Abstract

A maioria das aprovações de novos medicamentos para o câncer são baseadas em alvos terapêuticos existentes. Uma abordagem para a identificação de novos alvos é a realização de alto rendimento interferência de RNA (RNAi) telas de viabilidade celular. Nós descrevemos uma nova abordagem que combina triagem RNAi em várias linhas de células com expressão gênica e perfil genômico para identificar alvos de cancro novos. Foi realizada telas de ARNi paralelas em várias linhas de células de cancro para identificar genes que são essenciais para a viabilidade em algumas linhas celulares, mas não outras, sugerindo que estes genes constituem factores chave da sobrevivência celular em células cancerosas específicas. Esta abordagem foi verificada por meio da identificação de

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, silenciamento de que foi selectivamente letal para a linha de células MCF7, que abriga uma

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mutação oncogénica ativando. Nós nossa abordagem combinada de ARNi funcional com a expressão de genes e análise genómica, permitindo a identificação de várias novas cinases, incluindo

Wee1

, que são essenciais para a viabilidade apenas em linhas de células que possuem um elevado nível de expressão desta cinase. Além disso, foi identificado um subconjunto de tumores da mama que expressam altamente Wee1 Wee1 sugerindo que pode ser um novo alvo terapêutico no cancro da mama. Em conclusão, esta estratégia representa uma estratégia nova e eficaz para a identificação de funcionalmente importantes alvos terapêuticos no câncer

Citation:. Iorns E, Senhor CJ, Grigoriadis A, McDonald S, Fenwick K, MacKay A, et al . (2009) integrado funcional, expressão gênica e análise genômica para a identificação de alvos câncer. PLoS ONE 4 (4): e5120. doi: 10.1371 /journal.pone.0005120

editor: Toru Ouchi, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 12 Janeiro, 2009; Aceito: 06 de março de 2009; Publicação: 09 de abril de 2009

Direitos de autor: © 2009 Iorns et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Agradecemos Breakthrough Breast Cancer e da Comissão de Ensino Superior da Nova Zelândia para o financiamento deste estudo. Também reconhecemos NHS financiamento para o Centro de Investigação Biomédica NIHR. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Central para a concepção de novas estratégias terapêuticas para o cancro é a identificação de genes que são críticos para a sobrevivência de células tumorais, mas que são, em grande parte redundantes em células normais [1]. Correlacionando alterações moleculares com tumorigénese providenciou uma rota para a identificação de alvos potenciais da droga e fornece a lógica por trás dos esforços para caracterizar a variação genética e expressão do gene em tumores. No entanto, a natureza correlativa destes dados significa que não é frequentemente possível determinar se as observações são causador ou apenas um efeito do estado de doença [2].

RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo que ocorre naturalmente que regula a expressão do gene ao nível pós-transcricional. Em células de mamíferos, RNAs curtos interferente (siRNAs) medeiam a degradação de RNA mensageiro (mRNA complementar transcritos) de uma forma dependente da sequência de [3]. Esta sequência de especificidade de ARNi pode ser utilizada experimentalmente para silenciar genes específicos pela transfecção de siRNAs para células de mamífero. Esta tecnologia foi expandida em bibliotecas de ARNi englobando reagentes que têm como alvo uma vasta gama de transcritos, permitindo que o papel de múltiplos genes num processo celular a ser avaliado de forma isenta [4], [5]. telas de ARNi foram usadas para identificar genes importantes para fenótipos celulares de cancro, incluindo a viabilidade das células [6], [7].

Nós demonstramos que as telas de ARNi pode ser utilizado para identificar genes que são diferencialmente necessários para a viabilidade de cancro linhas celulares e, como prova deste princípio, identificar o oncogene conhecido

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como essencial para a viabilidade em células MCF-7 com um activador

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mutação. Nós mostramos que a combinação de análise de RNAi funcional com a expressão de genes e análise genômica fornece uma nova estratégia para a identificação de factores-chave de células cancerosas específicas, que são alvos potenciais novos medicamentos.

