Abstract
RNA micro aberrante (miRNA) expressão tem sido implicada na patogênese do câncer. Estudos recentes têm mostrado que o aglomerado de miR-17-92 é sobre-expresso em muitos tipos de cancro. A função oncogénica de miARN maduro codificado pelo cluster miR-17-92 foi identificado a partir do braço 5 ‘de seis precursores. No entanto, a função dos miARNs produzidos a partir de braço 3 ‘destes precursores permanece desconhecida. O presente estudo demonstra que o miR-17 * é capaz de suprimir as enzimas mitocondriais primárias críticos antioxidantes, tais como superóxido-dismutase de manganês (MnSOD), glutationa peroxidase-2 (GPX2) e tioredoxina redutase-2 (TrxR2). A transfecção de miR-17 * em células PC-3 de cancro da próstata reduz significativamente os níveis de três proteínas antioxidantes e à actividade do repórter de luciferase sob o controlo de miR-17 * sequências localizadas nas regiões 3 ‘não traduzida dos genes alvo de ligação de três . O dissulfiram (DSF), uma droga dithiolcarbomate mostrado ter um efeito anti-cancro, induz o nível de madura miR-17 * e morte celular em células APC, que pode ser atenuado através de transfecção de anti-sentido de miR-17 *. O aumento do nível * miR-17 em células PC-3 por um sistema de expressão condicional baseada-on Tet marcadamente suprime a sua tumorigencity. Estes resultados sugerem que miR-17 * pode suprimir a tumorigenicidade de câncer de próstata através da inibição das enzimas antioxidantes mitocondriais
Citation:. Xu Y, Fang F, Zhang J, Josson S, St. Clair WH, St. Clair DK (2010) miR-17 * Suprime tumorigenicidade de cancro da próstata através da inibição mitocondrial enzimas antioxidantes. PLoS ONE 5 (12): e14356. doi: 10.1371 /journal.pone.0014356
editor: Andrei L. Gartel, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América
Recebido: 24 Julho, 2010; Aceito: 20 de outubro de 2010; Publicação: 22 de dezembro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health subvenção CA115801 a William H. St. Clair e conceder CA 049.797 para daret K. St. Clair. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Micro RNA (miARN), ± 22 moléculas de ARN de nucleótidos que geralmente reprimem a tradução do RNA mensageiro alvo, está envolvido em vários aspectos da patogénese physiogenesis e [1] – [2]. O cluster de miR-17-92 codifica seis miARNs, incluindo o miR-17, o miR-18a, 19a-miR, miR-20a, 19b-miR-1, e miR-92, que são amplificados em vários tipos de tecidos de cancro do que em correspondentes tecidos normais [3] – [5]. Proto-oncogene c-myc-se regula a transcrição do aglomerado de miR-17-92 e resulta na sub-regulação de E2F1 por miR-17 [6], de PTEN por miR-19 [7], e de Rb1 por miR- 20a [8], sugerindo que miR-17-92 funciona como um fator oncogênico. Até à data, a maioria dos miARNs identificadas como tendo a capacidade de alterar o fenótipo e desenvolvimento de cancro são gerados a partir do braço 5 ‘de precursores de miARN. No entanto, a produção ea função do braço 3 ‘miRNA (miRNA *) são ainda imperceptíveis.
A desregulamentação do estado redox está envolvido em uma variedade de patogênese incluindo câncer. espécies reactivas de oxigénio (ROS) gerados a partir de metabolismo do oxigênio é desintoxicado por vias múltiplas antioxidantes [9]. enzimas antioxidantes mitocondrial, incluindo superóxido dismutase de manganês (MnSOD), peroxidase dependente da glutationa (GPx) e peroxidase dependente thioredoxin- (TrxR2), compreender um sistema de defesa primário nas mitocôndrias e são essenciais para a desintoxicação contra ROS [10] – [12]. Uma consequência da alta do metabolismo das células cancerosas de rápido crescimento é a rápida geração de ROS celular. As células cancerosas, portanto, requerem um sistema de defesa antioxidante alta para lidar com os altos níveis de produção de ROS [13], [14]. Assim, a inibição seletiva de sistemas antioxidantes é uma opção para a intervenção câncer.
