Abstract

O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), que é sobre-regulada no cancro do pulmão, envolve a activação de sinais mitogénicos e provoca várias cascatas de sinalização. Para dissecar essas cascatas de EGFR, foram utilizados 14 anticorpos fosfo-EGFR diferentes para quantificar fosforilação de proteínas utilizando um

in situ

ensaio de proximidade de ligação (

in situ

PLA). A fosforilação do EGFR em-Thr654 e -Ser1046 foi EGF-dependente no receptor de tipo selvagem (WT), mas independente de EGF numa linha celular possuindo a mutação do EGFR-L858R. Usando um ProtoAarray ™ contendo ~5000 proteínas recombinantes no chip de proteínas, verificou-se que AURKA interagiu com o mutante de EGFR-L861Q. Além disso, a sobre-expressão de EGFR poderia formar um complexo com AURKA, e os inibidores de EGFR e AURKA diminuiu EGFR-Thr654 e fosforilação -Ser1046. coloração imuno-histoquímica de fase I tecidos de adenocarcinoma de pulmão demonstrou uma correlação positiva entre a expressão AURKA e fosforilação de EGFR em Thr654 e Ser1046 em

EGFR

espécimes -mutant, mas não no

EGFR

-wt espécimes. A interação entre EGFR e AURKA fornece uma explicação para a diferença de dependência EGF entre

EGFR

WT e

EGFR

células -mutant e pode fornecer uma nova estratégia terapêutica para pacientes com câncer de pulmão que transportam

EGFR

mutações

Citation:. Chen TC, Liu YW, Huang YH, Yeh YC, Chou TY, Wu YC, et al. (2013) Protein fosforilação Profiling Usando um

In Situ

Proximidade Ligadura Ensaio: A fosforilação de AURKA-suscitou EGFR-Thr654 e EGFR-Ser1046 em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 8 (3): e55657. doi: 10.1371 /journal.pone.0055657

editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Agosto, 2012; Aceito: 03 de janeiro de 2013; Publicação: 08 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência (NSC101-2325-B-010-011 e NSC101-2627-B-010-001), o Centro de Excelência para Pesquisa do Câncer em Taipei Veterans general Hospital (DOH101-TD-C- 111-007) e do Ministério da Educação, o objectivo para o Plano Universidade Top (Universidade Nacional Yang Ming) para CYH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a causa mais comum de morte por câncer em todo o mundo, ea taxa de sobrevivência relativa de cinco anos de pacientes com câncer de pulmão é inferior a 15% [1]. Existem dois principais tipos de cancros do pulmão: o cancro do pulmão de células pequenas (SCLC, aproximadamente 20% dos cancros do pulmão) e cancros do pulmão de não-pequenas células (NSCLC, aproximadamente 80% dos cancros do pulmão) [2], [3]. Epidérmico receptor do factor de crescimento (EGFR), que é um receptor tirosina-quinase (RTK), inicia a múltiplas vias de sinalização relacionados com a progressão do cancro, tais como aqueles que estão envolvidos na proliferação celular, a migração /invasão e o ciclo celular [4] – [7]. A sobre-expressão de EGFR é observada em aproximadamente 50% dos CPNPC e também está associado com prognóstico pobre e um campo de doença mais agressivo [8], [9].

EGFR

mutações são frequentemente detectados em pacientes com NSCLC (10-40%) [10], [11]. Cerca de 50% de

EGFR

mutações consistem de deleções no exão 19, ao passo que 35-45% do composto mutação L858R e 5% de inserções consistem no exão 20 ou a mutação L861Q [10] – [12]. Gefitinib (Iressa) e erlotinib (Tarceva) são inibidores de EGFR que são utilizados clinicamente para o tratamento de NSCLC avançado, principalmente que com

EGFR

mutações nos domínios de tirosina-quinase [13] – [16].

