Abstract

Os estudos clínicos sugerem que as respostas a proteína de fusão HPV16 E6E7L2 (TA-CIN) a vacinação por si só são modestos, e GPI-0100 é um bem-tolerado, potente adjuvante. Aqui procuramos otimizar tanto a imunogenicidade de TA-CIN através de formulação com GPI-0100 e tratamento de HPV16 + câncer através da vacinação após quimioterapia com cisplatina. HPV16 títulos de anticorpos neutralizantes no soro, proliferativa de células T CD4 + e as respostas de células T CD8 + E6 /E7-específicas foram significativamente aumentada quando os ratinhos foram vacinados por via subcutânea (s.c.) ou intramuscularmente (i.m.) com TA-CIN formulado com GPI-0100. A vacinação foi testado para a terapia de ratinhos portadores singeneicos HPV16 E6 /E7 + tumores (CT-1), quer no pulmão ou por via subcutânea. Os ratos tratados com TA-CIN vacinação /GPI-0100 exibiu respostas de células CD8 específicas robustos-E7 + T, que foram associados com a carga tumoral reduzida no pulmão, ao passo que os ratinhos que receberam qualquer um dos componentes só foram semelhantes aos controles. Desde a vacinação por si só não foi suficiente para a cura, camundongos com s.c. TC-1 de tumor foram primeiro tratados com duas doses de cisplatina e, em seguida, vacinados. A vacinação com i.m. TA-CIN /GPI-0100 crescimento do tumor substancialmente retardado e sobrevivência prolongada após terapia com cisplatina. A injeção de TA-CIN sozinho, mas não GPI-0100, no tumor (i.t.) foi igualmente eficaz após terapêutica com cisplatina, mas os ratos finalmente sucumbiu. No entanto, observou-se a regressão do tumor e remissão prolongada em 80% dos ratinhos tratados com cisplatina e a vacinação, em seguida, intra-tumoral, TA-CIN /GPI-0100. Estes ratinhos também exibiu robusta e células T CD8 + HPV16 E7 específicos de respostas de anticorpos neutralizantes. Assim formulação de TA-CIN com GPI-0100 e entrega intra-tumoral após o tratamento com cisplatina provoca respostas terapêuticas potentes num modelo murino de HPV16 + câncer

Citation:. Peng S, Wang JW, Karanam B, Wang C, huh WK, Alvarez RD, et al. (2015) Sequential Cisplatina Terapia e vacinação com HPV16 E6E7L2 proteína de fusão em saponina Adjuvante GPI-0100 para o tratamento de um cancro Modelo HPV16 +. PLoS ONE 10 (1): e116389. doi: 10.1371 /journal.pone.0116389

editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japão

Recebido: 15 Agosto, 2014; Aceito: 08 de dezembro de 2014; Publicação: 05 de janeiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. O estudo foi financiado por doações da Fundação V (www.jimmyv.org) para SP e RBSR e Serviço de Saúde Pública (subvenções. nih.gov) concede P50 CA098252 a TCW, SR1 CA133749 a WKH e CA118790 a RBSR. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. RBSR é um inventor de patentes relacionadas-L2 (aplicação US 20090047301 Papilomavírus L2 N- Peptídeos de terminal para a indução de peptídeos Amplamente anticorpos neutralizantes cruzados e aplicação de US 20130177585 PAPILOMAVIRUS L2 N-terminal para a indução da cruzada ampla e anticorpos neutralizantes) licenciados para Shantha Biotechnics Ltd., GlaxoSmithKline, PaxVax, Inc. e Acambis, Inc. RBSR e TCW são fundadores de Papivax LLC e conselheiros científicos para Papivax Biotech Inc. Os termos desses acordos são geridos pela Johns Hopkins University, em conformidade com o seu políticas de conflito de interesse. Isto não altera os autores ‘adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