Resultados

RNAi Parallel telas para identificar quinases essenciais para a viabilidade celular

para identificar funcionalmente genes importantes expressos em células cancerosas, usamos uma abordagem de triagem RNAi. Usando uma ampla variedade de linhas celulares de cancro humano e uma RNA biblioteca de interfer�cia (siARN) alvejando 779 quinases, realizamos cinco telas de viabilidade paralelas utilizando MCF7 (ER positivo, o cancro da mama luminal), CAL51 (ER negativo, microssatélite cancro da mama instável), A549 (cancro do pulmão), NCI-H226 (cancro do pulmão) e HeLa (câncer cervical) linhas de células (Figura 1a e Tabela S1). Escolhemos para segmentar quinases como estas proteínas são relativamente passível de inibição farmacológica e têm mostrado ser importantes condutores de muitos cancros diferentes. Em resumo, as células foram plaqueadas em placas de 96 cavidades e foram transfectadas com ARNsi a partir da biblioteca. Aqui utilizou-se uma biblioteca SmartPool, onde cada uma das cavidades da placa de 96 bem continha uma piscina de quatro siRNAs diferentes (um SmartPool) dirigidos contra um gene. Após sete dias de cultura contínua, a viabilidade das células em cada poço foi estimado por utilização de um ensaio luminescente medir os níveis de ATP celular. A fim de comparar a perda de efeitos de viabilidade nas diferentes linhas de células, que normalizada de dados de viabilidade celular a partir de cada linha celular com a mediana de todos os efeitos em que a linha de células, representando cada efeito SmartPool como uma pontuação Z [8], em que Z = 0 não represente efeito sobre a viabilidade e Z pontuações inferiores a -3 representou uma perda significativa de efeitos de viabilidade. Os resultados dos cinco telas de viabilidade celular aproximada distribuições normais, permitindo a comparação dos efeitos de siRNA individuais através das linhas celulares (Figura 1B).

a. gráficos de dispersão dos escores Z de telas de viabilidade celular realizadas em paralelo em MCF7, CAL51, HeLa, A549 e linhas celulares de cancro NCI-H226. Os diamantes pretos – SMARTpools siRNA individuais segmentação 779 genes da quinase por linha celular. Z scores≤-3 representa uma perda significativa de efeitos de viabilidade. b. parcelas de distribuição de escores Z das telas siRNA paralelas. Z scores≤-3 representa uma perda significativa de efeitos de viabilidade. c. As quinases podem ser classificadas com base no efeito de silenciamento na viabilidade celular em todas as cinco linhas celulares de cancro. siRNAs que não tiveram efeito significativo na viabilidade das células em qualquer das linhas celulares estudadas quinases não essenciais provável alvo (ou o siRNA não era funcional). siRNAs que causam perda significativa de viabilidade celular em todas as linhas celulares estudadas cinases alvo susceptíveis, que são essenciais para a viabilidade na maioria dos tipos de tumor ou aqueles que são essenciais para a viabilidade de ambas as células normais e tumorais. siRNAs que só causar letalidade significativa em algumas, mas não todas as linhas de células alvo susceptíveis quinases que pode não ser crítico para a viabilidade de todas as células, mas representam efeitos específicos de tumores. d. telas de RNAi paralelas identificar um oncogene conhecido,

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. efeitos de viabilidade celular de

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alvo são apresentados em cinco linhas de células. MCF7 células foram seletivamente sensíveis à segmentação de

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como demonstrado por uma pontuação Z de ≤-3. siRNAs que causam mortalidade significativa em algumas, mas não todas as linhas de células alvo são susceptíveis de quinases que não são críticos para a viabilidade de todas as células, mas representam efeitos específicos de tumores. Em alguns casos, isso pode ser explicado pela ocorrência de um oncogene activado como é o caso com células MCF-7, que abrigam um activador

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mutação.