EGFR é activado pela ligação dos seus ligandos cognatos, tais como EGF e TGFa. A ligação do ligando para o tipo selvagem (WT) EGFR resulta na dimerização do receptor e a activação do domínio quinase intrínseca, seguido pela fosforilação de resíduos específicos de tirosina na cauda citoplasmática [17] – [19]. A desregulação de vias activadas por EGFR podem resultar de mutações que causam a dimerização do receptor independente de ligando, a activação e a sinalização a jusante [16], [20]. Após a estimulação EGF, a fosforilação de EGFR tirosina é um “evento precoce”, enquanto EGFR fosforilação de serina /treonina, por exemplo, Ser967, ocorre com um tempo de atraso [21], [22]. A fosforilação do EGFR em muitos locais de tirosina após estimulação ligando inicia cascatas de sinalização a jusante, e a fosforilação do EGFR na serina /treonina foi reportado para atenuar estes sinais por meio de feedback negativo [23] – [25]. Muitos locais de fosforilação de serina e treonina estão presentes em EGFR, mas a sua função permanece desconhecida. Além disso, o resultado de sinalização induzida pela fosforilação de diferentes sítios de EGFR é complicado e continua a ser elucidada para o desenvolvimento de aplicações terapêuticas.

A proteína quinase AURKA tem atraído a atenção porque a sua sobre-expressão foi encontrado em várias epitelial tumores malignos [26], [27], tais como cancro da mama [28], do cólon [29], do ovário [30] e pulmão [31], como o resultado de amplificação de genes, a desregulação da transcrição ou defeitos na estabilidade da proteína e o controle de actividade de quinase [32]. Desregulação da AURKA e EGFR é observada em diferentes tipos de câncer e é um importante indicador de prognóstico no desenvolvimento do câncer [33]. Um estudo anterior demonstrou que o recrutamento induzida pelo EGF do EGFR nuclear e STAT5 para o promotor AURKA aumentou ainda mais a expressão do gene AURKA [34]. Além disso, o EGFR aumenta a expressão da proteína de AURKA através da activação da maquinaria de tradução através dos ERK e AKT vias [35]. Estes resultados levantam a possibilidade de que essas duas proteínas funcionalmente ligadas.

Recentemente, o

in situ

ensaio de proximidade de ligação (

in situ

PLA) foi desenvolvido para detectar e visualizar IPP endógenos e modificações pós-tradução de proteínas, por exemplo, fosforilação, com elevada sensibilidade e especificidade [36], [37]. Para detectar a fosforilação da proteína, foram seleccionados objectivos duais de pares de anticorpos primários [um que reconhece a proteína alvo (por exemplo, EGFR) e outro que reconhece a fosfo-local do alvo (por exemplo pEGFR-Tyr1068)]. Se os alvos de um par de anticorpos estão em estreita proximidade, anticorpos secundários conjugados com oligonucleótidos será suficientemente estreita para servir como moldes para a ligação de dois oligonucleótidos lineares adicionais dentro de um círculo do ADN. O círculo do ADN pode ser amplificado com o oligonucleótido de um dos anticorpos secundários usando amplificação em círculo rolante (RCA). O produto pode então ser RCA hibridado com oligonucleótidos fluorescentes marcadas para gerar um sinal de ponto que indica a localização subcelular e frequência de fosforilação [36], [37]. Esta técnica tem elevada especificidade e sensibilidade para a avaliação da fosforilação de proteínas e proporciona novas oportunidades para a quantificação exacta e a fosforilação da proteína de transdução de sinal em células.

Aqui, utilizou-se 14 diferentes anticorpos de EGFR-fosforilação do local alvo com

in situ

PLA para elucidar as diferenças entre EGFR-WT e mutante EGFR-L858R em células de câncer de pulmão. De particular interesse é a identificação de dois sítios de fosforilação independente de EGF (EGFR e EGFR-Thr654-Ser1046) em células que transportam a mutação do EGFR-L858R. Além disso, tanto EGFR-WT e mutante EGFR-L858R mostrou interações físicas com AURKA sob estímulo de EGF. EGFR-Thr654 e fosforilação de EGFR-Ser1046 diminuiu após a aplicação de um inibidor AURKA, mas apenas em linhas de células mutante EGFR-L858R, que levantou a possibilidade de a aplicação terapêutica dos inibidores AURKA em pacientes com câncer de pulmão.