‘ ‘papilomavírus humano de alto risco (hrHPV) causam 5,2% de todos os cânceres em todo o mundo [ ,,,0],1]. Enquanto a infecção persistente hrHPV é uma causa necessária do câncer, a grande maioria das infecções são espontaneamente apuradas pela imunidade do hospedeiro. A prevenção secundária através de programas citológicos e de rastreio de HPV e de intervenção reduziram a incidência do cancro do colo do útero por um valor estimado de 80% nos países desenvolvidos e agora duas vacinas contra o HPV preventivas alvejar os dois mais prevalente dos 14 tipos hrHPV, HPV16 e HPV18. HPV16 é o genótipo presente em 50-60% dos cancros do colo do útero, em 87% dos HPV + carcinomas de orofaringe [2], em 55% e 76% do HPV + carcinomas vaginais e vulvares invasivos [3], e em 73% de câncer anal [ ,,,0],4]. A eficácia e segurança substancial de vacinas contra o HPV licenciadas para a prevenção de novas infecções HPV16 e HPV18 está bem documentada [5]. No entanto, a protecção conferida por essas vacinas comercialmente disponíveis é geralmente tipo restrito [6], e as taxas de vacinação, infelizmente, permanecem baixos nos países em desenvolvimento. Mais importante, estas vacinas não têm actividade terapêutica para esses pacientes com infecção por HPV persistente e HPV estabelecida associada displasia cervical [7], a vacinação de HPV terapêuticos tem o potencial para aumentar a eficácia de terapias não específicas, cirúrgicos e de ablação convencional de neoplasia de alto grau, ou mesmo quimioradioterapia de HPV + cânceres invasivos. Apesar da utilização de cisplatina e /ou terapia de radiação [8], a sobrevivência de pacientes de cancro do colo do útero avançada de cinco anos permanece 30%. Assim, estratégias de tratamento específicas, como vacinação contra o HPV terapêutica, são necessárias para melhorar os resultados em pacientes com câncer cervical avançado [9].

O candidato terapêutica vacina contra o HPV TA-CIN é uma proteína recombinante que compreende uma fusão de HPV16 oncoproteínas E6, E7 e L2 proteína menor da cápside que é purificado a partir de

e. coli

[10]. E6 e E7 são oncoproteínas virais alvos promissores para imunoterapia, sendo expressos em todas as células infectadas, necessários para a viabilidade de células de cancro HPV + e ausente das células hospedeiras normais. A proteína menor da cápside L2 não é expresso de forma detectável em células HPV + cancerosas, mas é um antigénio potencial terapêutico para lesões precursoras [11], [12], [13]. Além disso L2 contém epitopos neutralizantes conservados e tem potencial como um antigénio de HPV em geral profilático [14]. Três imunizações mensais de voluntários saudáveis ​​com TA-CIN, sem adjuvante, induziu uma anticorpos neutralizantes no soro específicos de L2 e as respostas proliferativas das células T de uma forma dependente da dose [15]. E6 e E7-imunidade específica de células T CD8 foi detectada por ELISPOT de IFN-y em 8 dos 11 indivíduos avaliáveis ​​na dose mais elevada, embora E6 foi o antigénio dominante. No entanto, a resposta global foi modesto, sugerindo a necessidade de um adjuvante [16], [17] ou heteróloga o reforço com um vector viral recombinante [18], [19], [20].

Proteína baseada vacinação sem um adjuvante normalmente induz respostas imunes fracas. GPI-0100 é um potente adjuvante derivadas modificando saponinas naturais seleccionados [21] para eliminar porções acilo relativamente tóxicos e instáveis, e da introdução de um radical lipofílico [22], [23]. As doses de 100 ug a 5000 ug de GPI-0100 foram testados com vários antigénios em ensaios clínicos de fase precoce e foram bem toleradas [21], [24]. A vacinação de macacos com TA-CIN, em combinação com o adjuvante GPI-0100 (TA-CIN /GPI-0100) também foi bem tolerada e induziu títulos de anticorpos neutralizantes robustas contra HPV16, com respostas menores contra outros tipos de HPV testados, e respostas de células T para HPV16 E6 e E7 [16]. Formulação de TA-CIN com GPI-0100 profundamente melhorado a resposta de anticorpos neutralizantes e ratos protegidos de desafio experimental pele com pseudoviriões HPV16 que proporcionam um repórter luciferase. Inclusão de GPI-0100 também intensificou a resposta específica de E7-CD8 das células T à vacinação TA-CIN e protegeu os ratinhos do desafio com a linha de células TC-1, uma /E7 + modelo de tumor murino HPV16 E6 [16]. No entanto, a sua actividade terapêutica contra o tumor estabelecido não foi testado.

estudos recentes sugerem que a imunização locais é importante para eliciar uma resposta imunitária celular que casas de volta para o local relevante e que a quimioterapia pode melhorar a resposta imunitária em parte pela encolhimento carga da doença, libertando antigénios tumorais e transientemente modificação do microambiente imunológico dentro do tumor [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]. O tratamento com cisplatina e /ou radiação de baixa dose pode aumentar a potência de vacinas contra o HPV terapêuticos em modelos de rato [32], [33], [34]. O tratamento concomitante com cisplatina e a injecção intratumoral (IT) de péptido E7 em ratinhos C57BL /6 portadores de significativamente mais específicos de E7 de IFN-γ secretoras CD8

