Abstract

Fundo

epitelial molécula de adesão celular (EpCAM) à base de enumeração de células tumorais circulantes (CTC) tem valor prognóstico em pacientes com tumores sólidos, tais como o de mama avançado, cólon, e câncer de próstata. No entanto, a má sensibilidade foi relatada para o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Para resolver este problema, foi desenvolvido um sistema de matriz microcavidade (MCA) integrado com um dispositivo miniaturizado para isolamento CTC, sem depender de expressão EpCAM. Aqui, nós relatamos os resultados de um estudo clínico sobre CTCs de pacientes com câncer avançado de pulmão em que são comparadas ao sistema MCA com o sistema CellSearch, que emprega o método baseado em EpCAM convencional.

Métodos

amostras de sangue periférico emparelhados foram coletados de 43 pacientes com câncer de pulmão metastático para enumerar CTCs que utilizam o sistema CellSearch de acordo com o protocolo do fabricante e do sistema MCA por imunomarcação e análise citomorfológicos. A presença de CTCs foi avaliada de forma cega e independente por ambos os sistemas.

Resultados

CTCs foram detectados em 17 dos 22 pacientes com NSCLC que utilizam o sistema MCA versus 7 de 22 pacientes que utilizam o sistema CellSearch. Por outro lado, CTC foram detectados em 20 dos 21 do cancro do pulmão de pequenas células (SCLC) pacientes que utilizam o sistema MCA contra 12 dos 21 pacientes que utilizam o sistema CellSearch. Significativamente mais CTCs em pacientes com NSCLC foram detectados pelo sistema MCA (mediana 13, faixa de 0-291 células /7,5 mL) do que pelo sistema CellSearch (mediana 0, faixa de 0-37 células /7,5 mL), demonstrando superioridade estatística (p = 0,0015 ). a significância estatística não foi alcançada em SCLC que foi observada a tendência favorecendo o sistema MCA sobre o sistema CellSearch (p = 0,2888). O sistema MCA também isolado aglomerados CTC de pacientes que tinham sido identificados como CTC negativo utilizando o sistema CellSearch.

Conclusões

O sistema MCA tem um potencial para isolar significativamente mais CTCs e clusters CTC em avançado pacientes com câncer de pulmão em comparação com o sistema CellSearch

Citation:. Hosokawa M, Kenmotsu H, Koh Y, Yoshino T, Yoshikawa T, Naito T, et al. Isolamento de células circulantes do tumor em pacientes com câncer de pulmão Usando um Sistema de microcavidade Array (2013) Size-base. PLoS ONE 8 (6): e67466. doi: 10.1371 /journal.pone.0067466

editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 18 Janeiro, 2013; Aceito: 17 de maio de 2013; Publicação: 28 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hosokawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Programa Regional Innovation Cluster e um Grant-in-Aid para Bolsa de Investigação para Jovens cientistas (11J11150) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. MH, TYoshino, HKanbara, e TM têm pedidos de patentes relacionadas com o sistema MCA . HKanbara é empregado por Hitachi Chemical Co., Ltd. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer nos países mais industrializados. cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é responsável por aproximadamente 15% dos casos de câncer de pulmão e câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), que inclui o adenocarcinoma (ADC) e carcinoma de células escamosas (SCC), é responsável por 85% dos casos de câncer de pulmão . Foi recentemente mostrado que a identificação de doentes com NSCLC por detecção das aberrações genéticas, especificamente

EGFR

mutações -activating e o

gene de fusão EML4-ALK

, permite uma melhor previsão da resposta ao EGFR tirosina inibidores de cinase e inibidores de ALK, respectivamente [1], [2]. Apesar dos avanços na prevenção e tratamento, pacientes com NSCLC são frequentemente diagnosticado numa fase avançada e tem um prognóstico pobre devido à tendência da doença em direção metástases à distância, a principal causa de mortalidade entre os pacientes com NSCLC. Caracterizada por um crescimento tumor agressivo e muitas vezes apresenta com metástases nos nódulos regionais e órgãos distantes, SCLC é inicialmente altamente sensíveis à quimioterapia, mas tende a adquirir chemoresistance, levando a recaída inevitável

.

