 5 semanas de idade foram utilizados para a experiência. Um total de 5 × 10

5 silenciamento Dsg3 estável células (shDSG3) ou células transfectadas estáveis ​​vector foram injectados por via subcutânea na porção superior do membro posterior. O tamanho do tumor foi monitorizado diariamente por meio do cálculo do volume de comprimento x largura x altura utilizando compassos de calibre. O peso do tumor foi medido após os ratinhos foram sacrificados no dia 38. Os tumores de xenoenxertos foram removidos e submetidos a imuno-histoquímica (IHC) ou análise de Western blot.

O IHC foi realizada como previamente descrito [24]. Resumidamente, as amostras de tecido foram fixados em solução de formol e embebidos em parafina. As secções foram desparafinadas com xileno, fervidos em tampão de citrato para recuperar os antigénios, e bloquearam-se com peróxido de hidrogénio. As lâminas foram então incubadas com anticorpos primários. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-Dsg3 (clone 32-6300, Zymed Laboratories Inc., CA, EUA), anti-c-myc (clone 9E10, Santa Cruz Biotech, CA, EUA), anti-ciclina D1 (clone M20, Santa Cruz Biotech, CA, EUA), ou anti-MMP-7 (MAB3315, Millipore, Corporation, Bedford, MA). análise IHC e o desenvolvimento da cor foi realizada utilizando um sistema de Dako Envision (Dako, Carpinteria, CA) seguindo as instruções do fabricante. diluentes de anticorpos foram substituídos para os anticorpos primários como controlos negativos e depois contra-coradas com hematoxilina (HE). As reações de coloração foi determinada por exame microscópico.

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Student para comparar dois conjuntos de dados entre diferentes amostras. Todos os valores de p foram em frente e verso. A

p

valor. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Dsg3 silenciamento perturba a sua interacção com placoglobina e induz placoglobina translocação ao núcleo

Para demonstrar a função celular de Dsg3, estabelecemos shDSG3 expressando estavelmente células derivadas de selecção das linhas de células de HNC OECM1 e SAS após transfecção de shRNA Dsg3 segmentação. A eficácia de knockdown Dsg3 é mostrado na Figura 1A. Em células OECM1, ambos os clones (SH1 e SH2) exibido knockdown significativa de Dsg3 ( 90%) em comparação com as células transfectadas com o vector vazio. No SAS células, SH1 e SH2 reduzida expressão Dsg3 a 60% e 30%, respectivamente. Por isso, usaram células do clone OECM1-SH1 e SH2 SAS-todo um estudo mais aprofundado.

expressão (A) Dsg3 foi suprimida em células shDSG3 usando RNAi. células OECM1 SAS e foram transfectadas com o plasmídeo de expressão específica shRNA-Dsg3 ou o plasmídeo vector vazio, e os clones foram seleccionados utilizando G418. Quatro clones (OECM1-SH1 e OECM1-SH2 em células OECM1 e SAS-SH1 e SAS-SH2 em células SAS) de células shDSG3 foram escolhidas e analisadas utilizando ensaios de Western blot para determinar o nível de proteína Dsg3. Dois clones (OECM1-V em células OECM1 e SAS-V em células SAS) das células transfectadas com vector também foram escolhidos como controlos. O nível de proteína actina foi determinada como um controlo interno para a expressão da proteína. (B) silenciamento Dsg3 reduziu a interacção de Dsg3 com placoglobina, tal como determinado por imunoprecipitação (IP) e análise de imunotransferência (IB). Dois conjuntos de células foram examinadas, as células transfectadas com vector vazio e células shDSG3-transfectadas. Em cada amostra, as proteínas foram extraídas e imunoprecipitados com anticorpo anti-Dsg3 (D3), anti-placoglobina (Pg), IgG de ratinho (IgG) (como controlo negativo), como indicado acima de cada pista. Cada amostra foi subsequentemente coradas imunologicamente com qualquer uma placoglobina (Pg) – ou anticorpo específico Dsg3 (D3), tal como indicado no lado esquerdo de cada conjunto de amostras. (C) Dsg3 silenciamento induzido plakoglobinn translocação desde o citoplasma para o núcleo. Microscopia de imunofluorescência e confocais foram usadas para examinar a localização de Dsg3 e placoglobina em ambas as células transfectadas com vector e shDSG3-transfectadas vazios. Dsg3 foi detectada utilizando um anticorpo específico primário-Dsg3 com um anticorpo secundário conjugado com FITC e é mostrado em verde. Placoglobina foi detectada utilizando um anticorpo específico primário-placoglobina com um anticorpo secundário conjugado com rodamina e é mostrado a vermelho. DAPI coloração foi realizada por coloração nuclear e é mostrado em azul. As imagens foram fundidas para identificar a localização subcelular de Dsg3 e placoglobina. A barra de escala indica o tamanho de 40 mm. (D) Total e extracto de proteínas nucleares foram usadas para examinar nível placoglobina por ensaio de imunotransf erência. densidade de proteína foi medida pelo programa Image J. extratos de proteínas totais foram normalizados com a actina; extractos proteicos nucleares foram normalizados com HDAC para calcular o nível relativo de expressão.