+ células T TC-1 tumores gerados E6 /E7-expressam e pode curar muitos ratos, ao passo que aqueles tratados com a terapia por si só não gerar o controlo do crescimento do tumor semelhante. Importante, a administração subcutânea do crescimento do tumor controlado péptido E7 menos eficaz do que a administração intratumoral, indicando que a entrega de antigénio para o microambiente do tumor aumenta a iniciação de uma resposta de células tumorais específicas do antigénio T CD8 + imunitária após quimioterapia [34]. o tratamento com cisplatina também transitoriamente induziu uma acumulação significativa das células dendríticas (DC) no microambiente tumoral. Além disso, a injecção intratumoral de péptido antigénico conduziu à absorção do péptido E7 pelo CD11c + DC e migração das DCs carregadas com péptido E7 para os nódulos linfáticos de drenagem [34]. As DC carregadas com péptido E7 no nódulo linfático de drenagem pode activar as células T CD8 + específicas de E7-. Importante, este marcado aperfeiçoamento de células específicas de E7-T CD8 + em circulação e os efeitos anti-tumor também foi observada quando TC-1 ratos portadores de tumores foram tratados com cisplatina e intratumoral vacinação TA-CIN [35].

O nosso prévio estudos em ratinhos e macacos apoiar a segurança e potência das GPI-0100 como um adjuvante para TA-CIN, mas não examinou seu impacto sobre a atividade terapêutica [16]. Aqui comparamos a vacinação só e cisplatina seguido de vacinação intratumoral ou intramuscular TA-CIN formulado com adjuvante GPI-0100 para o tratamento de tumores estabelecidos TC-1.

Declaração de Ética Materiais e Métodos

A linha de células derivadas de humano 293TT é usado neste estudo. Esta linha celular foi previamente descrito [37], [38]. Os estudos em animais foram realizados de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e com a aprovação prévia do Comité de animal Cuidado e Uso de Johns Hopkins University (MO14M43). Os ratinhos foram monitorizados pelo menos três vezes por semana, e terminais humanas foram usadas em estudos de sobrevivência; camundongos foram sacrificados mediante encargos excesso de tumor (≥2 cm de diâmetro ou ulceração), ou a primeira evidência de sofrimento como a perda de peso (≥10%), letargia, má qualidade casaco, sensibilidade à luz, aninhamento ou arranhões. Os ratinhos foram anestesiados com inalação de isoflurano, sacrificados por asfixia com dióxido de carbono e morte assegurado por deslocamento cervical.

Ratos

/6 ou BALB /c fêmeas C57BL 5~8 semanas de idade foram adquiridos a partir da National Cancer Institute (Frederick, MD) e alojados durante, pelo menos, uma semana antes do estudo. Todos os ratos foram mantidos a Johns Hopkins University School of Medicine (Baltimore, MD) instalação de centro de câncer animal nas condições gratuitos específicos do micróbio. Os ratos foram mantidos 5 por gaiola microisolator com alimentos e roupas de cama estéril, trocados semanalmente, e randomizado por gaiola.

Peptídeos anticorpos e reagentes

O H-2K

b-restrito HPV16 E6aa50-57 péptido, YDFAFRDL, e H-2D

b-restrito péptido HPV16 E7aa49-57, RAHYNIVTF foram sintetizados por Recursos Macromoleculares (Denver, CO), a uma pureza de ≥80%. FITC ou PE-conjugado anti-rato CD4 (clone RM4-5) e CD8a (clone 53.6.7), e conjugado com FITC anti-ratinho de IFN-γ (clone XMG1.2) anticorpos foram adquiridos da BD Pharmingen (San Diego, CA). PE-conjugado, péptido HPV16 E7aa49-57 carregado H2-D

b tetrâmeros foram obtidos do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas Facility tetrâmero. acetato de medroxiprogesterona foi comprado de Greenstone LLC (Peapack, NJ), e 4% de nonoxinol-9 (N-9) foi adquirido a partir de reviver empresa de produtos pessoais (Madison, NJ). A cisplatina, o Tween-40 e manitol foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO).

Células

células TC-1 de HPV-16 de E6 e E7-expressando foram geradas como previamente descrito [ ,,,0],36]. células de carcinoma do cólon CT26 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células foram mantidas em meio RPMI suplementado com glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, 100 IU /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS). 293TT células foram cultivadas em meio DMEM contendo glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, 100 IU /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina e 10% de FBS [37].