Resultados

Profiling de fosforilação do EGFR em células de cancro do pulmão

fosforilação do EGFR desempenha um papel chave na modulação da activação de vias de sinalização relacionados com a progressão do cancro [4] – [7]. Existem numerosos locais de fosforilação do EGFR (https://www.phosphosite.org) [38], e muitos deles não têm sido extensivamente estudados (Figura 1), por causa de uma falta de anticorpos e métodos de detecção. No presente estudo, foram utilizados 14 anticorpos de EGFR fosforilados para

In situ

PLA para quantificar o nível basal de sinalização de EGFR em células HeLa, o que é a linha celular comum para o rastreio (Tabela 1). Todos os anticorpos testados negativo no

in situ

ensaio PLA em células HeLa, o que é consistente com a ideia de que o EGFR é activada mediante a ligação do seu ligando e desencadeia efectores a jusante através de dimerização do receptor e fosforilação da tirosina específica resíduos na cauda citoplasmática [17] – [19]. Para confirmar a sensibilidade e especificidade das células A431 a

in situ

PLA, nós então utilizados, que são bem conhecidos para expressar altos níveis de EGFR e hiper-fosforilada EGFR-Tyr1068 sob estímulo de EGF. (Figura 2, as imagens representativas de sobreposição BlobFinder foram mostrados na Figura S1). Assim, as células A431 foram escolhidos como um controlo positivo. O pEGFR-Tyr1068 foi regulada positivamente por um aumento de aproximadamente 15 vezes após estimulação EGF, tal como determinado por

In situ

ensaio PLA (Figura 2A e 2B), ao passo que apenas foi regulada positivamente por 2,6 vezes, conforme determinado por imunotransferência ( Figura 2C), que indica a alta sensibilidade do

in situ

ensaio PLA.

a informação do local de fosforilação de EGFR foi obtido a partir PubMed e PhosphoSitePlus (https://www.phosphosite.org) .

células A431 foram durante 16 horas e depois tratou-se com EGF (10 ng /mL) em meio isento de soro durante 10 minutos, privadas de soro. (A)

In situ

PLA é altamente sensível para detecção da fosforilação da pEGFR-Tyr1068 após estimulação EGF. (B) A quantificação destes dois sinais é mostrado. (C) EGFR e pEGFR-Tyr1068 foram detectados em células A431 por immunoblotting análise.

A expressão diferencial de fosforilação de EGFR, após a estimulação EGF entre EGFR-WT e células EGFR-mutante

activação de EGFR inicia múltiplas vias de sinalização, ea desregulação das vias ativadas-EGFR pode ser uma consequência de vários

EGFR

mutação [39]. Para determinar o estado de fosforilação diferencial dos sítios de fosforilação do EGFR, que detectada fosforilação do EGFR em locais diferentes em células de cancro do pulmão H1299 que expressavam estavelmente um vector vazio, o EGFR-WT ou mutante de EGFR-L858R com ou sem estimulação do ligando. Em células estáveis ​​H1299-EGFR-peso, 9 de 14 locais de fosforilação de EGFR foram fosforilada por estimulação EGF. O resto dos anticorpos pEGFR não conseguiu mostrar um sinal na imunotransferência. Em contraste, nas células mutantes de EGFR-L858R, o EGF-induzida (EGFR-Tyr992, EGFR-Tyr1068 e EGFR-Tyr1148) e fosforilação independente de EGF (EGFR-Thr654, EGFR-Tyr845, EGFR-Tyr974, EGFR-Ser1046, EGFR -Tyr1086, e EGFR-Tyr1101) foram identificados (Figura 3A-3C). Comparando os resultados do

in situ

PLA e immunoblotting, foram observados padrões de fosforilação semelhantes para todos os locais de fosforilação selecionados (Tabela S1 e Figura S2). Os padrões de fosforilação dos 14 locais de fosforilação do EGFR diferentes, conforme determinado por

In situ

PLA e imunotransferência estão resumidos na Tabela 1.

células H1299 expressa estavelmente o vector vazio, o EGFR-WT ou com o EGFR mutante -L858R. (A) após estimulação com EGF (10 ng /mL) em meio isento de soro, durante 10 minutos, os extractos celulares foram sujeitos a análise de imunotransf erência com anticorpos fosfo-tirosina indicados. EGF-dependentes (EGFR-Tyr992, -Tyr1148 e -Tyr1068) e independente de EGF [EGFR-Tyr845, -Tyr974, -Tyr1086 e -Tyr1101, -Thr654 (ver abaixo) e -Ser1046 (ver abaixo)] fosforilação foram observados nas células H1299 que expressam EGFR mutante L858R. A fosforilação de EGFR-Thr654 (B) e -Ser1046 (C) com ou sem tratamento EGF em diferentes linhas de células de câncer de pulmão foi monitorada através de