circulantes células tumorais (CTCs) são definidas como células de tumor que circulam no sangue periférico de pacientes com cancro metastático. Quando medido usando os EUA Food and Drug Administration (FDA) -aprovado sistema CellSearch (Veridex, Raritan, NJ, EUA), o número de CTCs no sangue periférico pode ser usado para prever o prognóstico de pacientes com câncer de mama metastático [3], cancro colo-rectal [4], o cancro da próstata [5], NSCLC [6], e SCLC [7]. O sistema CellSearch enriquece CTC usando esferas magnéticas revestidas com um marcador de célula epitelial de direccionamento o anticorpo monoclonal, tais como a molécula de adesão celular epitelial (EpCAM) [8], [9]. No entanto, vários estudos têm mostrado que a presença de EpCAM em células tumorais varia com o tipo de tumor [10], [11]. A expressão dos marcadores de células epiteliais, incluindo EpCAM, é regulada negativamente para aumentar a capacidade de invasão e potencial metastático por epitelial para mesenquimal transição (EMT) [12] – [16]. Tem sido sugerido que a baixa predominância do CTC detectada em doentes com NSCLC avançado utilizam o sistema CellSearch pode ser devido à perda de expressão de EpCAM [17], indicando que os métodos de isolamento CTC à base de EpCAM não podem conseguir a recuperação CTC estável e reprodutível de todos tipos de tumores.

Outros métodos de isolamento CTC são baseadas principalmente em diferenças no tamanho e deformabilidade entre CTCs e células hematológicas. Tal como as células de tumores ( 8 um) são maiores do que os leucócitos [18] – [21], o isolamento por tamanho de células de tumor epitelial (ISET) pode ser conseguida usando filtração para separar as células individuais. ISET usando um filtro de policarbonato, um método barato e fácil de usar de enriquecer CTCs, permite a recuperação e detecção de CTCs-epitelial-marcador negativo com base dependente do tamanho isolamento CTC. Em ensaios clínicos, a utilização de um sistema baseado no ISET foi encontrado para conseguir maior sensibilidade de detecção CTC em pacientes com cancro do pulmão metastático em relação ao uso do sistema de CellSearch [22] – [24].

Recentemente, microfabricados dispositivos para a separação à base de tamanho de células de tumor têm sido largamente desenvolvido para permitir o enriquecimento preciso e eficiente dos CTC partir de sangue total [25] – [28]. Estes dispositivos incluem um sistema de matriz de microcavidade miniaturizado (ACM) que foi desenvolvido para o aprisionamento altamente eficiente de células isoladas por filtração com base nas diferenças nos tamanhos de células [29], [30]. Num estudo anterior, foi examinada a aplicação do nosso sistema MCA para a detecção de células tumorais fortificadas a partir de sangue total humano não processado com base em diferenças no tamanho e na deformabilidade entre as células tumorais e outras células de sangue [31]. Utilizando o nosso dispositivo, fomos capazes de prender células tumorais em matrizes microcavidade SIZE- e controlada de geometria composta de 10.000 aberturas por aplicação de pressão negativa, permitindo que as células retidas sejam facilmente enumeradas e analisadas por imagem microscópica de áreas especificadas. Além disso, verificou-se que a utilização do dispositivo miniaturizado permitido para a introdução de uma série de reagentes para a detecção de células tumorais através da estrutura de microfluidos. Os nossos resultados indicam que o nosso sistema é um sistema simples e preciso para a detecção de células tumorais dentro de sangue total. Para confirmar e construir sobre os nossos resultados anteriores, nós comparamos a capacidade e eficiência do nosso novo sistema MCA eo ouro actual sistema CellSearch padrão em executar a detecção de CTC e enumeração em amostras de sangue total extraídos de uma coorte de NSCLC e SCLC pacientes.