O câncer de próstata (PCA) é uma doença comum em homens norte-americanos. Porque CaP desenvolve um fenótipo resistente à castração, os níveis de proteínas antioxidantes são aumentados e correlacionar a adquirir recursos, tais como o crescimento auto-suficiente, apoptose reduzida, angiogénese sustentada, invasão aumentada e metástase, assim como a resistência de células de cancro para tratamento [15 ] – [17]. Neste estudo, utilizamos quatro abordagens complementares para identificar mediadores para o tumor efeito de miR-17 * suprimir. Os resultados demonstram que a inibição das enzimas antioxidantes mitocondriais é um mecanismo para a função supressora de tumores de miR-17 *. Este é o primeiro relatório que revela a ligação entre o estresse oxidativo e a função supressora de tumores de miRNA produzido a partir de braço 3 ‘do cluster miR-17-92.
Resultados
miR-17 * reprime três proteínas antioxidantes mitocondriais
Uma série de estudos têm relatado que o miR-17 é altamente expresso em tumores malignos, incluindo APC, mas o nível de seu parceiro, miR-17 *, é normalmente baixa em cânceres [18 ]. Esta evidência prevê que os níveis de miR-17 e miR-17 * são regulados diferencialmente e que a razão entre os dois miARN pode ser importante para a regulação de diferentes conjuntos de genes alvo durante a tumorigénese. As expressões de ambos os miARNs em células da próstata diferentes, incluindo epitelial normal, estromal, as células, CaP responsivos aos andrógenos e independente de androgénios transformadas virais, foram quantificados por em tempo real de RT-PCR. O nível de miR-17 e a proporção de miR-17 para miR-17 * em células CaP foram maiores do que os níveis em células não-cancerosas (Fig. 1a). Ao pesquisar miRBase, descobrimos que MnSOD, GPX2 e TrxR2, três importantes proteínas antioxidantes mitocondriais que são essenciais para a desintoxicação de O
2
.- e H
2O
2, são potenciais alvos de miR -17 *. Para verificar que o miR-17 * é capaz de reprimir proteínas antioxidantes, maduro miR-17 * foi transfectado em células PC-3, que têm um baixo nível de endógena miR-17 *. A expressão dos três proteínas antioxidantes foi reduzida pelo miR-17 transfectadas * de um modo dependente da dose. Considerando que a transfecção de miARN de controlo e anti-sentido de miR-17 * não teve efeito sobre os alvos (Fig. 1B), estímulos de stress oxidativo, tais como as citoquinas são capazes de induzir a expressão do
SOD2
gene através da activação do NF -κB via de sinalização [19]. A transfecção de miR-17 * significativamente reprimido induzida por TNFa
expressão SOD2
de um modo dependente da dose (Fig. 1C). Para confirmar que a redução de proteínas antioxidantes por miR-17 * é mediada através da repressão de translação, as regiões não traduzidas 3′-, incluindo a putativa miR-17 * segmentação locais dos genes que codificam para as três enzimas antioxidantes, foram clonados a jusante do gene repórter. Um veículo e um local de miR-377 segmentação localizado na região do gene 3’untranslated
SOD1
foram incluídos como controlo do veículo e de controlo negativo não-eu. Como mostrado na Fig. 1D, o clonado miR-17 * sequências de direccionamento são necessárias para a repressão de respostas repórter por transfectadas miR-17 *.
A, os níveis de miR-17 e miR-17 * expressos em APC e celular de controlo linhas foram medidas por RT-PCR. A proporção de miR-17 para miR-17 * em cada linha de células é apresentada. B e C, a transfecção de miR-17 * em células PC-3 para validar a sua função na repressão da expressão de proteínas antioxidantes e diminuindo MnSOD indução mediada pelo TNF. D, o efeito repressor de miR-17 * sobre as proteínas antioxidantes é estimado por ensaio de repórter de luciferase quantitativa. RNU24 e β-actina foram utilizados como controlos internos para normalizar os níveis de miARN (A), os níveis de proteína (B e C). Imagens foram normalizados com os controlos internos e depois normalizada por PrEC (A), por controlo miARN (B), e por TNF sem tratamento (C). β-gal actividade foi utilizada para normalizar as actividades de repórter de luciferase (D). Três amostras (n = 3) foram usadas nas experiências e dobre as alterações em transferências de Western estão indicados. * (P 0,05) e ** (P 0,01) indicam significados, em comparação com os controlos: PrEC (A), controlar miARN (B) e (D), e as amostras não tratadas (C)
.