Vacina e formulação

TA-CIN foi descrito anteriormente e foi gentilmente cedido pela Technology Research Cancer, Reino Unido [15]. GPI-0100 foi generosamente fornecidos pela Hawaii Biotech Inc. (Aiea, HI). Para os estudos de vacinação, TA-CIN (31,25 ug /ml) foi formulado com GPI-0100 (250 ug /mL), por si só ou com qualquer um de Tween-40 (4 mg /ml), ou manitol (50,7 mg /mL) em 0,025 M de tampão de fosfato de sódio (pH 7,2). Para preparar a vacina para injecção intra-tumoral, TA-CIN (312,5 ug /ml) foi formulado com GPI-0100 (2500 ug /mL) juntamente com manitol (50,7 mg /mL) em tampão de fosfato de sódio 0,025 (pH 7,2). A vacina formulada foi incubado durante a noite num agitador suave a 4 ° C antes de usar. A formulação congelada de TA-CIN /GPI-0100 incluídos manitol, e após incubação durante a noite, foi dividida em aliquotas e congelada usando gelo seco /isopropanol. As alíquotas foram então armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.

Produção de HPV16 e HPV58 pseudovírus e neutralização ensaio

Pseudoviruses (PSV) foram produzidas por co-transfecção de células 293TT [37] , [38] com plasmídeos que codificam HPV L1 e L2 e plasmídeo repórter que expressam quer fosfatase alcalina segregada (SEAP) ou luciferase de pirilampo [39], [40]. ensaios de neutralização com base pseudovirus-SEAP foram realizados como descrito anteriormente [38]. Resumidamente, PSV SEAP HPV16 foram incubadas com soros titulada rato (começando diluição de 1:50) ou 4 ul de RG-1 positivo anticorpo monoclonal de controlo (1,1 mg /mL) durante 2 horas a 37 ° C antes da adição às células 293TT. As células foram então incubadas durante 72 horas, e os sobrenadantes foram recolhidos. actividade da SEAP foi medida por meio do método de ensaio colorimétrico. Os títulos de neutralização de soro foram definidos como a diluição mais elevada que resultou em pelo menos 50% de redução de actividade SEAP em relação ao vírus únicos controles de infecção.

intracelular de citocinas coloração e citometria de fluxo análise

Para detectar HPV16 E6 ou E7-CD8 específicas,

+ T respostas de células através de coloração intracelular de IFN-γ, os esplenócitos foram estimuladas com péptido HPV16 E6aa50-57 ou E7aa49-57 (1 ug /ml) na presença de GolgiPlug (BD Pharmingen, San Diego , CA) a 37 ° C durante a noite. Para detectar CD4

+ e CD8

+ respostas de células T específicas TA-CIN-, os esplenócitos foram estimulados com 10 ng /mL de proteína TA-CIN, durante 24 horas a 37 ° C. GolgiPlug foi então adicionado às células e incubou-se ainda mais durante a noite a 37 ° C. Quando foram utilizadas células transfectadas com CT26 L2 de HPV16, as células CT26 foram transfectadas com o plasmídeo primeiro codão que codifica optimizado-L2 de HPV16 [41] utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os esplenócitos foram depois co-cultivadas com células transfectadas L2 de HPV16 CT26 com o rácio de 10:01 E:T na presença de GolgiPlug a 37 ° C durante a noite. Os esplenócitos estimulados foram então lavadas uma vez com PBS contendo BSA a 0,5% e coradas quer com PE-conjugado anti-rato CD4 ou CD8 anticorpo. As células foram permeabilizadas e fixadas com o kit Cytofix /Cytoperm de acordo com as instruções do fabricante (BD Pharmingen, San Diego, CA). Intracelular IFN-γ foi corado com anti-rato conjugado com FITC de rato IFN-γ. Citometria de fluxo foi realizada utilizando FACSCalibur citômetro de fluxo com o software CellQuest (biociências BD, Mountain View, CA).

tetrâmero coloração

Para a coloração tetrâmero, PBMC de ratos foram marcadas com anti-purificada rato CD16 /32 (bloco Fc, BD Pharmingen, San Diego, CA) em primeiro lugar, e depois coradas com anti-rato CD8-FITC, conjugado com PE, péptido HPV16 E7aa49-57, RAHYNIVTF carregado H2-D

b tetrâmero em 4 ° C. Após lavagem, as células foram coradas com 7-AAD, antes da análise de citometria de fluxo para excluir as células mortas. As células foram adquiridos com FACSCalibur citometria de fluxo e analisados ​​com software CellQuest.