Materiais e Métodos

estudo de projeto e Declaração de Ética

Este estudo prospectivo foi realizado para avaliar CTC enumeração usando o sistema CellSearch eo sistema MCA em pacientes com câncer de pulmão metastático em um experimento cego (registro de ensaio clínico umin, número UMIN000005189). A presença de CTC foi avaliada individualmente de acordo com os critérios antes de conhecer quaisquer resultados de cada outro. Os critérios de inclusão no estudo foram o diagnóstico de câncer de pulmão patologicamente comprovado com lesões radiologicamente evidentes metastáticos, isto é, histologicamente ou NSCLC metastático citologia confirmada ou SCLC, e inscrição no Cancer Center Shizuoka. Os conselhos de revisão institucional da Cancer Center Shizuoka aprovou o protocolo do estudo, e todos os pacientes fornecidos consentimento informado por escrito. De cada um dos 43 pacientes que foram inscritos, entre os quais 22 tinham sido diagnosticados com NSCLC e 21 com SCLC, 10-15 mL de sangue foi coletado em tubos de EDTA para CTC enumeração pelo sistema MCA em nosso laboratório (Cancer Center Shizuoka, Shizuoka , Japão) e 20 mL foi coletado em tubos de coleta CellSave para CTC enumeração pelo sistema CellSearch no laboratório de SRL Inc. (Tóquio, Japão).

Cultura de células e Rotulagem

HCC827, NCI-H358, NCI-H441, DMS79, NCI-H69, NCI-H82 e linhas de células foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection, sem mais testes ou autenticação. A549 (Riken Bioresource Center, Tsukuba, Japão) e PC-14 [32] foram gentilmente cedidas pelo Dr. Fumiaki Koizumi (Centro Nacional do Câncer, Tóquio, Japão). O A549, linhas celulares HCC827, NCI-H358, NCI-H441, PC-14, DMS79, NCI-H69 e NCI-H82 NSCLC e SCLC foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 2 mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich, Irvine, Reino Unido), 10% (v) de soro v /fetal de bovino (FBS; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EUA), e 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina (Invitrogen Corp.) durante 3-4 dias a 37 ° C com 5% de CO

2 suplementação. Imediatamente antes de cada experiência, as células crescidas até à confluência foram tratadas com tripsina e ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Como uma medição do tamanho da célula do tumor, a distribuição de tamanho de célula foi determinada utilizando o contador de CASY® celular + Analyzer Sistema Modelo TTC (Schärfe System GmbH, Reutlingen, Alemanha). Para avaliar o desempenho do dispositivo, as linhas de células tumorais foram marcadas com vermelho CellTracker CMTPX (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA), com a rotulagem conseguida por incubação das células com um corante de rastreio (5 ^ M) durante 30 min. Depois de as células terem sido sedimentadas por centrifugação (200 g durante 5 min), o sobrenadante foi decantado. As células foram então lavadas duas vezes com PBS para remover qualquer excesso de corante, antes de serem ressuspensas em PBS contendo EDTA 2 mM e 0,5% de albumina de soro bovino (BSA).

fabricação do sistema MCA

A sistema MCA foi fabricada da mesma maneira como relatado anteriormente [29], [31]. Para CTC enumeração com observação microscópio de fluorescência, um MCA que tinha sido fabricado por galvanoplastia de níquel foi usado. Para CTC análise morfológica por coloração de Giemsa, um MCA transparente que tinha sido fabricado por irradiação com o laser de poli (tereftalato de etileno) (PET) foi usado. Cada um dos 10.000 cavidades dispostas em cada matriz 100 × 100 foi fabricado para ter um diâmetro de 8-9 uM na superfície superior e para estar 60 mm distante da microcavidade adjacente. Poli (dimetilsiloxano) (PDMS) estruturas foram fabricados e, em seguida, integrado com a MCA de tal modo que o substrato superior consistia de uma microcâmara, uma entrada de amostras, e uma saída, enquanto o substrato inferior por baixo da MCA continha uma linha de vácuo para produzir a pressão negativa, permitindo células entremeadas. O dispositivo de isolamento CTC foi construído por montagem da MCA, enquanto que as camadas superiores e inferiores de PDMS foram construídos utilizando fitas espaçador (Figura 1a). A entrada de amostras foi ligado a um reservatório, enquanto o microcanal de vácuo foi ligada a uma bomba peristáltica.

(a) Diagrama esquemático da estrutura do sistema de MCA. (B) imagem de microscópio electrónico de varrimento de uma linha de células de tumor cultivadas preso no sistema de MCA. (C-f), células isoladas a partir de sangue do paciente SCLC corados com Hoechst 33342 (C) e anticorpos fluorescentes marcado que se destinam a citoqueratina (d) e CD45 (e). A fusão das imagens (f) permitiu a identificação de células hematológicas e CTC. Barra de escala = 60 mm.