DSF induz miR-17 * expressão
DSF é uma droga dithiolcarbomate que foi mostrado para suprimir fenótipos cancerosos induzindo a via apoptótica [20]. Descobrimos que DSF inibe as três proteínas antioxidantes nas células APC. Depois de células PC-3 e DU-145 foram tratadas com DSF durante 24 h, a redução dos níveis das proteínas antioxidantes correspondeu significativamente com as concentrações de DSF (Fig. 2a). No entanto, os níveis de mRNA dos genes antioxidantes não foram alterados nas células tratadas com DSF (Fig. 2B). Curiosamente, RT-PCR e Northern blots mostram que induz DSF miR-17 * mas não tem efeito sobre os níveis de miR-17 (Fig. 2C) de expressão. A indução de miR-17 * por DSF é ainda confirmada por respostas repórter que são regulados por miR-17 * sequências de direccionamento (Fig. 2D). Além disso, para verificar que o efeito negativo da DSF sobre a expressão de proteínas antioxidantes é mediada pela indução de miR-17 *, as células PC-3 foram transfectadas com anti-sentido HSA-miR-17 * seguido por tratamento DSF. Os resultados indicam que o anti-sentido HSA-miR-17 * é capaz de reduzir o efeito de DSF (Fig. 2E). Estes resultados sugerem que a redução de proteínas antioxidantes por DSF ocorre, pelo menos em parte, através de miR-17 * repressão mediada por translação.
A, as células foram tratadas com CaP DSF nas concentrações indicadas. Os níveis dos antioxidantes três proteínas foram medidos por Western blots. B, os níveis de mRNA dos três genes antioxidantes foram quantificados por RT-PCR. C, os níveis de miR-17 e miR-17 * nas células tratadas com DSF foram quantificados por RT-PCR. Os níveis de miR-17 * foram confirmados por transferência de Northern. D, o efeito de DSF-induzida miR-17 * sobre as respostas repórter foi determinada. E, depois transfectados anti-miR-17 *, PC-3 de células foram tratadas com DSF. O efeito anti-miR-17 * em restaurar proteínas antioxidantes foi quantificada por Western blot. β-actina foi utilizada para normalizar os níveis de proteínas (A), (E), e os níveis de ARNm de (B). As mudanças são indicadas de dobragem. RNU24 foi utilizado para normalizar os níveis de miR-17 e miR-17 * (C). β-gal actividade foi utilizada para normalizar as actividades de repórter de luciferase (D). Três amostras (n = 3) foram usadas em experiências (com a excepção da mancha de Northern). * (P 0,05) e ** (P 0,01) indicam significados como comparado com o não tratamento DSF (A), (C), (D), e em comparação com nenhuma DSF e nenhuma amostra miARN transfectadas (E)
miR-17 * induz a morte celular nas células CaP
para determinar a toxicidade para as células DSF APC, PC-3 e DU-145 células foram tratadas com DSF e cultivados até colónias formadas. Uma vez que a densidade celular utilizado para a análise de formação de colónias foi 100 vezes menos do que a densidade mostrado na Fig. 2, o intervalo de concentração de DSF foi reduzido 100 vezes em experiências de formação de colónias. Os resultados de sobrevivência fracção indicam que as células CaP são extremamente sensíveis à DSF. Mais de 95% das células foram mortas por tratamento com 1 uM de DSF (Fig. 3A). Para verificar se o miR-17 * contribui para a morte celular mediada por DSF, as células PC-3 foram transfectadas com miR-17 * e * antes do tratamento-miR-17 anti DSF. Análise de sobrevivência de colónias mostra que o miR-17 * aumenta a toxicidade do DSF, enquanto que anti-miR-17 * é capaz de salvar células do efeito de DSF (Fig. 3B). Para verificar ainda que a redução de proteínas antioxidantes é uma das principais causas para a toxicidade de miR-17 *, as células PC-3 foram co-transfectadas com o miR-17 * e ADNcs expressando ectopicamente as três proteínas antioxidantes que não são susceptíveis a miR- 17 * regulamentação. A análise de citotoxicidade por ensaio de exclusão de azul de tripano mostram que a expressão dos três genes antioxidantes resgata sobrevivência celular a partir da toxicidade de miR-17 * (Fig. 3C). Os níveis das proteínas correspondentes antioxidantes nas células transfectadas PC-3 foi verificada por Western blot (Fig. 3D).