A transferência passiva de mouse ou soros macacque e vaginal HPV PSV desafio

Para estudos de transferência passiva, grupos de ratinhos BALB /c fêmeas (n = 5) foram injectados com 3 mg de medroxiprogesterona subcutaneamente quatro dias antes do desafio PSV vaginal. Um dia antes do desafio vaginal, 90 uL de cada soro de controlo ou TA-CIN vacinados ratinhos BALB /c fêmeas foram reunidas nos respectivos grupos com um adicional de 150 ul de PBS (volume total de 600 uL). Como um controlo positivo, o anticorpo monoclonal de rato RG-1 foi utilizada em três alta separada doses- (50 ug /rato), médio (25 ug /ratinho) e de baixo (12,5 ug /ratinho). Subsequentemente, 100 mL da respectiva mistura de soros ou RG-1 foi, em seguida, doses injectadas i.p. em cada ratinho do grupo respectivo. Às 24 horas após a transferência passiva, desafio vaginal com HPV PSV foi realizada como descrito anteriormente [42] usando ~ 10

8 viral equivalente genômica (VGE) unidades /mouse. Três dias depois de HPV PSV desafio, a expressão de luciferase na cúpula vaginal foi adquirido com um imager Xenogen IVIS 100 (Caliper Life Science, Hopkinton MA) e analisados ​​com imagem Vivendo 2,5 software. Os mesmos passos foram realizados estudos para transferência passiva utilizando soros de 3 macacos (I.D 746, 811 ou 831) terceira vacinação, quer pré ou pós com TA-CIN + GPI-0100 gerado num estudo anterior [16]. 100 ul de soros pré-imune (diluição = 1:200, com base no rato estimativa do volume de sangue de 2 mL) ou soro de vacinados foi titulada com uma série de diluições do 1:200-1:2000 foi transferida passivamente por via i.p. em grupos de ratinhos não afectados (n = 5). No dia seguinte, os ratos foram desafiados intravaginalmente com HPV58 PSV e fotografada 72 horas depois de avaliar a infectividade.

estudos de tratamento de TC-1 células tumorais hematogeneosuly propagação

camundongos C57BL /6 foram injectados com 5 × 10

4 de células TC-1 por via intravenosa. Para testar o efeito anti-tumoral induzida pela vacinação, 3 dias mais tarde, os ratinhos foram vacinados tr vezes com o regime indicado. Quando os ratos não tratados mostraram sinais de doença (ver declaração de ética), todos os ratos foram sacrificados, e os esplenócitos foram preparados para detectar HPV16 E6 ou E7 ou CD4 específica TA-CIN-

+ e CD8

respostas de células + T. Os pulmões foram retirados para verificar o crescimento do tumor. Alternativamente, PBMCs e soro foram coletadas de ratos para a análise de HPV16 E7 específicos de CD8

+ T respostas de células com coloração tetrâmero ou título de anticorpos neutralizantes específicos de HPV16 com HPV16-SEAP PSV respectivamente.

Tratamento estudos de injecção subcutânea TC-1 tumor

1 × 10

5 de TC-1 células de tumor foram injectados subcutaneamente em ratinhos C57BL /6. No dia 5 e 12 após o desafio de células de tumor, os ratinhos foram injectados com 5 mg /kg de cisplatina ou soro fisiológico por via intraperitoneal. Um dia após a cisplatina ou soro fisiológico injecção, os ratos foram deixados não tratadas, ou vacinados com apenas GPI-0100 ou somente TA-CIN, ou TA-CIN mais GPI-0100 intratumoral. Um grupo de murganhos tratado com cisplatina foi vacinado com TA-CIN mais GPI-0100 por via intramuscular. Um volume de 200 ul foi utilizado para todos os estudos de vacinação, excepto 20 uL para a vacinação intratumoral. Os ratinhos foram reforçados duas vezes com o mesmo regime. O crescimento do tumor foi monitorizado por inspecção visual e a medição do diâmetro do tumor com calibradores duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula [O maior diâmetro x (diâmetro perpendicular)

2] × π /6. a sobrevivência do tumor foi registrada como morte natural ou um diâmetro tumor maior do que 2 cm.