CTC enumeração usando os MCA Sistema

amostras de sangue humano foram recolhidos num tubo de colheita com EDTA para impedir a coagulação e usados ​​dentro de 2 h. O volume médio de sangue analisadas foi de 4,0 mL por amostra (intervalo, 3,0-7,5 mL). Todos CTC enumeração usando o sistema de MCA foi realizado sem conhecimento do estado clínico do paciente no laboratório do Cancer Center Research Institute Shizuoka. Após a introdução de amostras de sangue para dentro do reservatório, a pressão negativa foi aplicado a uma suspensão de células utilizando uma bomba peristáltica ligada a uma linha de vácuo, permitindo que a amostra a ser passado através dos microporos, a uma taxa de fluxo de 200 mL /min. Para remover quaisquer glóbulos remanescentes na matriz, PBS contendo EDTA 2 mM e BSA a 0,5% (1 mL) foi introduzida para dentro do reservatório e passadas através dos microporos, a uma taxa de fluxo de 200 mL /min durante 5 min.

para corar as CTC com anticorpo anti-pancitoqueratina, células aprisionadas foram fixadas pelo fluxo de 400 pL de 1% de paraformaldeído (PFA) em PBS através da MCA, a uma taxa de fluxo de 20 mL /min durante 20 min. Após lavagem com 100 ul de PBS, as células foram tratadas com 300 uL de 0,2% de Triton X-100 em PBS a uma taxa de fluxo de 20 mL /min durante 15 min. Depois de permeabilização, as células foram tratadas com 3% de BSA em PBS a uma taxa de fluxo de 20 mL /min durante 30 min. Para identificar CTC e leucócitos, 600 ul de solução de coloração de células contendo 1 ug /ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes); um cocktail de anticorpos anti-pancitoqueratina (Alexa488-AE1 /AE3 (1:100 diluição; eBioscience, San Diego, CA, EUA) e FITC-CK3-6H5 (1:60 diluição; Miltenyi Biotec, Auburn, CA Califórnia EUA); e PE-anticorpo marcado com anti-CD45 (diluição 1:120; BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) foi vertido através dos microporos, a uma taxa de fluxo de 20 mL /min durante 30 minutos Finalmente, a matriz foi lavada com 400. . uL de PBS contendo 2 mM de EDTA e% de BSA 0,5 para remover qualquer excesso de corante Após a recuperação de células tumorais, uma imagem de toda a área da matriz celular foi obtida usando um microscópio de fluorescência (BX61; Olympus Corporation, Tóquio, Japão) integrado com a 10 × lente objetiva e um palco motorizado operado por computador; WU, NIBA e conjuntos de filtros WIG; uma câmera digital arrefecida (DP-70; Olympus Corporation);. e software de aquisição de Lumina Vision (Mitani Corporation, Tóquio, Japão)

Em ensaios clínicos, uma imagem inteira da área de matriz de células foram obtidas utilizando um microscópio de fluorescência (Axio Imager Z1; Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) integrado com uma lente objetiva de 10 × ou 20 × e uma computador- operado estágio motorizado; Wu, FITC, e Texas Red conjuntos de filtros; uma câmera digital (AxioCam CDH; Carl Zeiss); e software de aquisição AxioVision (Carl Zeiss). Posteriormente, análise de imagem foram realizados e os objetos que satisfizesse critérios predeterminados tinham sido contados. intensidades fluorescentes e características morfométricas, tais como o tamanho da célula, forma e tamanho nuclear, foram consideradas quando se realiza a identificação do CTC e a exclusão de células não tumor, com células caracterizadas por uma ronda de morfologia oval e um núcleo visível (isto é, como a Hoechst-33342 positivo) que foram positivos para citoqueratina e negativa para CD45 identificado como CTCs. Isolado CTC sobre o MCA transparente também foram coradas utilizando um método de coloração de May-Grunwald-Giemsa (MGG) consistindo de fixação com PFA a 4%, não diluído coloração May-Grunwald durante 2 min, May-Grunwald mancha diluído a 50% em PBS durante 1 min e Giemsa durante 18 minutos, seguido por lavagem com PBS durante 1 min.