Nós fundamentado que siRNAs causando significativa perda de viabilidade celular (Z≤-3) em todas as linhas celulares ensaiadas quinases provavelmente representadas que são essenciais para a viabilidade na maioria dos tipos de tumores ou, mais provavelmente essencial para a viabilidade de ambas as células normais e tumorais. Da mesma forma, os siRNAs que não teve nenhum efeito significativo sobre a viabilidade de qualquer das linhas de células eram ou não funcional ou cinases alvo não essenciais. Finalmente, a hipótese de que os siRNAs que apenas causou mortalidade significativa em algumas mas não todas as linhas de células, cinases identificadas que representam efeitos específicos de um tumor potencialmente identificar novos alvos terapêuticos (Figura 1C). Para determinar a natureza do efeito, siRNAs foram classificadas por meio dos escores Z entre linhas de células (Tabela 1).

Identificação

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fornece prova de princípio para a abordagem

a nossa análise inicial indicou que

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silenciamento era susceptível de representar um efeito específico da linha celular. Silenciamento de

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foi selectivamente letal para as células MCF-7 (pontuação Z de -3,80), mas não HeLa, CAL51, A549 nem H226 (Figura 1D e Tabela 1). MCF7 células são conhecidas por abrigar um activador

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mutação (E545K) em que essas células dependem para a sobrevivência [9], [10]. Além disso, amplificações e mutações de ganho de função de

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têm sido associados com câncer de ovário [11], o cancro do colo do útero [12] e do cancro da mama [10]. A dependência de células MCF7 em cima de um

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activação mutação, pode ser um efeito de dependência de oncogene, que pode ser explorado terapeuticamente [13]. Em casos de vício gene, as células tumorais se tornam fisiologicamente dependente da função continuada de oncogenes activados ou sobre-expressos, que são, portanto, candidatos alvos terapêuticos óbvias. Por exemplo, a eficácia de imatinib (Gleevec) no tratamento de leucemias de rolamento da fusão BCR-ABL [14] fornece um exemplo clínico da dependência de oncogenes e de como ela pode ser explorado terapeuticamente. A identificação de

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validado nossa abordagem para identificar quinases que são essenciais para a sobrevivência de células de tumor.

Correlação da viabilidade das células com a expressão do gene

Embora os efeitos de genes específicos de células identificadas no ecrã RNAi pode ser devido a mutações de activação, tais como em

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, é provável que outros podem surgir devido à aquisição de um aumento do nível de expressão do gene. Para investigar isso, realizamos perfil de expressão de genes do genoma no painel de linha celular humana utilizando-6 v2 Illumina BeadChips [15] e comparou este para os dados da tela RNAi (Tabela S2). Perfil de expressão foi realizada em triplicado e cinases com diferenças significativas na expressão de genes entre as linhas celulares identificadas por análise de variância. Para genes em que pelo menos um siRNA diminuiu significativamente a viabilidade celular (Tabela 1), que examinaram a correlação entre a viabilidade celular seguindo siARN transfecção e expressão do gene. Esta análise identificou quatro genes em que a viabilidade celular inversamente correlacionada com a expressão do gene;

ADCK2

,

NAGK

,

TLR6

e

Wee1

(Figura 2 e Tabela 1). Cada uma destas correlações sugeriu que a expressão elevada do gene em causa pode ser essencial para a sobrevivência de tumores e podem, portanto, representar um novo alvo terapêutico.

a-d. escores Z das telas de siRNA, Z scores≤-3 são destacadas com uma caixa pontilhada vermelha. Eh. Os níveis de expressão Normalizada calculados a partir Ilumina perfil de expressão. Alta expressão correlacionada com a sensibilidade à siRNA, destacado com uma caixa pontilhada vermelha. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). A significância das diferenças na expressão de genes entre as linhas celulares foi avaliada por ANOVA de uma via e o valor de p apresentados para cada linhas celulares. i-l. comparação dos valores de Z, com níveis de expressão normalizados. A linha a tracejado representa o Z = -3 limiar de perda significativa de viabilidade efeitos (p 0,0015). Para os quatro genes mostrado, um nível elevado de expressão é consistente com a perda de viabilidade após a transfecção siRNA. Ver Tabela 1 para a correlação de Pearson de Z vs expressão.