A análise estatística

Os dados imunidade mediada por células foram expressos como média ± desvio padrão (SD). As comparações entre grupos utilizada

t

teste de Student. distribuições de sobrevivência para ratos em diferentes grupos foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas com o teste log-rank. Para as experiências de transferência passiva, os dados foram expressos em termos de percentagem de infecção média ± erro padrão (SE). Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. ajuste multiplicidade não foi considerado por causa da natureza exploratória da análise de dados.

Resultados

GPI-0100 aumenta significativamente as respostas das células e tumor terapia HPV16 E7 específicas de CD8 + T induzida por TA-CIN

Nós já demonstraram que a formulação de TA-CIN com GPI-0100 aumenta significativamente ambos os títulos de anticorpos neutralizantes no soro específicos de HPV16 e respostas de células T CD8 + específicas de E7-a vacinação subcutânea de camundongos normais [16]. Para testar se diferentes lotes de GPI-0100 e TA-CIN pode gerar dados semelhantes, nós vacinados ingênuo camundongos C57BL /6 com dois lotes diferentes de cGMP de TA-CIN (0847FP e 0861FP) formuladas com três diferentes lotes de cGMP de GPI-0100 ( 0400806, e 0400306R 0400106R) por via subcutânea. Não se observou qualquer diferença significativa tanto para o título de anticorpos de neutralização específicos de HPV16 e respostas de células T CD8 + E6 /E7-específicas (dados não mostrados). Desde rota vacinação pode ter impacto sobre a resposta imune, que também comparou a imunogenicidade de TA-CIN formulado com GPI-0100 que foi dada por qualquer via subcutânea (s.c.) ou intramuscular (i.m.). Não foi observada diferença significativa para qualquer neutralização de soro título específico do HPV16 anticorpo ou respostas de células T CD8 + E6 /E7-específicas (S1 Fig.).

Em nosso estudo anterior, a vacinação com TA-CIN formulado com GPI- 0100 ratinhos completamente protegidos de um desafio subsequente por via subcutânea com o modelo de HPV16 E6 /E7-expressando um tumor TC-[16], mas o tratamento de tumores pré-existente e metastático TC-1 não foi testado. A injecção de células CT-1, na veia da cauda (i.v.) conduz ao seu estabelecimento nos pulmões, fornecendo um modelo de HPV16 metastática pulmonar cancro + [43]. Por isso testámos se a formulação de TA-CIN com impactos GPI-0100 o efeito terapêutico contra a TC-1 implantes tumorais nos pulmões. As células tumorais TC-1 foram injectados na veia da cauda de ratos C57BL6 e 3 dias mais tarde, os ratinhos portadores de tumor foram vacinados subcutaneamente com uma dose baixa (6,25 ug /rato) de sozinha TA-CIN ou formulado com 50? G de GPI -0100, seguido de dois reforços em intervalos de uma semana. Os pulmões foram colhidas dez dias mais tarde para avaliar o crescimento do tumor (Fig. 1A). Nem a vacinação com TA-CIN sozinho, nem GPI-0100 sozinho inibiu o crescimento do tumor TC-1 nos pulmões. No contraste, os ratinhos vacinados com TA-CIN formulado com GPI-0100 teve significativamente menos nódulos tumorais pulmonares e, portanto, um peso pulmonar inferior em comparação com ratinhos não vacinados (Fig. 1B e C e S2A Fig.). No entanto, a carga tumoral foi apenas reduzida, não completamente eliminado. Quando as respostas de células T CD8 + específicos para E7 de HPV16 E6 /foram analisados, verificou-se que TC-1 ratos portadores de tumor vacinados com TA-CIN formulado com GPI-0100 induziu respostas celulares dramaticamente mais elevados específicos de E7 T CD8 + do que qualquer um TA-CIN ou GPI-0100 única (Fig. 1D e S2B Fig.). Embora TA-CIN também contém um epítopo de células T CD8 + E6, foram observadas apenas fracas respostas de células T CD8 + específicas-E6 como de E7 é o antigénio dominante em ratinhos C57BL /6 (Fig. 1D e S2B Fig.). Formulação com Tween-40 tem sido proposto para aumentar o efeito adjuvante de GPI-0100 [44]. No entanto, consistente com as nossas descobertas anteriores em ratos sem tratamento prévio com [16], a inclusão de Tween-40 em TA-CIN /GPI-0100 formulação não teve impacto significativamente o efeito anti-tumoral ou respostas de células T CD8 + E6 /E7-específicos (Fig. 1D e S2B Fig.). Tomados em conjunto, estes dados estender a nossa verificação anterior de que o GPI-0100 é capaz de melhorar significativamente a imunogeni cidade de TA-CIN, incluindo uma resposta específica de E7 de células T CD8 + e aqui mostrar o seu potencial para a actividade terapêutica contra o tumor transformadas com HPV16 em murganhos C57BL6.