CTC enumeração usando o sistema CellSearch

amostras de sangue total foram mantidas à temperatura ambiente, durante a noite enviado para o laboratório de SRL Inc., e processado dentro de 96 h após a coleta. Todas as avaliações CTC foram realizados sem o conhecimento do estado clínico do paciente no laboratório e os resultados foram relatados como quantitativamente o número de CTC /7,5 mL de sangue. CTCs foram definidos como células intactas isolada-EpCAM mostrando coloração positiva para citoqueratina e coloração negativa para CD45. De acordo com as avaliações anteriores do sistema CellSearch [8], um paciente foi considerado positivo se CTC ≥2 CTCs /7,5 mL de sangue foram detectados na amostra do paciente.

Resultados

CTC Isolamento e análise de imagem utilizando o sistema MCA

o isolamento e a coloração das células tumorais a partir de sangue total foi completada dentro de 120-180 minutos, e a exploração da imagem de MCA foi realizado a 3 comprimentos de onda de fluorescência utilizando uma mistura 10 × 20 × ou lente objectiva e uma platina motorizada. A Figura 1B-F mostra a microscopia de varrimento electroscópio (MEV) e imagens de fluorescência das células marcadas que foram recuperados no MCA. Como pode ser observado, as células solitárias e aglomerados celulares foram presos individualmente e retido nas microcavidades que poderia ser facilmente enumeradas. células recuperadas que tinham uma morfologia redonda a oval e um núcleo visível (isto é, foram Hoechst 33342 positivo) e foram positivas para pancitoqueratina e negativo para CD45 foram identificadas como células de tumor, enquanto que as células CD45-positivas foram identificadas como contaminantes células hematológicas normais. As imagens revelam a existência de um imunofenotipagem distinta de células tumorais marcadores positivos de células epiteliais. Embora um certo número de leucócitos foram retidos na matriz, a enumeração de células de tumor foi relativamente fácil, porque as células individuais tinha sido preso nas microcavidades precisamente alinhadas.

sensibilidade do sistema de detecção CTC MCA em linhas celulares de cancro de pulmão

no nosso estudo anterior, números variáveis ​​de células da linha celular de cancro do pulmão NCI-H358 foram adicionadas em sangue, e o isolamento de células de tumor foi avaliada usando o nosso sistema MCA [31]. A eficiência de detecção foi calculada constante e mais de 90% quando 10-100 células tumorais estavam presentes por mililitro de sangue. Neste estudo, a fim de avaliar a eficiência de recuperação de várias linhas celulares de cancro de pulmão, usando o sistema de MCA, 100 células de cada uma das linhas celulares de cancro 8 pulmão (A549, HCC-827, NCI-H358, NCI-H441, PC-14 , DMS-72, NCI-H69, e NCI-H82) foram adicionadas em amostras de sangue de doadores saudáveis ​​e, em seguida processados ​​por ensaio de MCA. A Tabela 1 mostra a média da eficiência de recuperação e diâmetro típico das linhas de células. Como pode ser observado, obteve-se uma taxa de recuperação elevada, independentemente do tipo de tumor, variando de 68% a 100% na linha de células experiências spike-em. A maioria das células recuperadas eram viáveis ​​e capazes de proliferar, mesmo depois de terem sofrido o processo de isolamento, sugerindo o potencial para posterior análise biológica e molecular do CTC.

Em seguida, a fim de avaliar a especificidade e sensibilidade de detecção CTC, os testes de sensibilidade foram realizados em amostras artificiais preparada por adição de 1 e 3 células NCI-H358 cultivadas para amostras de sangue de dadores saudáveis, como previamente relatado por Vona et ai. [20]. Um e 3 células NCI-H358 cultivadas foram incrementadas em alíquotas separadas 7,5 ml de sangue. Estas amostras de sangue 7,5 ml foram processados ​​com o sistema de MCA em 3 ensaios independentes (Tabela S1). Os resultados demonstraram um limiar de sensibilidade para o sistema MCA perto de uma célula tumoral por 7,5 mL de sangue. Além disso, não foram detectáveis ​​CTC a partir de 6 sangues doadores saudáveis, utilizando o sistema MCA (Figura 2). Portanto, um paciente foi considerado positivo se ≥1 CTC CTC por 7,5 mL de sangue foi detectada pelo sistema de MCA.