O receptor Toll-like 6, (TLR6) é conhecida por ativar o fator nuclear kappa-B de sinalização, um alvo terapêutico candidato no câncer [16] , e a activação da via dos TLR foi recentemente sugerido ter um papel na tumorigénese [17]. A função de

ADCK2

(domínio AARF contendo quinase 2) não está tão bem estabelecida. NAGK (N-acetilglucosamina-quinase) converte endógena N-acetilglucosamina (GlcNAc), um importante componente de hidratos de carbono complexos, a partir da degradação lisossomal ou fontes nutricionais para GlcNAc 6-fosfato, como parte de uma via de salvamento catalítica. A função de Wee1 é discutido abaixo.

A correlação da expressão do gene com a análise genômica

Foi examinado se a expressão relativamente elevada dos quatro genes identificados em nossa tela de RNAi pode ser explicada por mudanças no gene número de cópias (ou seja, cópia ganhos número e /ou amplificação do gene). o número de cópias do gene foi examinada utilizando a análise baseada em microarrays de hibridação genómica comparativa (aCGH) e cobertos em RNAi e os dados de expressão de genes (Figura 3, Figura S1 e S3 Tabela). Esta análise combinada revelou que, para algumas linhas de células, a expressão elevada de

ADCK2

,

NAGK

ou

Wee1

foi associada com um aumento no número de cópias do gene, potencialmente identificar uma causa de elevada expressão. MCF7 células foram altamente sensíveis a

ADCK2

siRNA e isso reflectiu-se sobre-regulação da transcrição e aumento no número de cópias do gene em

ADCK2

. De modo semelhante, um aumento no número de cópias do gene foi consistente com a expressão elevada sensibilidade e siRNA para

NAGK

em células A549. Por fim, a sensibilidade das células HeLa para

Wee1

siARN foi consistente com a regulação positiva deste gene e ganho genómico (Figura 3 e Figura S1).

gráficos de dispersão que ilustram a relação entre o número de cópias do gene e expressão genetica. Vertical linhas tracejadas representam o limite para os ganhos número de cópias (rácios AWS 0,12).

Outras caracterização de Wee1

Wee1 tem um papel bem definido no controle checkpoint do ciclo celular, com atividade Wee1 limitar os efeitos pró-mitóticas de CDC2 (aka CDK1) [18]. Por conseguinte, a perda de actividade de quinase Wee1 e a sua destruição é um requisito para a entrada em mitose [19], sugerindo que a actividade de Wee1 pode, na verdade, limitar o crescimento de células tumorais. Dado que os nossos dados sugerem que RNAi Wee1 é, nalguns contextos, crítico para a viabilidade das células cancerosas que sobre-expressam, nós investigamos o papel desta cinase adicional. Em primeiro lugar, confirmou que a proteína Wee1 foi sobre-expressos em células HeLa e CAL51 apoiar a nossa análise de RNA (Figura 4a). Para confirmar a correlação de sensibilidade ao siRNA e expressão Wee1, Wee1 foi silenciada por uma piscina independente de siRNAs projetado para reduzir os efeitos off-alvo (Wee1 ONTARGETplus). linhas de células HeLa e CAL51 eram significativamente mais sensíveis ao silenciamento de Wee1 do que linhas de células que não sobreexpressam Wee1 (Figura 4b e Figura S2). Pequenas moléculas têm sido desenvolvidos para inibir Wee1 na base de que a inibição desta cinase pode conduzir a revogação da L

2 /H do ponto de verificação. Muitas células cancerosas exibem um G defeituoso

um ponto de verificação, resultando em uma dependência da L

2 /H do ponto de verificação durante a replicação celular e, como tal, a inibição da L

2 checkpoint /M pode ser letal no presente contexto [20]. Utilizou-se uma pequena molécula inibidor Wee1 (PHCD [21]) para confirmar a sensibilidade selectiva de CAL51 HeLa e linhas celulares para inibição Wee1 (Figura 4c). Examinámos também linhas de células adicionais para a expressão de Wee1 e sensibilidade para Wee1 segmentação, com linhas celulares de carcinoma da próstata PC3 e DU145, e a linha celular epitelial da mama não-tumorigénico MCF10A. Nenhuma destas linhas de células expressaram niveis elevados de Wee1 (Figura 4A), e, como esperado, nenhum era sensível a Wee1 segmentação (Figura 4b e 4c).