A. Ilustração esquemática do desenho do experimento. Resumidamente, 5~8 semanas de idade fêmea C57BL /6, ratinhos (10 ratinhos /grupo) foram injectados com 5 x 10

4 TC-1 células por via intravenosa no dia 0. No dia 3, os ratos foram vacinados, quer com 6,25 ug /rato de TA-CIN, ou formulado com 50? g de GPI-0100, ou formulado com 50? g de GPI-0100 em 800 g de Tween-40 por meio de injecção subcutânea. Os ratinhos foram reforçados duas vezes com o mesmo regime. No dia 27, os ratinhos foram sacrificados para colher os pulmões e baços. B. Sumário do número de TC-1 nódulos de metástases nos pulmões de cada ratinho (e fotografias dos pulmões são apresentados na Fig S2A.). C. Sumário do peso dos pulmões. D. Síntese de citometria de fluxo de análise de HPV16 E6 e E7-CD8 específicas,

respostas de células T + analisados ​​por coloração intracelular IFN-γ. Os dados foram adquiridos com FACSCalibur, analisados ​​com CellQuest e dados representativo é mostrado na S2B Fig.

A imunogenicidade da TA-CIN formulado com GPI-0100 em manitol e

congelado

Por conveniência e uma estabilidade melhorada, é potencialmente vantajosa para formular um grande lote de vacina TA-CIN /GPI-0100 e ali quota-lo em doses de uso único que pode ser congelado para armazenamento a longo prazo. Devido ao seu grupo dodecilo, GPI-0100 é mais hidrofóbica do que o seu

Quillaja

saponina precursor e o evitar de tampões de elevada força iónica e formulação em 5% (isotónico) manitol é vantajosa. Portanto, formulamos TA-CIN com GPI-0100, misturando-o durante a noite em solução de manitol a 5%. As doses foram congeladas e armazenadas a -80 ° C até ser necessário para administração. Para testar se uma única congelação /descongelação impactos do ciclo da resposta imune, que vacinados ratinhos BALB /c naive com qualquer recém-formulado TA-CIN /GPI-0100, ou TA-CIN formulado com GPI-0100 em 5% de manitol e congelada a – 80 ° C para armazenamento até à sua utilização. Os ratinhos foram reforçados duas vezes como indicado na Fig. 2A. Duas semanas após a última vacinação, os esplenócitos e os soros foram colhidos para detectar específicos de células T respostas de HPV16 (Fig. 2B-D, S3A e C Fig.) E anticorpo neutralizante (Fig. 2E), respectivamente. A vacinação com TA-CIN /GPI-0100 induziu uma resposta de anticorpo neutralizante contra HPV 16, enquanto que o TA-CIN sozinho ou GPI-0100 não desencadear uma detectável (titulo ≥50) resposta de anticorpos neutralizantes contra HPV 16 (Fig. 2E). No que se refere à imunidade celular, a vacinação com TA-CIN sozinha foi capaz de gerar tanto CD4 específica TA-CIN-

+ e CD8

+ T respostas de células (Fig. 2B-D, S3A e C Fig.). No entanto, a formulação de TA-CIN com GPI-0100 muito maior ambas as respostas de células T, designadamente o TA-CIN específicos de CD4

+ respostas de células T por 7 vezes (Fig. 2B, S3A e C Fig.). Este CD4

resposta de células T + é pelo menos em parte L2-específica uma vez que L2 de HPV16, mas não Mock transfectadas, células CT26 foram capazes de activar CD4

células + T de ratinhos vacinados para produzir IFN-γ (Fig. 2C, S3B Fig.). Também testámos se há resposta das células T CD4 + contra HPV16 E7 utilizando um péptido que contém um epitopo de célula T CD4 previamente relatada [45] e não encontrou nenhuma resposta detectável (S4 Fig.). Importantemente, os ratinhos vacinados com TA-CIN formulado com GPI-0100 em solução de manitol e armazenado a -80 ° C gerado semelhante TA-CIN específico para CD4

+,

+ de células T CD8 e as respostas de anticorpos neutralizantes específicos de HPV16 para recém-formulado com TA-CIN GPI-0100 (Fig. 2). Estes dados sugerem que a TA-CIN formulado com GPI-0100 em solução de manitol podem ser congeladas e armazenadas a -80 ° C durante um período prolongado (potência foi mantida após armazenamento de 11 meses, o período mais longo testado até à data), sem comprometer a sua imunogenicidade .