in situ

PLA. A quantificação do

in situ

PLA é mostrado à direita. De EGFR-Thr654 e -Ser1046 foram fosforilados após tratamento com EGF em células H1299-EGFR-WT, enquanto que a sua fosforilação foi EGF-independente em células H1299-EGFR-L858R. (D) Análise de imunotransferência de EGFR-Thr654 e -Ser1046 foi realizada em células EGFR mutante (H1975, que contém o EGFR-L858R e mutantes -T790M) e células que expressam o EGFR-WT (A549). A fosforilação do EGFR-Tyr1068 foi induzida por EGF. A fosforilação de EGFR-Thr654 e -Ser1046 foi EGF-independente em H1975 e H1299 células-EGFR-L858R, conforme determinado por immunoblotting.

Phospho-EGFR-Thr654 e fosfo-EGFR-Ser1046 exposição EGF fosforilação independente em células mutantes H1299-EGFR-L858R

na linha de células H1299-EGFR-L858R, a fosforilação do EGFR-Thr654 (Figura 3B) e EGFR-Ser1046 (Figura 3C) foi identificado como o EGF-independente fosforilação pela

in situ

PLA e análises de western blot (as imagens representativas de sobreposição BlobFinder foram mostrados na Figura S3 e S4 Figura). No entanto, estes dois locais de fosforilação exibiu fosforilação EGF-dependente em H1299 células expressando EGFR-WT. Além disso, pEGFR-Thr654 e pEGFR-Ser1046, que foram considerados para ser fosforilada por outras cinases [40] -. [42], mas não por EGFR auto-fosforilação, foram selecionados para verificar os efeitos funcionais na via de sinalização EGFR

se ainda avaliada a fosforilação independente de EGF do EGFR-Thr654 e -Ser1046 ocorre apenas em células com sobre-expressão de EGFR-L858R e é causada pela desregulação da via de sinalização de EGFR. Usamos A549 (células de câncer de pulmão com endógenos EGFR-WT) (células de câncer de pulmão com endógena EGFR-L858R-T790M mutado) e H1975 para monitorá-los. A Figura 3D mostra que a fosforilação do EGFR-Thr654 e -Ser1046 foi EGF-independente em células que expressam o EGFR endógeno e exógeno-L858R. Assim, diferentes EGFR serina /treonina padrões de fosforilação foram observados como fosforilação independente de EGF em células mutantes EGFR-L858R.

A interação física entre AURKA e EGFR

AURKA é uma quinase que é altamente expresso na mitose e tem sido implicada nos processos de transformação de células [43]. Numa busca para substratos adicionais e proteínas que interagem usando um ProtoAarray ™ [44] que continha ~5000 proteínas recombinantes no chip proteína (www.invitrogen.com/protoarray), verificou-se que AURKA interagiu com o mutante de EGFR-L861Q, que compreende ~ 5% do

EGFR

mutações em pacientes com câncer de pulmão [10], mas não EGFR-WT (Figura 4A). Para confirmar esta interacção, o que pode ser regulada pela actividade de quinase de AURKA, AURKA-WT e AURKA-KD (mutante AURKA-K162I, que é de cinase morta), foram usados ​​para a co-imunoprecipitação, que mostrou que o EGFR-WT e de EGFR-L858R interagiu com AURKA-WT e AURKA-KD sob a sobre-expressão do EGFR e AURKA (Figura 4B). Os resultados indicaram que a actividade catalítica de AURKA não modula a interacção com o EGFR. Desde EGFR-L858R mutante frequência (aproximadamente 35-45%) aparece em pacientes com NSCLC [12], optamos H1299-EGFR-L858R células estáveis ​​para caracterizar ainda mais a interação com AURKA. A analisar se existem as interações EGFR-AURKA endógenos em células de câncer de pulmão e se é dependente de EGF, foi aplicado

in situ

PLA para determinar a interação EGFR-AURKA em A549 e H1975 com ou sem estimulação EGF (Figura 4C). Ele mostrou tanto EGFR-WT e EGFR-L858R interagiu com AURKA sob estímulo de EGF.