a. A análise Western blot de lisados ​​preparados a partir de HeLa, CAL51, MCF7, A549, NCI-H226, PC3, DU145 e células MCF10A. Um anticorpo que reconhece Wee1 foi usado com β-tubulina como controlo de carregamento. Wee1 expressão é aumentado significativamente em células HeLa e em comparação com CAL51 MCF7, A549, NCI-H226, PC3, células DU145 e MCF10A. b. Painel esquerdo: ensaio de viabilidade celular em células transfectadas com Wee1 ONTARGETplus SmartPool ou ONTARGETplus siControl. Wee1 silenciamento foi selectivamente letal para as células HeLa sobre-expressam Wee1 e CAL51. As barras de erro representam o SEM de transfecções em triplicado. Painel da direita: análise de Western blot de lisados ​​preparados a partir de células CAL51 transfectadas com Wee1 ONTARGETplus SmartPool ou ONTARGETplus siControl. Um anticorpo que reconhece Wee1 foi usado com β-tubulina como controlo de carregamento. Wee1 ONTARGETplus SmartPool reduziu significativamente a expressão da proteína Wee1 em comparação com células transfectadas siControl. c. ensaio de viabilidade celular em células tratadas com inibidor de Wee1. Wee1 inibição foi selectivamente letal para as células HeLa sobre-expressam Wee1 e CAL51. As barras de erro representam o SEM de tratamentos com células em triplicado. d. Painel esquerdo: análise Western blot dos lisados ​​preparados a partir de células tratadas com inibidor de Wee1 5 uM para 0, 6, 24 e 48 horas. Um anticorpo que reconhece PARP foi usado com β-tubulina como controlo de carregamento. Após 24 horas Wee1 inibição de PARP induzida por clivagem (Clvd PARP) em células HeLa sobre-expressam Wee1 e CAL51 mas não induziu a clivagem de PARP em células MCF7 e NCI-H226 que expressam Wee1 em níveis normais. painel do lado direito: Caspase 3,7 atividade em células tratadas com o inibidor Wee1 5 � durante 24 horas. Wee1 inibição induzida por activação da caspase em 3,7 Wee1 superexpressando células HeLa e CAL51 mas não induziu activação de caspase 3,7 em células MCF7 e NCI-H226 que expressam Wee1 em níveis normais. As barras de erro representam o SEM de tratamentos com células em triplicado. e. painel da mão esquerda: análise de Western blot de lisados ​​preparados a partir de células transfectadas com Wee1 ONTARGETplus SmartPool ou ONTARGETplus siControl. Um anticorpo que reconhece PARP foi usado com β-tubulina como controlo de carregamento. O silenciamento de Wee1 induziu clivagem da PARP em células HeLa sobre-expressam Wee1 e CAL51 mas não induziu a clivagem de PARP em células MCF7 e NCI-H226 que expressam Wee1 em níveis normais. painel do lado direito: Caspase 3,7 atividade em células transfectadas com Wee1 ONTARGETplus SmartPool ou ONTARGETplus siControl. Silenciamento de Wee1 induzida ativação caspase 3,7 em Wee1 superexpressão células HeLa e CAL51 mas não induziu caspase 3,7 ativação em células MCF-7 e NCI-H226 que expressam Wee1 em níveis normais. As barras de erro representam o SEM de transfecções triplicadas.

Em conjunto, nossos resultados fornecem evidências que sugerem que as linhas de células que apresentam níveis mais elevados de expressão Wee1 são sensíveis à inibição Wee1. Para investigar o mecanismo de sensibilidade nestas linhas celulares, foram examinados os níveis de apoptose seguintes inibição Wee1. inibição química de Wee1 causou apoptose apenas em linhas de células com níveis mais elevados de expressão Wee1 (Figura 4d), uma observação confirmada também pela utilização de Wee1 siRNA (Figura 4E).