A, as células foram tratadas com CaP DSF nas concentrações indicadas para a análise de sobrevivência das colónias. As colónias formadas foram contadas e representados graficamente numa escala logarítmica. B, as células PC-3 foram transfectadas com miR-17 * e de controlo miARNs antes do tratamento com DSF. foram determinados os efeitos de miR-17 * e anti-miR-17 * na sobrevivência das colónias. C e D, o miR-17 * foram co-transfectadas com construções para a expressão das três proteínas antioxidantes. As proteínas antioxidantes sobre-expresso foram confirmadas por Western blots com normalização β-actina e dobram as mudanças estão indicadas (D). Os efeitos protectores dos enzimas antioxidantes transfectadas sobre as células contra o miR-17 * toxicidade foram determinados por um ensaio de exclusão de azul de tripano (C). Três amostras (n = 3) foram utilizados nas experiências. * (P 0,05) e ** (P 0,01) indicam significados, em comparação com amostras de controlo de miARN (B) e comparada com amostras de controlo de veículo (C), (D)
miR-. 17 * suprime a tumorigenicidade de CaP
Para determinar o efeito de miR-17 * sobre o crescimento tumoral, a sequência madura de miR-17 * foi clonado num vector de expressão de lentivírus com base em-Tet. O lentivírus expressando o miR-17 * foi transducted em células PC-3, e foi identificada uma linha de células estável com expressão RFP baseado Tet-on. O efeito de miR-17 * sobre as três proteínas antioxidantes sob Tet-on condições induzível foi confirmada por Western blot (Fig. 4A). Um modelo de tumor de xenoenxerto de ratinho foi utilizado para avaliar o efeito de miR-17 * sobre o crescimento tumoral. Quando o clone foi injectada subcutaneamente em ratinhos nus machos, expressão de miR-17 *
In vivo
foi induzida pela administração de Dox contendo água. Um controlo de veículo foi incluído para controlar o efeito tóxico de Dox. Como mostrado na Fig. 4B, o tempo médio para os tumores chegar a 500 mm
3 no controle do veículo e miR-17 *, sem grupos de controle Dox é de 12 a 13 dias (controle do veículo sem Dox, 12,2 ± 2,1; o controle do veículo com Dox, 12,3 ± 2,8; e miR-17 * sem Dox, 12,6 ± 2,8). Notavelmente, o número de dias para o miR-17 * com grupo Dox para atingir 500 mm
3 tamanho do tumor é de 24 ± 4,9, que é duas vezes tão longo quanto os grupos de controlo. Para medir continuamente o crescimento do tumor, os ratinhos nos grupos de controlo foram mantidas durante 18 dias após a injecção, quando o tamanho do tumor atingiu a dimensão máxima permitida de 2000 mm
3. As taxas de crescimento de tumor mostradas na Fig. 4C indicam que o crescimento do tumor no miR-17 * com Dox grupo foi significativamente retardado em comparação com o crescimento de tumores nos grupos de controlo. Para verificar se a expressão de miR-17 * resulta em reduzidas proteínas antioxidantes no miR-17 * tecidos tumorais expressos, os níveis de miR-17 * e actividades das enzimas anti-oxidantes nos tecidos tumorais foram quantificados. Correspondendo aos níveis mais elevados de miR-17 * no grupo tratado com Dox, as actividades das três enzimas antioxidantes foram significativamente reduzidos em comparação com o grupo não tratado (Fig. 4D). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que a expressão de miR-17 * em células PC-3 reduz a tumorigenicidade, pelo menos em parte, pela inibição da função mitocondrial antioxidante. Este resultado sugere que, em contraste com o efeito oncogénico de miR-17, o miR-17 * desempenha um papel supressor de tumor em células APC.