(A) Usamos ProtoArray ™ para identificar EGFR como novo parceiro de interação para AURKA. Resumidamente, expressa, AURKA recombinante humana marcada com His foi sondado em microarrays da proteína humana ProtoArray ™ a sete concentrações (0, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50 e 100 ng /ul) em duplicado. Deve notar-se que o EGFR-L861Q, mas não o EGFR-WT, foi inicialmente identificado para interagir com AURKA. (B) HEK293T foram co-transfectadas com Myc-EGFR (EGFR-WT, EGFR-L858R e -L861Q mutantes) e Bandeira-AURKA [AURKA-WT e AURKA-quinase mortos (KD)]. Após a transfecção de 48 horas, os extractos celulares foram sujeitos a co-imunoprecipitação com um gel de afinidade anti-FLAG M2. A expressão de proteínas foi determinada por imunotransf erência com anticorpos anti-FLAG anti-Myc e. Ele mostrou que ambos os EGFR-WT e mutante associados EGFR com AURKA-WT e AURKA-KD. Resultados semelhantes foram observados em pelo menos três experiências independentes. (C) A interacção EGFR-AURKA com ou sem estimulação EGF (10 ng /ml durante 10 minutos) foi determinada através de

In situ

PLA em A549 (EGFR-WT) e H1975 (EGFR-L858R-T790M mutações ). Ambos EGFR-WT e mutante -L858R foram associados com AURKA sob estímulo de EGF. A quantificação do

in situ

sinais PLA foi mostrado à direita. (D) Os sítios de fosforilação de EGFR-Thr654 e -Ser1046 correspondido as sequências substrato de consenso para AURKA. (E) H1975 células mostraram fosforilação mais evidente no EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 e AURKA-Thr288 em M-fase nocodazole-presos do que em interfase.

EGFR-Thr654 e EGFR-Ser1046 jogo AURKA sequências de fosforilação de consenso

Porque AURKA associado a EGFR, nós próxima investigou se AURKA fosforila EGFR em Thr654 e Ser1046. As sequências de vizinhos para os sítios de fosforilação de EGFR em Thr654 e Ser1046 são RHIVRKRT

654LRRLLQE e DSFLQRYS

1046SDPTGAL, respectivamente. Os motivos de fosforilação AURKA contêm R-X-S /T, K-X-S /T, K-R-X-S /T, R-R-X-S /T e R-X-X-S /T (X indica qualquer aminoácido) [45]. Com base nesses motivos, EGFR-Thr654 combinava com o X X S R-de seqüência /T de consenso e EGFR-Ser1046 combinava com a sequência de consenso R-X-S /T de AURKA (Figura 4D). Embora EGFR-Thr654 foi relatado para ser fosforilado pela proteína cinase C (PKC) [42], de PKC pode não ser a única cinase que fosforila o EGFR neste resíduo. Uma vez que a actividade de cinase de AURKA aumentos na fase M [46], que caracterizado pela primeira vez a fosforilação do EGFR endógeno-Thr654 e EGFR-Ser1046 na M-fase em A549 e células H1975. células H1975 demonstraram fosforilação mais óbvia de EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 e AURKA-Thr288 do que as células A549. Em contraste, o EGFR-Tyr1068 mostrou o mesmo padrão de fosforilação em M-fase e interfase (Figura 4E), o que sugere que os padrões de fosforilado do EGFR-Thr654 e EGFR-Ser1046 expressão foram os mesmos com a de AURKA particularmente em células EGFR-mutante .

EGFR-Thr654 e EGFR-Ser1046 fosforilação ocorre mais tarde do EGFR-Tyr1068 fosforilação após EGF estimulação

A fosforilação de EGFR-Tyr1068 após a estimulação EGF observada a 0, 2, 5, 10 e 30 minutos em H1299 células que expressam o EGFR-WT era mais rápida do que a fosforilação de Thr654 e Ser1046. A fosforilação de EGFR-Tyr1068 atingiu um máximo de 2 minutos após a estimulação EGF, mas a fosforilação de EGFR em Thr654 e Ser1046 atingiu um máximo de 10 minutos após a estimulação EGF (Figura 5A). Em contraste, em células EGFR-L858R, não houve diferença na cinética de fosforilação entre Thr654 e Ser1046 (Figura S5). Assim, a fosforilação da tirosina EGFR ocorre antes do outro a fosforilação de serina /treonina-Thr654 e a Ser1046, que consistiu com o estudo anterior do EGFR fosforilação serina /treonina com o tempo de atraso [21], [22].