significância clínica de Wee1

Os nossos dados sugerem que a superexpressão Wee1 pode ser essencial para a viabilidade de células tumorais. Portanto, nós interrogado a expressão de Wee1 em conjuntos de dados publicamente disponíveis que detalham os perfis das linhas humanas de tumor da mama celulares e tumores [22], [23] expressão. Esta análise demonstrou que a expressão correlaciona-se com Wee1

Wee1

número de cópias do gene (Spearman, p = 0,039) e mostra uma tendência (teste t P = 0,06, teste de Mann-Whitney p = 0,07) para a expressão mais elevada em linhas de células com um fenótipo luminal (dados não mostrados). Com base nestes dados, examinámos a expressão Wee1 por imuno-histoquímica (IHC). Expressão de Wee1 avaliada por IHC, em peletes de linhas de células embebidas em parafina fixadas com formalina correlacionada com a expressão medido por transferência de Western, proporcionando uma prova da especificidade do anticorpo Wee1 (Figura 5a). Em seguida, examinaram uma série bem anotada de tumores da mama [24], [25] e constatou que 35% exibiram níveis de expressão semelhantes aos Wee1 de células CAL51, que são sensíveis à inibição Wee1 (Figura 5b). Além disso, níveis elevados de expressão foram preferencialmente Wee1 encontrada em cancros da mama com um fenótipo luminal, tal como definido por Nielsen et al. [26], consistente com a análise de linhagens celulares de cancro da mama. No âmbito dos nossos dados anteriores implicam Wee1 como alvo o cancro, estes dados imuno-histoquímicos sugerem que o uso de inibidores de Wee1 pode ser apropriado em um subconjunto significativo de doentes com cancro da mama.

a. coloração imuno-histoquímica Wee1 em, linhas celulares fixados em formalina e embebidos em parafina de câncer de mama e câncer de mama invasivo. Observe os baixos níveis de expressão Wee1 em H226 células e um cancro da mama basal-like e os altos níveis de expressão Wee1 em células CAL51 e luminal e cânceres de mama HER2. (Coloração Harris Hematoxilina /DAB; ampliação original × 200). b. Altos níveis de expressão Wee1 são preferencialmente expresso em cancros da mama luminal. Capas foram pontuados de acordo com o sistema de pontuação Allred [36] tal como descrito nos materiais e métodos. Para cada tumor digite a porcentagem de tumores com expressão alta Wee1 é mostrado. expressão alta Wee1 mostrou uma correlação direta estatisticamente significativa com a expressão de receptores de estrogênio e progesterona e ciclina D1, e uma significativa correlação inversa com o tamanho do tumor, grau histológico e expressão do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), citoqueratina (Ck) 14, Ck 5 /6, Ck 17, MIB-1 índice de marcação e caveolinas 1 e 2. Não houve correlação entre a expressão Wee1 imuno-histoquímica e presença de invasão linfo-vascular, metástase linfonodal, expressão HER2 ou amplificação do gene, a expressão da p53 e

CCND1

e

MYC

amplificação do gene foi encontrado [24], [37] (dados não mostrados). Todos os casos foram classificados em luminais, grupos de HER2 e basal-like de acordo com o painel de imunohistoquímica descrito por Nielsen et al. [26].

Discussão

A maioria das aprovações de novos medicamentos para o tratamento do câncer com base em objectivos existentes. Em vez de refletir uma ausência de alvos, este é talvez indicativo do custo eo tempo envolvidos na identificação de novas abordagens terapêuticas. triagem RNAi paralelo pode permitir que um simples de alto rendimento, abordagem, para a identificação funcional de metas, e outros também têm usado triagem RNAi paralela para identificar potenciais condutores de tumorigénese e candidatos metas [27]. Nossa identificação de

PIK3CA

, um oncogene conhecido e alvo terapêutico, usando telas de RNAi paralelas fornece fortes evidências circunstanciais para esta abordagem. Além disso, melhorias na tecnologia de RNAi pode fazer RNAi paralelo rastreio de um processo muito mais simples e de baixo custo [28], [29]. telas de RNAi paralelas, quando combinado com o companheiro se aproxima, como perfil de expressão, perfil genômico e alto throughput análise histopatológica e imuno-histoquímica têm o potencial para identificar potenciais alvos que são dignos de uma investigação mais aprofundada. No caso de Wee1, uma combinação de triagem RNAi, perfis de transcrição, perfilamento genómica e análise histológica levou à identificação de um subconjunto paciente (cancro da mama luminal), em que a inibição desta cinase pode ser explorada como uma estratégia terapêutica potencial. Incorporando essa abordagem para o processo de identificação do alvo da droga convencional tem o potencial para agilizar o desenvolvimento de novas terapias.