CTC contagem /7,5 mL de sangue é mostrado para 6 dadores saudáveis, 22 pacientes com NSCLC e SCLC 20 pacientes .

Além disso, a eficiência de recuperação de células de tumor do sistema MCA foi comparada com a do sistema ISET (Figura S1). Nesta comparação, 100 células de linha celular de NSCLC NCI-H358 foi cravado em amostras de sangue de dadores saudáveis ​​e, em seguida, processada pelo sistema MCA e um policarbonato-gravadas faixa de membrana de poro de 8 um (Nucleopore; Whatman Ltd., Kent, Reino Unido). Os resultados revelaram a taxa de recuperação utilizando o sistema MCA (100% ± 5%), para ser significativamente mais elevado do que utilizando o sistema ISET (91% ± 2%) (P 0,05, teste-t), indicando que a utilização da MCA sistema permite o isolamento CTC com uma eficiência equivalente a ou maior do que a do sistema ISET.

CTC Enumeração utilizando o sistema CellSearch e o sistema MCA

para realizar comparação cega de a sensibilidade de detecção do sistemas CellSearch e MCA, amostras de sangue foram coletadas de 22 metastático e 21 doentes com CPPC entre Abril de 2011 e Fevereiro de 2012 e analisadas para determinação do número de pacientes identificados como CTC positiva por cada sistema (Tabela 2). Destas amostras, uma amostra recolhida de um paciente SCLC não foi avaliada pelo sistema de MCA porque um volume insuficiente de sangue foram recolhidas para processamento por ambos os sistemas. Como resultado, 17 dos 22 (77%) pacientes com NSCLC foram identificados como CTC positiva utilizando o sistema MCA mas somente 7 dos 22 pacientes (32%) de NSCLC utilizando o sistema CellSearch (Tabela 3). Destes pacientes, 8 foram identificados como CTC positivo tanto pelo sistema e o sistema CellSearch MCA, 1 foi identificado como positivo pela CTC apenas o sistema CellSearch, e 9 foram identificados como positivos por CTC apenas o sistema de MCA. Considerando os resultados obtidos por ambos os sistemas em conjunto, 18 (82%) dos pacientes com NSCLC foram identificados como positivos CTC. A análise destes resultados revelaram que um número significativamente maior de pacientes com NSCLC foram identificados como CTC positiva pelo sistema MCA (contagem de células mediana 13, gama 0-291 células /7,5 mL; Figura 2) do que pelo sistema CellSearch (contagem de células média 0 , range 0-37 células /7,5 mL), demonstrando a superioridade estatística do sistema MCA em CTC enumeração (p = 0,0015, teste de Wilcoxon;. Tabela 3)

em contraste, 20 dos 20 (100%) pacientes com SCLC foram identificados como CTC positiva utilizando o sistema MCA contra 12 dos 21 pacientes (57%) utilizando o sistema CellSearch. A contagem média CTC verificou-se ser 2 células /7,5 ml (variação 0-325) utilizando o sistema CellSearch e 23 células /7,5 mL (gama 2-2329) utilizando o sistema MCA (Figura 2). Embora não tendo atingido um nível de significância estatística, a sensibilidade de detecção do sistema de MCA em enumeração CTC mostrou uma tendência para ser maior do que a do sistema CellSearch (p = 0,2888, teste de Wilcoxon; Tabela 3). Para cada resultado, o acordo entre os resultados dos testes dos sistemas foi avaliada por gráficos de Bland-Altman [33]. Na análise de concordância quanto CTC enumeração em pacientes com NSCLC, a diferença média foi de 50,1 (IC 95%, faixa 11,1-89,1), com os limites de concordância variando de -125,8 para 226,0. O sistema MCA apresentou desproporcionalmente maior CTC conta a valores médios mais elevados em comparação com o sistema CellSearch (Figura S2a). Em contraste, na análise de concordância quanto CTC enumeração em pacientes com CPPC, a diferença média foi de (95% CI, intervalo -116.7-521.9) 202,6, com os limites de concordância variando -1.162,0-1567,2. Ao contrário, com a análise de amostras de sangue com NSCLC, não foi observada nenhuma diferença entre as sistemas na análise de amostras de SCLC, excepto para os doentes com extremamente alta CTC título (Figura S2B). A análise estatística também revelou nenhuma associação entre o local de metástase ea contagem CTC de pacientes com câncer de pulmão usando qualquer um dos sistemas (dados não mostrados).