(A) a fosforilação do EGFR-Tyr1068 foi mais rápida do que a de EGFR e EGFR-Thr654-Ser1046 sob a EGF (10 ng /ml) a estimulação. (B) As células foram privadas de soro na presença de VE-465 (1 nM ou 100 nM), que é um inibidor AURKA, durante 16 horas e depois tratou-se com EGF (10 ng /ml) durante 10 minutos. A fosforilação do EGFR e EGFR-Thr654-Ser1046, mas não pEGFR-Tyr1068, foi suprimida pela VE-465. (C) As células foram, na presença de Iressa (10 uM) durante 16 horas e depois tratou-se com EGF (10 ng /ml) durante 10 minutos, privadas de soro. Iressa, que é um inibidor de EGFR, foi utilizado para monitorizar a sinalização do EGFR em células que expressam estavelmente H1299-EGFR WT e o EGFR mutante-L858R. A fosforilação por AURKA a Thr288 foi suprimida por Iressa em ambas as linhas celulares. (D) H1975 células foram tratadas com VE-465 e /ou Iressa (10 uM) durante 16 horas. VE-465 e Iressa pode suprimir pEGFR-Thr654 e -Ser1046 em H1975.

inibidor AURKA suprime EGFR serina /treonina

Para investigar a relação entre serina EGFR /treonina e AURKA, um inibidor AURKA (VE-465), que suprime a actividade AURKA como medido por Thr288 fosforilação [47], mas não o nível de proteína de AURKA, foi aplicado para monitorizar a fosforilação do EGFR-Thr654 e EGFR-Ser1046, bem como o EGFR via de sinalização (pAKT-Ser473). Sob tratamento VE-465, a fosforilação do EGFR-Thr654 e -Ser1046 diminuiu, mas o EGFR-Tyr1068 fosforilação não foi afectada (Figura 5B), o que indica que a fosforilação do EGFR e EGFR-Thr654-Ser1046 foi regulada pela actividade de quinase AURKA.

Iressa é um inibidor de EGFR, que suprime a Akt e inibe a fosforilação AURKA

para avaliar a regulação do EGFR e AURKA na via de sinalização de EGFR, um inibidor de EGFR (Iressa) foi utilizado para bloquear autofosforilação de EGFR e a sua sinalização a jusante. Iressa suprimida actividade AURKA e a fosforilação do EGFR e EGFR-Thr654-Ser1046 (Figura 5C), o que sugere que AURKA podem servir como um alvo a jusante de EGFR. Em adição às células sobre-expressa EGFR, que também mostrou o estado de fosforilação do EGFR-Thr654 e -Ser1046 em células mutantes L858R endógena (H1975) sob tratamento de VE-465 e Iressa (Figura 5D). Diminuição da pEGFR-Thr654 e -Ser1046 foi observada em H1975 com VE-465 tratamento. Embora Iressa inibida pEGFR-Thr654 e -Ser1046 em H1975, a combinação de Iressa e VE-465 pode diminuir ainda mais pEGFR-Thr654 e -Ser1046 em H1975, o que implica que estes dois locais pEGFR foram regulada por ambos o EGFR e actividade AURKA quinase.

análise IHC de AURKA, pEGFR-Thr654 e pEGFR-Ser1046 na fase I adenocarcinoma de pulmão

para melhor avaliar a relação entre AURKA e fosforilação de EGFR, 25 estágio espécimes de adenocarcinoma de pulmão que foram submetidos a IHC coloração pEGFR-Thr654, pEGFR-Ser1046 e AURKA (Figura 6). Dezoito dessas amostras NSCLC tinha

EGFR

mutações, conforme determinado por análise da sequência do

EGFR domínios quinase

tirosina. A expressão de pEGFR-Ser1046 e AURKA foi significativamente maior nos tumores do que no tecido adjacente normal (p = 0,001) de pacientes com NSCLC 25 (Tabela 2). Além disso, a expressão de AURKA mostrou uma correlação positiva com um coeficiente de correlação significativa com pEGFR-Thr654 (p 0,05) e pEGFR-Ser1046 (p 0,001) nos pacientes com

EGFR

mutante, mas não com

EGFR

WT, conforme analisado pelo teste de correlação não paramétrico de Spearman (Tabela 3). Em resumo, este coloração imunoquímico fornece evidência de uma possível ligação entre AURKA e EGFR mutado via -Thr654 e -Ser1046.