Materiais e Métodos

As linhas celulares, compostos, plasmídeos e siRNA

MCF7, CAL51, HeLa, A549, NCI-H226, PC3, células DU145 e MCF10A foram obtidas de ATCC (EUA) e mantidos de acordo com as instruções do fornecedor. inibidor Wee1 (681637) foi obtido a partir de Calbiochem (Reino Unido). células MCF7 e Hela foram transfectadas com ARNsi SmartPool usando o reagente de transfecção Dharmafect 3; As células A549 e NCI-H226 foram transfectadas com ARNsi SmartPool Dharmafect usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante (Dharmacon). CAL51 células foram transfectadas com ARNsi SmartPool usando o reagente de transfecção Oligofectamine de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). células DU145 foram transfectadas com ARNsi SmartPool utilizando Lipofectamina 2000 o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). A biblioteca de siRNA quinase (siARRAY – segmentação 779 genes de proteína-quinase humanos conhecidos e putativos) foi obtido em dez placas de 96 poços a partir de Dharmacon (EUA). Cada poço nesta biblioteca continha um SmartPool de quatro espécies distintas de ARNsi dirigidos a diferentes sequências do transcrito alvo. Cada placa foi suplementado com siCONTROL (dez poços, Dharmacon (EUA)). O Wee1 ONTARGETplus SmartPool e ONTARGETplus siControl foram obtidos a partir Dharmacon (EUA)

foram utilizados anticorpos

Os anticorpos que se dirigem aos seguintes epítopos:. Wee1 (4936, Cell Signaling, UK), PARP (9542, Cell Signaling, Reino Unido) e β-tubulina (T4026, Sigma, Reino Unido). Todos os anticorpos secundários utilizados para análise de Western blot foram conjugado com HRP.

siARN método tela

células plaqueadas em placas de 96 poços foram transfectadas 24 horas mais tarde com ARNsi (concentração final 100 nM), como por fabricante de instruções. Cada placa siARN foi suplementado com 10 poços de siControl. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tripsinizadas e divididas em três placas de réplicas idênticas. O meio foi reposto após 48 horas e 96 horas, e a viabilidade das células foi avaliada após sete dias, utilizando CellTiter Glo Luminescent Ensaio de viabilidade celular (Promega, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados de cada linha celular foi processado como se segue: a leitura de luminescência de cada poço numa placa de registo era

2 transformada e expressa em relação ao valor de luminescência médio de todos os poços na mesma placa (placa de centragem). Estes dados foram então normalizados de acordo com a média dos dados da tela inteiras, utilizando-se o desvio absoluto médio (MAD) para estimar a verdadeira variação dentro de cada ecrã [30]. Esta normalização representado o efeito de cada SmartPool em cada linha celular como uma pontuação Z [30] e permitiu que os efeitos de cada SmartPool na viabilidade para ser comparados entre o painel de linha celular. AZ score≤-3 foi feita como o limiar de significado para a viabilidade celular reduzida, representando três de assistência médica a partir da mediana e aproximando-se de três desvios padrão.

