Abstract

Helicobacter pylori

, uma bactéria Gram-negativa, bactéria microaerophilic encontrado no estômago, é assumida para ser associado com a carcinogénese, invasão e metástase em doenças do aparelho digestivo. associada à citotoxina do gene A (CagA) é uma proteína oncogénica de

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que é codificada por uma ilha de patogenicidade Cag relacionada com o desenvolvimento do cancro gástrico. A transição epitelial-mesenquimal (EMT) é o principal evento biológica na invasão ou metástase das células epiteliais.

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pode promover EMT em linhas celulares de cancro gástrico humano, mas os mecanismos específicos ainda são obscuros. Nós exploramos o mecanismo molecular subjacente de EMT induzida por

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CagA no câncer gástrico. No nosso artigo, detectado espécimes de cancro gástrico e amostras não-cancerosas adjacentes por meio de imuno-histoquímica e encontrou um aumento da expressão do TWIST1 proteína de regulação relacionadas com a EMT e a vimentina marcador mesenquimal em tecidos de cancro, enquanto factor de morte celular programada 4 (PDCD4) ea epitelial marcador de expressão da caderina-E diminuiu em amostras de cancro. Estas alterações foram associadas com grau de malignidade dos tecidos. Além disso, os níveis de PDCD4 e TWIST1 estavam relacionados. Em células cancerosas gástricas co-cultivadas com plasmídeo de expressão CagA, CagA activado TWIST1 e expressão vimentina, e expressão da caderina-E inibida por downregulating PDCD4. CagA também promoveu a mobilidade das células cancerosas gástricas regulando PDCD4. Assim,

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CagA EMT induzida em células de câncer gástrico, o que revela uma nova via de sinalização de EMT em linhas celulares de cancro gástrico

Citation:. Yu H, Zeng J, Liang X, Wang W, Zhou Y, Sun Y, et al. (2014)

Helicobacter pylori

Promove a transição epitelial-mesenquimal no câncer gástrico por downregulating programada Protein Cell Death 4 (PDCD4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10.1371 /journal.pone.0105306

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de fevereiro de 2014; Aceito: 21 de julho de 2014; Publicação: 21 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa básica Nacional da China (sem 973 Programa 2012CB911202.), o National Natural Science Foundation da China (nos: 81171536, 81371781, 81272654, 81372680 e 81170514), a ciência médica e do Programa de Desenvolvimento de Tecnologia de Shandong (sem . 2013WS0209) e da Fundação de inovação independente da Universidade de Shandong (no. 2012TS106). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Helicobacter pylori

(

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) é uma bactéria gram-negativa em forma de hélice associado com doenças do aparelho digestivo, incluindo gastrite crônica, úlcera péptica, câncer gástrico, e das mucosas associada linfoma do tecido linfóide.

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foi classificado como cancerígeno pela Organização Mundial da Saúde ea Agência Internacional de Investigação do Cancro (OMS /IARC) em 1994 [1], [2].

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genes possuem uma ilha de patogenicidade associada à citotoxina do gene A (CagA), que codifica a proteína CagA virulência maior e um sistema de secreção do tipo IV (T4SS). CagA é entregue às células hospedeiras pelas T4SS e induz a formação de cancro e progressão [3].

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podem desregular a proliferação de células, afecta a via apoptótica normal, a forma da célula influência, abolir a actividade juncional e facilitar uma transição (EMT) epitelial para mesenquimal fenótipo depois de transloca-se para a célula hospedeira [4], [5]. O

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CagA proteína efectora afecta a maior parte destas vias.

In vivo

experiências mostraram que a expressão transgénica de CagA poderiam causar várias doenças malignas em ratinhos, incluindo hiperplasia epitelial gástrica, leucemia mielóide e linf ornas de células B, ou pólipos gástricos e adenocarcinomas do estômago e do intestino delgado [6]. No entanto, o mecanismo molecular de

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CagA interagindo em células hospedeiras ainda é incerto.

A EMT foi inicialmente reconhecido como uma característica da embriogênese, um processo vital para a morfogênese durante o desenvolvimento embrionário e coração. No entanto, também contribui para a fibrose tecidual, invasão tumoral e metástase. EMT caracteriza-se por várias características distintas, tais como a perda de adesão celular, o aumento da mobilidade celular, a resistência à apoptose, e algumas propriedades das células estaminais. Com EMT, marcadores epiteliais como a E-caderina mostram diminuição marcadores de expressão e mesenquimais, como vimentina mostram aumento da expressão. Outras moléculas reguladoras, como caracol, torcer e SLUG mostram mudou expressão [7], [8], [9]. vias oncogênicas que podem induzir a EMT incluem a transformação β do fator de crescimento (TGF-beta), Src, Ets, Ras, Wnt /β-catenina, Notch, fator nuclear-kB e integrina [10], [11], [12].

a infecção com o fator patogênico humano

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é assumido como levar a EMT, invasão ou metástase de câncer gástrico. Por exemplo, a regulação positiva de metaloproteinases de matriz 7 por patogênico

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parcialmente depende gastrina e pode ter uma função no desenvolvimento de cancro gástrico, possivelmente mediante o EMT, por níveis indirectamente indutor do factor solúvel de ligação à heparina de crescimento endotelial [13].