A. Ilustração esquemática do protocolo experimental. Resumidamente, do sexo feminino BALB /c 5~8 semanas de idade (5 ratinhos /grupo) vacinados subcutaneamente com 6,25 ug /ratinho de TA-CIN, ou formulado com 50? G de GPI-0100, ou formulado com 50? G de GPI-0100 em 50,7 mg /mL de manitol e submetida a um único ciclo de congelação /descongelação. Os ratinhos foram reforçados duas vezes com o mesmo esquema, com intervalo de duas semanas. Duas semanas após a última vacinação, os soros e esplenócitos foram recolhidos. B. Resumo da análise de citometria de fluxo de TA-CIN-específica CD4

respostas de células T + analisados ​​por coloração intracelular IFN-γ (e de dados representativo é mostrado na Fig S3A.). C. Sumário da análise de citometria de fluxo específica examinando-HPV16 CD4

+ respostas de células T induzida por TA-CIN formulado com GPI-0100 em manitol e congeladas /descongeladas uma vez. Os esplenócitos foram colhidas após a vacinação e estimuladas com TA-CIN ou L2 de HPV16 transfectadas células CT26 (e de dados representativo é mostrado na Fig S3B.). D. Síntese da análise de citometria de fluxo de TA-CIN-CD8 específicas,

respostas de células T + analisados ​​por coloração intracelular IFN-γ. Os dados foram adquiridos e analisados ​​com FACSCalibur com CellQuest (e de dados representativo é mostrado na Fig S3C.). E. Resumo da titulação de anticorpos neutralizantes específicos da L2 HPV16 analisados ​​com ensaio de neutralização baseado HPV16-SEAP pseudovirus

Para testar se a formulação congelada mantém a imunogenicidade após um único ciclo de congelamento /descongelamento, C57BL /6. ratinhos portadores do tumor TC-1 nos pulmões foram administrados quer TA-CIN recém-formulado com GPI-0100, TA-CIN ou formulado com GPI-0100 em solução de manitol, armazenado a -80 ° C e descongeladas imediatamente antes da utilização. Os ratinhos foram reforçados duas vezes como indicado na Fig. 3A, e 4 dias após a última vacinação, os pulmões e os esplenócitos foram colhidas para detectar o crescimento do tumor e as respostas de células T. Como mostrado na Fig. 3B, C e S5A Fig.), Os ratinhos tratados apenas com a GPI-0100 não inibiu o crescimento de tumores TC-1, e os ratinhos vacinados com TA-CIN sozinho demonstrou um efeito antitumoral ligeira, quando comparada com os ratinhos não tratados. Em contraste, os ratinhos vacinados com /GPI-0100 inibiu significativamente o crescimento do tumor TA-CIN, quando em comparação com TA-CIN ou GPI-0100 sozinho ratinhos tratados, e a resposta foi semelhante nas formulações frescos e congelados /descongelados. Em seguida analisou-se a CD8

+ respostas de células T contra HPV16 E6 /E7 induzidos por vacinação (Fig. 4A e Fig. S5B). Nenhum dos grupos apresentaram respostas de células significativas específicas-E6 CD8

+ T. TA-CIN vacinados camundongos gerados específicos do E7 CD8

respostas de células T + fracos (0,074 ± 0,065%, em comparação com 0,013 ± 0,008% nos tratados e 0,027 ± 0,024% do GPI-0100 tratado). Em contraste, os ratinhos vacinados com recém formulado TA-CIN /GPI-0100 gerado 25 vezes mais (1.888 ± 1.679%, p = 0,003) e formulação congelada gerado 27 vezes mais (2.049 ± 2.078%, p = 0,008) E7- CD8 específica

células + T. E7 específicos de CD8

+ células T geradas pela fresca ou a formulação congelada de TA-CIN /GPI-0100 foram comparáveis ​​(p = 0,851).

A. Ilustração esquemática do protocolo experimental. Resumidamente, fêmea C57BL /6 ratos 5~8 semanas de idade (10 ratinhos /grupo) foram injectados com 5 x 10

s.c. 4 TC-1 células por via intravenosa no dia 0. No dia 3, os ratinhos foram vacinados ou com 6,25 ug /ratinho de TA-CIN, ou formulado com 50? g de GPI-0100, ou formulado com 50? g de GPI-0100 em 50,7 mg /mL de manitol e congeladas /descongeladas uma vez. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. 2A.