A, tem-miR-17 * foi clonado num Tet-on lentiviral vector e seccionado de forma estável em células PC-3. O clone foi testado por rastreio RFP Dox- sob condições indutivas e em seguida confirmada através da medição da expressão dos três genes alvo utilizando Western blots com normalização β-actina. B e C, o clone gerado foi injectada em ratinhos nus do sexo masculino para determinar a sua tumorigenicidade. O controlo do veículo foi incluído. O número de dias necessários para atingir a dimensão do tumor de 500 mm
3 é mostrado em (B) e as taxas de crescimento do tumor calculado em (C). D, o ARN total e as proteínas foram isoladas a partir de tecidos de tumor e o nível de miR-17 * e actividades correspondentes das três proteínas antioxidantes foram quantificados. Três amostras (n = 3) foram usadas no ensaio da gerado miR-17 * clone indutível (A). Nove animais de controlo veículo (n = 9) com ou sem tratamento com DOX e dezoito miR-17 * expressa animais (n = 18) com ou sem tratamento com DOX foram usadas para testar o efeito de miR-17 * sobre o crescimento tumoral (B), (C), (D). * (P 0,05) e ** (P 0,01) indicam significados como comparado com o controlo sem DOX (A) e (C)
Discussão
miARN geralmente funciona como. um repressor pós-transcricional, que se pensa ser um importante mecanismo de regulação do gene. miRNA biogênese inclui canônica transcrição miRNA primário, Drosha /clivagens mediada por Dicer, e Strand selecção preferencial através Argonaute (atrás) proteínas [21]. Quando um fio é selecionada para a repressão de metas, a sua vertente sócio se presume ser degradados [22]. No entanto, estudos recentes têm detectado tanto miR-17 e miR-17 * em muitos tipos de tecidos humanos [23]. Em todas as linhas celulares testadas, os nossos resultados demonstram que o miR-17 * está presente a um nível inferior do que o miR-17. No entanto, os níveis de ambos os miARNs são mais elevados em células CaP do que nas células de controlo (dados não apresentados). Uma vez que o nível de miR-17 é maior do que o miR-17 *, o rácio de miR-17 para miR-17 * em células PCA é aumentada, o que sugere que o miR-17 é uma cadeia preferencialmente seleccionado, embora tanto o miR-17 e miR -17 * precursores são transcritos. Estudos recentes têm demonstrado que medeia a produção ago1 miARN em Drosophila, enquanto ago2 está associada com a produção de miARN * [24]. No entanto, o mecanismo preciso pelo qual regula AGO miARN biogénese tem de ser determinado para revelar acumulação preferencial de cordões de miARN sob condições diferentes.
Os nossos dados demonstram que o miR-17 * suprime a tumorigenicidade das células APC, o que sugere que a função de miR-17 * é oposta à função oncogénica de miR-17. Expressão do cluster miR-17-92 é estreitamente regulada em resposta a ambientes intercelulares e extracelulares. A transcrição deste agrupamento é supra-regulados por c-Myc em condições oxidantes, [25] e sub-regulada por p53 sob condições de hipoxia [26]. Curiosamente, DSF, um dithiolcarbomate, induz apenas o nível de miR-17 * e não miR-17. Esta indução selectiva é consistente com o efeito supressor de tumor de miR-17 * e está de acordo com uma descoberta anterior de que DSF induz a apoptose em células cancerosas [20]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o PBR pode ser eficaz como um agente anticanceroso, em parte, pela indução de miR-17 *.
repressão de genes à base de miARN é considerado para ser um destino celular regulador essencial controlar. No entanto, é um sistema de regulação complicada porque um gene pode ser regulado por vários miARNs e um miARN tem muitos alvos diferentes. Em geral, o efeito de miARN na regulação de genes é dependente de tipos específicos de tecidos, nos estados de desenvolvimento ou estímulos. Assim, a identificação dos alvos de miARN é crítica para definir as funções reais de miARN sob condições fisiológicas ou patológicas. O nosso estudo demonstra que o miR-17 * é um regulador negativo de três importantes enzimas antioxidantes localizadas na mitocôndria. Estas enzimas antioxidantes são os principais componentes do sistema antioxidante primária e que trabalham em conjunto para remover com segurança ROS gerado na mitocôndria. A inibição destas proteínas deverá conduzir, por conseguinte, a uma acumulação de ROS, o que resulta em citotoxicidade. Nossos resultados sugerem uma nova abordagem terapêutica para melhorar a morte celular por miR-17 * segmentação. Além disso, um estudo recente demonstrou que o miR-17 é capaz de silenciar a expressão de HIF-1α, um factor de transcrição para a manutenção da homeostase redox e a sobrevivência de células sob condições hipóxicas [27]. Juntos, estes resultados prever que a relação de miR-17 para miR-17 * pode ter um papel importante na regulação do estado redox da célula.