Cada coluna indica um paciente e cada linha indica um anticorpo. A intensidade IHC nos pacientes foi definida como 0, 1 e 2 para AURKA, pEGFR-Thr654 e pEGFR-Ser1046 coloração.

Em conclusão, a interação entre AURKA eo EGFR-L858R mutante pode explicar a diferença nas vias de sinalização entre

EGFR

WT e mutantes células, que são frequentemente observadas em pacientes com NSCLC, e pode, portanto, fornecer informações valiosas para aplicações terapêuticas.

Discussão

a desregulação de vias activadas por EGFR é muitas vezes associada com mutações do receptor e prevê a resposta a tirosina quinase em doentes com NSCLC [48], [49]. O perfil do EGFR fosforilação em

EGFR

cancro do pulmão células mutantes ainda não está claro. Neste estudo, nós (1) analisaram sistematicamente alterações EGFR fosforilação endógenos para identificar a dependência EGF distinta em diferentes

EGFR

genótipos em células de câncer de pulmão; (2) demonstraram uma relação nova entre AURKA e EGFR, que pode ser mediada através de um evento de fosforilação AURKA-suscitaram pelo EGFR-Thr654 e -Ser1046 em células de câncer de pulmão; e (3) determinou-se a expressão de AURKA, Thr654-EGFR e EGFR-Ser1046 em tecidos de adenocarcinoma de pulmão. Estes dados realçam a necessidade de uma análise mais aprofundada para a relação entre EGFR e AURKA em

EGFR

pacientes -mutant e fornece uma nova visão sobre a aplicação terapêutica dos inibidores AURKA em pacientes com câncer de pulmão.

EGFR Thr654 é conhecido para ser fosforilada por PKC e está envolvida na regulação negativa da sinalização de EGFR após estimulação EGF [50], [51]. Além disso, a fosforilação do EGFR no resíduo Thr654 foi relatado para ser associado com a translocação nuclear de EGFR induzida por radiação, que promove a proliferação celular e a metástase através do aumento da transcrição de ciclina D1, iNOS e B-Myb [52] – [54]. Depois a célula é submetida a radiação ionizante, a quinase dependente do ADN (ADN-PK) interage com o EGFR e reparações não homólogas de ADN-quebras na cadeia dupla de junção de extremidade nuclear, o que faz com que radiorresistência em radioterapia. No presente estudo, EGFR-Thr654 foi constitutivamente fosforilada nas células mutantes de EGFR-L858R. Seria de interesse para examinar se EGFR-Thr654 fosforilação afeta radiorresistência durante a radioterapia nas células mutantes de EGFR-L858R. Além disso, também foi demonstrado que um inibidor AURKA diminuiu a fosforilação do EGFR-Thr654, que pode fornecer uma avenida potencial para uma nova estratégia clínica com um inibidor AURKA.

stress celular, tal como o TNF-α e irradiação UV , têm sido relatados para induzir a fosforilação do EGFR-Ser1046 através de p38 MAPK e, em seguida, fazer com que o EGFR dessensibilização após estimulação EGF e endocitose [55], [56]. Na activação do EGFR induzida pelo ligando, vários resíduos de tirosina, por exemplo Tyr-Tyr-1045 e 1068, são principalmente fosforilada. Grb2 liga-se então a tirosina fosforilada para activar MAPKs. Subsequentemente, as MAPKs fosforilam resíduos de serina /treonina, tais como Ser-1046, sobre o EGFR como um controlo de retorno. A fosforilação do EGFR-Ser1046 por p38 também foi recentemente determinada como sendo um sinal de chave que impede a clivagem de pró-apoptótica de caspase PARP e após estimulação de TNFa [57]. Após estimulação EGF, EGFR é fosforilado em apenas ligeiramente Ser1046 para proporcionar um efeito anti-apoptose [57]. Neste estudo, demonstramos que EGFR-Ser1046 fosforilação é EGF-independente em células mutantes EGFR-L858R, enquanto EGFR-Ser1046 fosforilação é EGF-dependente em células EGFR-WT. Assim, se a fosforilação do EGFR-Ser1046 no EGFR-L858R células mutantes resulta em um anti-apoptóticos efeito garante mais investigação.