Desde Dsg3 é um componente do desmossoma e interage com outras proteínas desmossômicas, tais como placoglobina, para manter a adesão célula-célula. Investigou-se a via de sinalização de Dsg3 eram mediados através da sua interacção com a molécula placoglobina jusante. Como mostrado na Figura 1B, Dsg3 silenciamento não teve nenhum efeito significativo sobre o nível de expressão placoglobina. Quando as amostras de proteína a partir das células transfectadas com vector vazio foram imunoprecipitados com um anticorpo específico para o Dsg3 e imunotransferidas com um anticorpo específico para o placoglobina, estas duas moléculas de interagiram com um outro. Nas células shDSG3, Dsg3 exibiram uma associação muito mais fraca com a placoglobina do que nas células transfectadas com vector vazio. Resultados semelhantes também foram encontrados na experiência inversa. Quando as amostras de proteína foram imunoprecipitadas com um anticorpo específico para o placoglobina e imunotransferidas com um anticorpo específico para o Dsg3, embora interacções foram encontrados entre estas duas moléculas nas células transfectadas com vector e o shDSG3 vazias, as células shDSG3 mostraram uma associação muito mais fraca. Estes resultados indicaram que Dsg3 knockdown interrompe a interação entre Dsg3 e placoglobina.

O rompimento da interação entre Dsg3 e placoglobina em células SH-D3 foi ainda demonstrada através de imunofluorescência. Como se mostra nas imagens de fluorescência de coloração e nucleares incorporadas na Figura 1C, e placoglobina Dsg3 co-localizado na membrana celular em células de controlo. Nas células sh-D3, não foi observada esta co-localização. Em vez disso, knockdown de Dsg3 facilitada placoglobina translocação da membrana celular de junções desmosome para o núcleo. Além disso, extractos de proteínas totais e proteínas nucleares foram examinadas distribuição placoglobina por ensaio de imunotransf erência. Na Figura 1D, o nível placoglobina elevados em extrato de proteína nuclear em células SH-D3 do que as células de controle de vetores, mas a quantidade de placoglobina na fração total de proteínas não encontraram nenhuma diferença significativa entre as células de controlo de vector sh-D3 e. Estes resultados sugeriram que Dsg3 knockdown perturba a sua interacção com a placoglobina e placoglobina induz a translocação para o núcleo

Dsg3 knockdown aumenta a interacção de placoglobina com o factor de transcrição TCF

placoglobina é o mais próximo de vertebrado em relação β -catenina, o que é uma molécula efectora a jusante na via de sinalização Wnt canónica, embora eles têm diferentes potenciais de transactivação [25] – [28]. sinalização Wnt inicia uma cascata de eventos que permite β-catenina a escapar da degradação mediada por proteassoma, que normalmente assegura que existe apenas um baixo nível basal de β-catenina no citoplasma. β-catenina é, então, capaz de se translocar para o núcleo onde se complexa com os factores de transcrição do factor de células T linfóides /fator de ligação potenciador (TCF /LEF) familiares e activa a transcrição de genes alvo [25], [28]. Por isso, investigou se placoglobina translocação nuclear desencadeada por knockdown de Dsg3 afeta a interação entre placoglobina eo TCF fator de transcrição. Os métodos de imunoprecipitado foram usadas para examinar em ambos OECM1 (Figura 2A) e células SAS (Figura 2B). Como mostrado, Dsg3 silenciamento aumentou a ligação de TCF4 com placoglobina, mas não teve nenhum efeito significativo sobre a interacção com β-catenina. imunofluorescência também revelou resultados consistentes. Em comparação com as células de controlo transfectadas com o vector, Dsg3 knockdown aumentou a quantidade de placoglobina no núcleo, que tinha sido mostrado proeminente co-localização com o factor de transcrição TCF4 (Figura 2C). Estes resultados sugerem que o knockdown de Dsg3 induzida placoglobina translocação para o núcleo, o que levou ao aumento da ligação para o factor de transcrição TCF.