Embora o efeito Warburg, uma alta taxa de glicólise aeróbica em tumores, tem sido observado em vários tipos de cancro, os cancros têm mitocôndrias funcionais e a respiração mitocondrial é necessário para a proliferação de células de cancro [28]. Além disso, as células cancerosas apresentam níveis elevados de ROS e também expressam níveis elevados de proteínas antioxidantes para desintoxicar as elevadas taxas de produção de ROS [29]. Por exemplo, MnSOD é expresso a um nível elevado em células de CaP agressivas, o que é essencial para a protecção das células contra CaP ROS induzida por radiação [30]. Assim, provocando vias de sinalização pró-apoptóticos, visando mitocôndrias enzimas antioxidantes também pode ser considerado uma estratégia terapêutica anti-câncer. Os resultados, que demonstram que o miR-17 * de inibição de proteínas antioxidantes mitocondriais suprime a tumorigenicidade de células CaP in vivo, proporcionam evidência experimental para a prova de conceito de que miARN * pode funcionar como um supressor do tumor por inibição da capacidade de defesa mitocondriais.
Materiais e Métodos
cultura de células e análise de toxicidade celular
PrEC, próstata humana células epiteliais primárias (Cambrex Corp.), e PRSC, células estromais da próstata humanas (Clonetics), foram cultivadas em meio PrEBM (Lonza). PZ-HPV-7, o HPV-18 transformadas células epiteliais da próstata humana (American Type Culture Collection, ATCC), foi cultivada em meio de queratinócitos-SFM (Invitrogen). células de carcinoma epitelial humano LNCaP, DU-145 e adenocarcinoma de células PC-3 (ATCC) foram cultivadas em meio RPMI (Invitrogen) contendo 10% de FCS (Hyclone). ensaio de formação de colónias foi utilizado para quantificar a toxicidade de miR-17 * de células CaP plaqueadas em placas de 6 poços a densidades baixas. Para induzir a expressão * miR-17, as células foram tratadas com CaP DSF numa gama de concentrações de 0-1 uM, durante 24 h. As colónias foram lavadas com PBS 1x e coradas com um corante violeta de cristal. A fracção de sobreviventes foi calculada como a razão entre o número de colónias formadas com o número de células plaqueadas eficientemente. ensaio de exclusão de azul de tripano foi utilizado para determinar os efeitos protetores do aumento das enzimas antioxidantes sobre a toxicidade de miR-17 *. As células foram co-transfectadas com o miR-17 * e construções de expressão dos três genes antioxidantes. Depois da cultura durante 48 h, as células transfectadas foram coradas com um corante azul tripano a 0,4% e contadas utilizando um analisador de viabilidade celular Vi-celular (Beckman Coulter).
Micro expressão de ARN ensaio de repórter
para testar se o miR-17 * regula a expressão dos genes alvo, as regiões 3 ‘não traduzida dos genes alvo que contém os locais de ligação putativo * miR-17 foram clonados entre
Sac I e
Hind
locais do vector PMIR-repórter (Ambion) III. As construções repórter expressão miARN gerados foram co-transfectadas com vector de controlo interno β-gal (Ambion) em células PC-3 utilizando lipofectamina (Invitrogen). Depois da cultura durante 36 h, as células foram colhidas; actividade de luciferase foi medida utilizando um kit de ensaio de luciferase (Promega); e actividade β-gal foi medida utilizando-clorofenol um vermelho-D-glactopyranoside substrato monossódico (Roche Molecular Biochemicals). respostas luciferase relativas foram estimados pela atividade luciferase-β-gal normalizado.
A expressão de miR-17 *
Para aumentar o nível * miR-17 em células APC, miR-17 * moléculas e controles (Ambion) foram transfectadas em células utilizando oligofectamine (Invitrogen). Para induzir o miR-17 * a expressão em células APC, as células foram tratadas com o disulfiram (Sigma) a uma concentração de 0 a 100 uM, durante 24 h. Para expressar de forma estável o miR-17 * em células APC, uma sequência * miR-17 maduro medido por locais de clivagem Drosha e Dicer foi clonado num Tet-on indutível vector lentiviral, tRiPz (Open Biosystems), utilizando Xhol e locais EcoR I. Sequência de inserção contendo o miR-17 * (mostrado por um sublinhado) é CTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGAACTGCAGTGAAGGCACTTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACAAGTGCCTTCACTGCAGTCTGCCTACTGCCTCGGAGAATTC. O miR-17 clonado * foi empacotado usando um sistema de embalagem translentiviral (Abertas Biosystems). O miR-17 * lentivírus foi concentrada e titulados antes da transdução em células com menos de 2 ug /ml de puromicina condições selectivas. O clone * miR-17 foi ainda seleccionados por Tet-on expressão indutível de uma proteína fluorescente vermelha (RFP) tag utilizando meios contendo 1 ug /ml de doxiciclina (Dox). O clone estável foi verificada por rastreio da expressão dos alvos utilizando Western blots.