Características morfológicas de CTCs isolado usando o sistema MCA

CTCs eram contado, identificado como sendo a citoqueratina positiva e negativa de CD45, e como tendo um núcleo visível com base na análise de imagens fluorescentes. Como pode ser observado na Figura 3, que mostra uma galeria representante dos CTC identificados por análise de imagem, CTC são maiores do que os leucócitos circundantes e frequentemente aparecem em grupos, definida aqui como agrupamentos de células contíguas que contêm 3 ou mais núcleos. A Figura 4 mostra uma CTC solitária e um cluster CTC detectado em um paciente utilizando o sistema de SCLC MCA. Usando o sistema MCA, foram observados aglomerados CTC em 2 dos 22 pacientes com NSCLC (N.º Paciente 13 e 21) e 4 dos 21 doentes com CPPC (N.º Paciente 31, 33, 34 e 43). May-Grunwald-Giemsa coloração dos CTC isolado utilizando o sistema MCA revelou que eles são caracterizados por uma elevada relação N /C, moldagem nuclear, e semelhança morfológica de células de tumor primário.

As células foram coradas com Hoechst 33342 , FITC anticorpo anti-citoqueratina, e do anticorpo anti-CD45 marcado com PE.

células

May-Grunwald-Giemsa-manchadas mostrou uma alta taxa de núcleo-citoplasma e moldagem nuclear (× 40). seta preta indica 9 mícrons microcavidade. Barra de escala = 60 mm.

Discussão

sistemas ISET foram encontrados para ter uma maior sensibilidade de detecção de CTC do que o sistema CellSearch em vários cancros, incluindo NSCLC [17], [22] no entanto, os poros de filtros ISET, que são feitas de policarbonato por ataque faixa, são colocados aleatoriamente dentro dos sistemas a uma densidade não uniforme. Ao contrário de tais filtros de policarbonato gravado de via, o tamanho, a geometria, densidade e das microcavidades no sistema MCA avaliada no presente estudo são precisamente controlada para conseguir a separação de células específica de acordo com as diferenças no tamanho celular e deformabilidade. células na MCA alinhamento não só facilita a imagens de células, permitindo a exploração de áreas especificadas com um microscópio de fluorescência automatizada, mas também permite a redução do trabalho necessário para a contagem CTC [29], [31]. Como tal, o sistema MCA proporciona uma plataforma para o uso de tecnologias de imagem de alto rendimento, que proporcionam a recolha de dados mais rápida e menos caro, bem como CTC enumeração e análise avançada de fenómenos moleculares, incluindo a hibridação in situ fluorescente para a detecção de específico de tumores alterações genómicas. Além disso, a MCA é integrado com um dispositivo miniaturizado de modo que o enriquecimento dos CTC de sangue, bem como a coloração e lavagem no ensaio de microfluidos, pode ser realizada dentro de um dispositivo integrado.

No presente estudo, CTC isolado na MCA foram coradas com sucesso com anticorpos fluorescentes marcado com marcadores que têm como alvo células tumorais, e de coloração e de lavagem foram encontrados a ter pouco ou nenhum efeito sobre a retenção de células tumorais nas microcavidades. Devido ao seu tamanho muito pequeno, o sistema MCA é portátil, que, ao permitir que point-of-care CTC contagem, elimina a necessidade de enviar sangue para o teste em condições de embarque desfavoráveis ​​e agiliza tomada de decisão clínica. Estas características, além de nosso procedimento recentemente desenvolvido para isolar células individuais do MCA usando microcapilares, permitir que as células tumorais a ser recuperado a partir do MCA para análise molecular subseqüente de CTCs [29].