(A, B) Queda de Dsg3 placoglobina aumento de ligação ao factor de transcrição TCF4, tal como determinado por imunoprecipitação (IP) e imunotransferência análise (IB), tal como determinado em OECM1 (a) e células B (SAS). Os extractos celulares de vector ou as células transfectadas estáveis ​​shDSG3 foram imunoprecipitados com anticorpo anti-TCF4, IgG de coelho (IgG) (como controlo negativo) e subsequentemente coradas imunologicamente com o anticorpo ou placoglobina β-catenina. microscopia de imunofluorescência e confocal (C) foram utilizados para examinar as interações entre plakpglobin e TCF4. As células vetoriais ou shDGS3 estáveis ​​transfectadas foram co-coradas com placoglobina e anticorpos TCF4. Após a lavagem, as lâminas foram incubadas com anticorpo conjugado segundo rhodamine- ou FITC. a coloração DAPI foi realizada por coloração nuclear. A barra de escala indica o tamanho de 40 mm.

Dsg3 silenciamento suprime TCF /LEF transcricional actividade e os genes alvo a jusante c-myc, ciclina D1, e MMP-7

investigou também se translocação nuclear placoglobina desencadeada por silenciamento Dsg3 também induziu efeitos sobre o TCF /LEF transcricional atividade. Uma vez que o papel de placoglobina na via Wnt não está bem definida, que, por conseguinte, identificar a função de placoglobina na TCF /LEF actividade transcricional. O ensaio de repórter de luciferase TOPflash /FOPflash foi utilizado [28]. Como mostrado na Figura 3A, knockdown de expressão placoglobina aumentou o TCF /LEF transcricional actividade ao longo de 2 vezes em ambas as células e OECM1 SAS após 1 dia. Estes resultados sugerem que, em contraste com a p-catenina, placoglobina funções como um regulador negativo da sinalização de Wnt e o TCF /LEF via transcricional

.

(A) e (B) Os efeitos de TCF /LEF actividade transcricional depois placoglobina ou knockdown Dsg3. O silenciamento estável placoglobina (sh-Pg) ou silenciamento Dsg3 células (sh-D3) foram transfectadas com TOPflash ou FOPflash plasmídeo repórter luciferase e o plasmídeo Renilla. Após 24 horas, a actividade da luciferase foi determinada usando o Steady-Glo Luciferase Reagent. A actividade da luciferase do pirilampo foi normalizada contra a actividade da luciferase de Renilla e as vezes de aumento da actividade TOPflash comparada com a actividade FOPflash foi relatada. (C) e (D) As expressões do /genes alvo a jusante LEF c-myc TCF e ciclina D1 foi determinada nas células estavelmente transfectadas com alvo específico shRNAs para placoglobina (-PG sh) ou Dsg3 células (sh-D3), em comparação com o vector estavelmente transfectadas células. Em cada amostra, as proteínas foram extraídas e analisadas por ensaios Western blot para determinar os níveis de c-myc, ciclina D1, e a MMP-7 de expressão.

O potencial efeito de silenciamento Dsg3 no TCF /actividade transcricional ABL foi examinada. Tal como mostrado na Figura 3B, knockdown de Dsg3 suprimiu a actividade transcricional LEF TCF /a um nível de 53% das células de controlo em células OECM1 e 59% em células SAS após 1 dia. Em conjunto com os estudos anteriores, estes resultados demonstraram que Dsg3 knockdown interrompido sua interacção com placoglobina (Figura 1B), fazendo com que a importação nuclear do placoglobina (Figura 1C), o que facilita a sua interacção com TCF (Figura 2), e que conduz ao aumento do seu efeito supressor sobre o TCF /LEF actividade transcricional (Figura 3B).

para investigar mais profundamente como Dsg3 regula a via de sinalização /LEF placoglobina-TCF levando a alterações na homeostase celular, examinámos várias moléculas alvo a jusante TCF, incluindo c-myc , ciclina D1, e a matriz metaloproteinase 7 (MMP-7) [29] – [31], todos os quais possuem funções importantes sobre o crescimento celular e a invasão. Conforme determinado por análise de Western Blot, placoglobina silenciamento aumentou substancialmente a expressão de c-myc, ciclina D1, e MMP-7, nas linhas celulares OECM1 e SAS (Figura 3C), enquanto que Dsg3 silenciamento suprimida a expressão destas proteínas em ambas as linhas celulares (Figura 3D). Estes resultados sugerem que Dsg3 silenciamento suprimiu o TCF /LEF transcricional atividade, o que inibe ainda mais as expressões das moléculas a jusante c-myc, ciclina D1 e MMP-7.