Transcrição perfis

O ARN foi extraído a partir de linhas celulares com Trizol e fenol /clorofórmio, seguido de extracção por precipitação com isopropanol. Para a linha de células alcance, foram realizadas extrações triplicado e perfis. A biotina marcado com ARNc foi produzido por meio de um kit de amplificação linear (IL1791; Ambion, Austin, TX, https://www.ambion.com), utilizando 250 ng de ARN total de qualidade comprovada como entrada. hibridações Chip, lavar, Cy3-estreptavidina (Amersham Biosciences) coloração e varredura foram realizadas em um Illumina BeadStation 500 (San Diego, https://www.illumina.com) plataforma utilizando reagentes e seguindo protocolos fornecidos pelo fabricante. amostras ARNc foram hibridadas em Illumina humanos-6 v2 BeadChips, cobrindo aproximadamente 47.000 transcritos RefSeq. A distribuição aleatória de grandes populações de esferas revestidas com oligonucleotídicas entre as posições disponíveis dentro do 6-V2 humano de chip permite que, em média, as medições de intensidade de 30 por RefSeq, dando origem a avaliações quantitativas da expressão do gene [15]. Todas as análises base de dados de expressão foi realizada utilizando o software do fabricante BeadStudio 3.1. Illumina perfis de expressão foram realizadas em triplicado, os dados em bruto foram, em seguida, transformado variância de estabilização e de spline robusta normalizados utilizando o pacote de software de lumi no Bioconductor [31], [32]. valores de expressão para cada amostra foram mediana escalados e o valor da expressão média foi estabelecida ao longo dos três repetições. Genes com diferença significativa da expressão entre as linhas celulares foram identificados por análise unidireccional da variância (ANOVA). Estes dados de perfis transcrição está agora disponível publicamente (adesão ArrayExpress: E-TABM-610)

Correlação da pontuação siRNA Z com a expressão do gene

A correlação entre pontuação siRNA Z e expressão gênica normalizada era. examinados para os genes onde siARN causadas perda significativa da viabilidade (Z -3). pontuação Z foi comparado a expressão do gene normalizado por meio do coeficiente de correlação de Pearson. Um gene foi tomado como sendo significativamente correlacionada se o coeficiente de correlação de Pearson foi significativamente diferente da hipótese nula, a correlação foi inverso, e a variação na expressão do gene entre as linhas celulares foram significativamente diferentes tal como avaliado por ANOVA de uma via.

arrayCGH método de análise

o ADN genómico foi extraído de linhas celulares utilizando o kit de DNA QIAamp sangue Mini (51104, Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. análise de CGH-base Microarray foi realizada em um caminho 32K azulejos BAC plataforma de matriz in-house como descrito anteriormente [33], [34]. Para número de cópias correlações, a média de peso de adaptação suavizada (AWS) foram utilizados índices de BACs contendo o gene de interesse para as correlações número de cópias, e copiar número atribuído como descrito anteriormente [35]. Resumidamente, a AWS alisou valores -0,12 foram classificados como perdas, aqueles 0,12 como ganhos, e aqueles entre a forma inalterada. Amplificações foram definidos como valores da razão log2 suavizadas 0,4 [35]. processamento e análise de dados foram realizados em I 2.0.1 (https://www.r-project.org/) e BioConductor 1,5 (https://www.bioconductor.org/), fazendo uso extensivo de versões modificadas da pacotes aCGH, Marray e AWS, em particular.

ensaio de viabilidade celular para medir Wee1 siRNA sensibilidade

células plaqueadas em placas de 96 poços foram transfectadas 24 horas depois com Wee1 ONTARGETplus SmartPool ou ONTARGETplus siControl (concentração final 100 nM), conforme as instruções do fabricante. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tripsinizadas e divididas em três placas de réplicas idênticas. O meio foi reposto após 48 horas e 96 horas, e a viabilidade das células foi avaliada após sete dias, utilizando CellTiter Glo Luminescent Ensaio de viabilidade celular (Promega, EUA) e expressa em relação à média de luminescência nos poços transfectadas com siControl.

celular ensaio de viabilidade para medir a sensibilidade ao fármaco

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços e expostas a várias doses de inibidor de Wee1 (Calbiochem, Cat. No. 681637, 4- (2-fenil) -9-hidroxipirrolo [3, 4-c] carbazol-1,3- (2H, 6H) -diona (PHCD)) [21]. A viabilidade celular foi avaliada por CellTiter Glo Luminescent Ensaio de viabilidade celular (Promega, EUA) 48 horas mais tarde e fracção sobrevivente para cada dose da droga avaliada pela divisão do valor da luminescência do fármaco tratado pelo valor de luminescência de veículo.

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