células H1299-EGFR-L858R têm um nível mais baixo do que o EGFR que no H1299-EGFR WT células; No entanto, os níveis de fosforilação basal independente de EGF em células L858R em vários resíduos de Ser, Thr, Tyr e são mais fortes do que aqueles em células EGFR-WT (Figura 3). Isto indica que, embora o receptor mutante L858R mostrou um nível de expressão mais baixos, foi hiper-fosforiladas do que o receptor de tipo selvagem. Além disso, o EGFR mutante L858R é conhecido por ser mais activo do que o EGFR WT-em estudo anterior [16]. Em geral, a fosforilação do EGFR em células L858R era menos sensível ao EGF. Isto pode ser devido aos elevados níveis de fosforilação basal do receptor mutante ou devido ao seu nível de expressão inferior. Uma vez que a sinalização do EGFR pode aumentar a expressão da proteína de AURKA [34], [35], AURKA pode também regular a fosforilação do EGFR. Aqui, demonstramos que a interacção entre o EGFR-AURKA é apenas ocorreu após estimulação por EGF (Figura 4C), o que implica que pode participar em AURKA EGFR cascata de sinalização. Em M-fase nocodazole-preso, células EGFR-mutante mostrou fosforilação mais evidente em EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 e AURKA-Thr288 do que as células que expressam EGFR-WT (Figura 4E). EGFR activação ocorre através da via de AKT e EGFR podem regular positivamente a expressão AURKA através da activação da maquinaria de tradução através da via do AKT [35]. O inibidor AURKA VE-465 suprimiu a Akt e inibida EGFR serina /treonina, especialmente em células que transportam

EGFR in

mutações, mas não afectou fosforilação da tirosina EGFR (Figura 5B). Quando as células foram tratadas com o inibidor de EGFR Iressa para bloquear a autofosforilação do EGFR, a fosforilação de AURKA desapareceu (Figura 5C), o que sugere que os mutantes de EGFR constitutivamente pode activar a fosforilação e melhorar a sinalização a jusante para promover a carcinogénese. No entanto, a relação de AURKA, EGFR-WT, e EGFR mutante deve ser ainda avaliados para identificar alvos terapêuticos para pacientes com câncer de pulmão.

Em resumo, perfilando fosforilação de EGFR no tipo selvagem e as células de câncer de pulmão mutantes, identificamos uma relação entre

EGFR

mutações e a fosforilação de EGFR-Thr654 e -Ser1046, que foi associado com a expressão AURKA em pacientes com câncer de pulmão e pode ser desencadeada por AURKA. A interação entre EGFR e AURKA em

EGFR

células mutação sugere que os inibidores AURKA pode ter impacto terapêutico. Prevemos que este estudo irá facilitar o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica eficaz para o câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

As linhas celulares, a sincronização do ciclo celular, e EGF estimulação

A estabelecimento de clones que expressam de forma estável H1299 um vector vazio (H1299-Vec), EGFR-WT (H1299-EGFR-WT) ou EGFR mutante L858R (H1299-EGFR-L858R) foi descrita previamente [16]. A549 (com o EGFR-WT), H1975 (com endógeno mutado EGFR-L858R-T790M) e H1299 clones estáveis ​​foram cultivadas em meio RPMI-1640, e as células A431 foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fatal (FBS), 100 U de penicilina, 0,1 mg /ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina. Todos os reagentes de cultura celular foram de Invitrogen. Para sincronizar o ciclo celular de A549 e linhas celulares de cancro do pulmão H1975, exponencialmente as células em crescimento foram incubadas com 100 ng /ml de nocodazolo (Sigma) durante 16 horas. Para estimular as células com EGF, as células foram, durante 16 horas privadas de soro, seguido por um tratamento de 10 minutos com EGF (10 ng /mL) em meio isento de soro.

análise de imunotransferência

os lisados ​​celulares (50 ug) foram sujeitas a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e subsequentemente transferido para polyvinylidenedifluoride (PVDF) de membrana (Millipore), utilizando o sistema de transferência Bio-Rad. A membrana de PVDF foi bloqueada com 5% de leite magro desnatado (BD Bioscience) à temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de incubação com o anticorpo primário a 4 ° C durante a noite. Todos os anticorpos de EGFR fosfo-policlonal (pEGFR-Thr654, pEGFR-Thr669, pEGFR-Ser671, pEGFR-Ser774, pEGFR-Tyr845, pEGFR-Tyr974, pEGFR-Tyr992, pEGFR-Tyr1045, pEGFR-Ser1046, pEGFR-Tyr1086, pEGFR-Tyr1101