Nesta comparação cega de utilização do sistema MCA à do sistema convencional para CellSearch CTC enumeração em pacientes com cancro do pulmão, do sistema de MCA foi encontrado capaz de isolar várias linhas celulares de cancro de pulmão cravado no interior de sangue total a elevados níveis de eficiência. No entanto, o sistema MCA realizado o isolamento de linhas de células SCLC ligeiramente menos eficaz em comparação com a de linhas celulares de NSCLC, indicando que os pequenos ( 8 um de diâmetro) de células das linhas de células SCLC pode passar através dos microporos na filtração do sangue. Em um estudo anterior [31], descobrimos que mama (MCF-7 e Hs578T), gástrica (AGS e SNU-1), e dois pontos (SW620) células tumorais linhas que incluem células tumorais EpCAM-negativo pode ser recuperado com sucesso usando o sistema MCA com rendimento superior a 80%. No entanto, também descobriram que a eficiência de recuperação de células pequenas (diâmetro médio de 11,6 um) da linha celular de tumor SW620 para ser ligeiramente menor do que a de outras linhas de células, como fizemos das linhas de células SCLC examinadas neste estudo.

o sistema MCA avaliada no presente estudo foi encontrada para possuir uma sensibilidade de detecção mais elevado do que o sistema CellSearch em NSCLC CTC enumeração, sugerindo a superioridade de técnicas de isolamento SIZE- e baseada deformabilidade comparação com as técnicas imunomagnéticos-based. A fraca sensibilidade das CellSearch tem sido atribuído à expressão baixa de EpCAM em NSCLC avançado. No entanto, um dos pacientes com NSCLC avaliadas no presente estudo verificou-se ser CTC positivo utilizando o sistema CellSearch mas CTC negativa utilizando o sistema MCA, indicando que as alterações na expressão de EpCAM não pode apenas em conta as diferenças encontradas entre os dois sistemas em NSCLC enumeração .

a taxa de detecção CTC utilizando o sistema CellSearch em pacientes SCLC foi de 67%, consideravelmente maior do que em pacientes com NSCLC e consistente com a encontrada em estudos anteriores [7], [34] – [36]. Embora o sistema MCA não depende de expressão de EpCAM, que circula células SCLC têm sido relatados para mostrar os níveis elevados [37], na realização de isolamento CTC, a sua utilização foi encontrada para se obter uma taxa de detecção de altura, o que indica que ele pode ser utilizado para CTC detecção em pacientes com NSCLC não só mas também SCLC. No entanto, as contagens CTC de vários pacientes foram maiores quando analisados ​​utilizando o sistema CellSearch em comparação com o sistema MCM, o que indica que algumas pequenas células tumorais no sangue do paciente pode fluir através das microcavidades, conforme descrito acima. Estudos anteriores sugeriram que as técnicas de separação imunomagnéticas falta a capacidade para isolar grandes aglomerados, enquanto que a utilização de técnicas de separação baseadas em tamanho leva à perda de CTC pequenos [17]. Para resolver estes problemas, a forma dos microporos na MCA foi modificado para melhorar a sua eficácia no isolamento de pequenas células de células tumorais no sangue total no nosso estudo recente [38].

observação de aglomerados CTC foi reportado em vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão [23], [24], [39] – [42]. Supõe-se que a formação em clusters fornece células CTC com vantagens sobre os restantes solitária em termos de sobrevivência, capacidade proliferativa e capacidade de formar micrometástases. Neste estudo, grupos CTC foram isolados a partir de ambos NSCLC e SCLC pacientes que utilizam o sistema da MCA. Curiosamente, os aglomerados CTC-positivas foram identificadas como tendo um pequeno número de células CTC pelo sistema CellSearch mas um grande número pelo sistema MCA. Uma razão pela qual muitos pacientes SCLC foram encontrados a ter uma grande contagem CTC quando avaliada pelo sistema MCA pode ser que este sistema permite o isolamento de aglomerados maiores CTC que não podem ser isolados por separação imunomagnética. O exame desta hipótese requer uma análise mais pormenorizada das características dos aglomerados CTC, tais como a expressão de marcadores epiteliais e a presença de células apoptóticas nos agrupamentos CTC, o que poderia ser realizada utilizando o sistema de MCA.

Em conclusão, o nosso