Dsg3 silenciamento inibe o crescimento celular e induz a célula parada do ciclo na fase G0 /G1

Desde Dsg3 demonstrou como um transdutor molecular para regular as expressões de c-myc, ciclina D1 e MMP7, examinamos se esta molécula funcionou na regulação do crescimento celular. Como mostrado na Figura 4A, Dsg3 silenciamento suprimiu o crescimento celular de células OECM1 em 64% ao dia 3 e suprimiu o crescimento celular de células por SAS 76% no dia 3. Este fenómeno foi ainda apoiada utilizando ensaios de formação de colónias que mostravam 90% inibição do crescimento em células OECM1-shD3 e inibições de crescimento de 80% em células SAS-shD3. Para investigar o efeito de Dsg3 na regulação do ciclo celular, citometria de fluxo foi realizada. Como mostrado na Figura 4B, knockdown de Dsg3 resultou em células que presos na fase G0 /G1, tal como ilustrado pelo atraso na entrada em fase S. células OECM1 começaram a entrar na fase S em 12 horas (45,0%), enquanto que as células OECM1-shD3 não começar a entrar em fase S até cerca de 18 horas (49,3%). Da mesma forma, as células SAS começando entrar em fase S em 3 horas (48,9%), enquanto que as células SAS-shDSG3 não entrou em fase S até cerca de 6 horas (40,27%). Estes resultados sugeriram que Dsg3 knockdown crescimento celular inibida por células prender na fase G0 /G1 retardada entrar para a fase S.

(A), o crescimento celular foi reduzida em células shDSG3. Um total de 10

5 células de células vazias ou shDSG3-transfectadas transfectadas com vector (SH-D3) foram semeadas numa placa de 10 mm e cultivadas durante 3 dias. As experiências foram realizadas em triplicado (***, p 0,001) (painel superior). A formação de colónias foi reduzido em células shDSG3. Um total de 1000 quer células transfectadas com vector vazio ou células shDSG3-transfectadas (SH-D3) foram semeadas numa placa de 6 poços e incubadas durante 7 dias para permitir a formação de colónias. colónias de células foram visualizadas e contadas após coloração com violeta de cristal a 5%. (***, P 0,001) (painel inferior). (B) O ciclo celular preso na fase G0 /G1 em células shDSG3. As células shDSG3 (SH-D3) (5 × 10

5 células por placa de 10 cm) foram sincronizadas na fase G0 /G1 através da sua cultura em meio isento de soro durante 24 horas. O meio de cultura de células foi então mudado para completar meios para permitir que as células entram no ciclo celular. As células foram recolhidas a cada 6 horas ou 3, e o seu estado do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo. (C) A capacidade de migração de células foi reduzido em células shDSG3, tal como determinado utilizando um ensaio de migração Transwell. Vazios ou shDSG3-transfectadas transfectadas com vector de células (SH-D3) foram semeadas a uma densidade de 10

5 células por poço numa placa de 6 poços com inserções Transwell que tinha uma membrana de policarbonato porosa (8 um de tamanho) e incubados em meio regular. Após 24 horas, as células que tinham migrado para o lado de baixo das inserções Transwell foram coradas com violeta de cristal. Cada experiência foi realizada em triplicado. (***, P 0,001). (D) A capacidade de invasão de células foi reduzido em células shDSG3, como determinado utilizando um ensaio de invasão de Matrigel. Vazios ou shDSG3-transfectadas transfectadas com vector de células (SH-D3) foram semeadas a uma densidade de 10

5 células por poço numa placa de 24 poços com câmaras de invasão Millicell Matrigel-revestidas e incubaram-se a 37 ° C durante 24 horas. O número de células que migraram através do Matrigel para a câmara inferior foram determinados a cada 12 horas e 24 horas. Cada experimento foi realizado em triplicado (***, p 0,001).

Dsg3 silenciamento inibe a migração celular e invasão

Desde funções Dsg3 em interações célula-célula, examinamos se Dsg3 knockdown afetados migração e invasão celular. Os resultados da migração de células do ensaio Transwell são mostrados na Figura 4C. A migração de duas linhas de células SH-D3 foi dramaticamente reduzida após 24 horas quando comparado com as linhas de células de controlo. Os resultados a invasão de células do ensaio de Matrigel são mostrados na Figura 4D. A capacidade de invasão de células SH-D3 também foi reduzido de forma significativa (86% em OECM e 71% em células SAS após 12 horas).