A expressão de enzimas antioxidantes
para resgatar a sobrevivência celular a partir da toxicidade de miR-17 *, construções de ADNc para a expressão de as três proteínas antioxidantes foram transfectados em células PC-3 DSF tratamento prévio. As proteínas antioxidantes ectopicamente expressas não são afetados por tem-miR-17 *, porque as construções de cDNA não têm as regiões 3′-untranslational onde os sítios de ligação são identificados para possui-miR-17 * vinculativo.
animais
homem Quatro semanas de idade NCRNU (nu /nu atímicos nus) ratos foram adquiridos a Taconic (Hudson, NY). 10
6 células misturadas com Matrigel (BD Biosciences) foram injectadas no flanco direito dos ratos. Os murganhos injectados foram separados em dois grupos: dois dias antes da injecção, um grupo de murganhos começaram a beber água contendo 2 mg /L de doxiciclina e do grupo de controlo continuaram a beber a água normal. Os volumes tumorais foram calculados usando uma fórmula padrão (A × B
2 × 0,52; A e B representam os comprimentos tumor diagonal)
Western blot
As proteínas foram extraídas de células cultivadas. e tecidos de tumor, tal como descrito anteriormente (11) e 100 ug de proteínas extraídas foram sujeitas a electroforese em 8% (w /v) em gel de SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de nitrocelulose, e subsequentemente incubadas com anticorpos primários contra a MnSOD (Upstate Biotech). , GPX2 (Abcam), TrxR2 e β-actina (Santa Cruz Biotech). As transferências de Western foram visualizadas utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).
-PCR em tempo real (RT-PCR)
Para enriquecer miARN na preparação de ARN, o ARN total foi isolado a partir das células cultivadas e tecidos tumorais, utilizando um kit de isolamento de miRvana miARN (Ambion). Para a quantificação de miR-17 e miR-17 *, o RNA foi analisado utilizando um TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa kit com controlos internos RNU6B, RNU24 e RNU48 (Applied Biosystems). Para quantificar os níveis de mRNA dos genes alvo de miR-17 *, o RNA foi analisado utilizando TaqMan transcrição reversa Reagentes (Applied Biosystems) e RT-PCR com o Conjunto Universal ProbeLibrary (Roche Applied Science). RT-PCR foi realizada em um Mix Master TaqMan Universal PCR usando um LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science).
Northern Blots
O nível de miR-17 * foi quantificada usando um kit miRtect-IT miRNA Labeling e Detecção (USB Corp.) de acordo com o protocolo do fabricante.
a atividade da enzima ensaio
actividades MnSOD foram medidos pelo tetrazólio nitroblue (NBT) -bathocuproin sulfonato método de inibição de redução (BCS). Cianeto de sódio (2 mM) foi utilizado para inibir a actividade de Cu /ZnSOD [31]. actividade da GPx foi medida usando uma mistura de reacção que consiste em mm h 0,2
2O
2, GSH 1,0 mM, 0,14 U de glutationa redutase (GR), NADPH 1,5 mM, azida de sódio 1,0 mM e fosfato de 0,1 M de tampão (pH 7,4) e 1 mg /ml de proteína sobrenadante [32]. TrxR atividade foi medida usando Tiorredoxina Reductase Activity Assay Kit (Redoxica) de acordo com o protocolo do fabricante.
analisa dados estatísticos
Vários experimentos independentes foram realizados para cada conjunto de dados. Imagens em transferências de Northern e Western blot foram quantificados utilizando software Carestream Molecular (Carestream Health Inc.). A significância estatística foi analisada utilizando ANOVA de uma via e teste de comparação múltipla de Tukey, seguido de análise de dados com Graphpad Prism.