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CagA está envolvido na invasão de células tumorais através da desregulamentação receptor de c-met sinalização [14]. Assim, CagA poderia aumentar a activação da via de sinalização /β-catenina Wnt por perturbar a estabilização do complexo caderina-E-β-catenina. Assim, CagA desempenha um papel essencial no desenvolvimento de metaplasia intestinal [15]. Além disso, a análise de microarray sugeriu que o estado de fosforilação de CagA podem afectar a expressão de genes relacionados com o EMT em células de cancro gástrico [16]. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos que estão na base da EMT induzida por CagA.

Programado proteína morte celular 4 (PDCD4) está localizada no núcleo em células em proliferação [17]. Como um importante alvo de pós-transcricional de microARN (MIR) miR-21, PDCD4 está relacionado com a progressão do tumor e o prognóstico em pulmão humano, colo-rectal, da mama e cancro gástrico [18], [19]. O supressor de tumor PDCD4 pode ligar-se a elF4A ou eIF4G e inibir a tradução. PDCD4 pode regular activada por mitogénio proteína cinase 1 4 ou a expressão do receptor do activador de plasminogénio uroquinase (uPAR) para inibir a invasão e carcinoma intravasamento [20], [21]. PDCD4 também pode influenciar a transcrição de genes. Interage com o domínio de ligação ao ADN de TWIST1 e inibe Y-caixa de ligação às proteínas expressão 1 [22]. Assim, a perda de expressão PDCD4 está associado com a transformação maligna de cancro gástrico [23], [24]. Regulação negativa do PDCD4 está relacionada com a diferenciação de tumores em cancros do tracto digestivo [25]. No entanto, se PDCD4 está envolvido na EMT induzida por CagA no câncer gástrico eo mecanismo específico ainda precisam de maior elucidação.

Aqui, nós exploramos a regulação de proteínas EMT-associados e expressão PDCD4 no tecido do cancro gástrico e CagA activação de expressão TWIST1 e inibição da e-caderina e PDCD4 em células cancerosas gástricas.

Materiais e Métodos

pacientes e amostras de tecido

o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Comitê de Shandong University School of Medicine, e todas as amostras e as informações foram recolhidas com o consentimento informado por escrito. tecidos tumorais gástricas e seus combinados tecidos não cancerosos foram colhidas de 30 pacientes durante a cirurgia na Qilu Hospital, Universidade de Shandong (Jinan, China) de 2010 a 2012. Nenhum dos pacientes tinham recebido quimioterapia adjuvante ou radioterapia antes da cirurgia. O diagnóstico de câncer gástrico foi histologicamente confirmados pela hematoxilina e eosina.

Cultura de células e transfecção

linhas celulares de cancro gástrico humano (AGS, BGC-823 e SGC-7901) foram obtidos a partir da China Repositório celular Academia Sinica (Shanghai). As células foram incubadas nos meios recomendados e numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 a 37 ° C sem antibióticos. células SGC-7901 e células BGC-823 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), e células de AGS foram cultivadas em meio F12 suplementado com 10% de FBS. Meios de FBS e foram adquiridos a partir de Invitrogen (EUA). Em seguida, as células foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos pCDNA3.1 ou pCDNA3.1-CagA (um presente do Dr. Yongliang Zhu, Universidade Zhejiang, China) e pEGFP-C1 ou pEGFP-C1-PDCD4 (construído e fornecido pelo Dr. Chen Youhai , Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Filadélfia, EUA), utilizando X-treme GENE HP Transfection Reagent (Roche Diagnostics, Alemanha) de acordo com protocolos do fabricante.

isolamento do RNA, transcrição reversa e qRT-PCR

O ARN total foi extraído a partir de células por utilização de Trizol reagente (Invitrogen, EUA). A transcrição reversa envolvida o kit Superscript First Strand Synthesis III (Invitrogen). A expressão de genes foi detectado por utilização de quantitativa PCR em tempo real SYBR Premix Ex Taq (Takara, China) e envolveu a normalização 2

– △△ método de CT em relação a p-actina. As sequências dos iniciadores eram para PDCD4, sentido, 5′-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 ‘e anti- sentido, 5′-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3′; E-caderina, sentido, 5’-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 ‘e anti- sentido, 5′-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3′; CagA, sentido, 5’-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 ‘e anti- sentido, 5′-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3′; e TWIST1, sentido, 5’-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 ‘e anti- sentido, 5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3′; vimentina, sentido, 5’-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 ‘e anti- sentido, 5′-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3′; Caracol, sentido, 5’-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 ‘e anti- sentido, 5′-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3′; β-actina, sentido, 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 ‘e anti- sentido, 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’.

análise Western blot

A proteína foi extractada a partir de amostras e separadas por SDS-PAGE , em seguida, transferidos para membranas de PVDF (Millipore Corp., Billerica, MA, EUA), que foram imediatamente bloqueada com leite magro a 5% em TBST contendo 1% de Tween-20 durante 1,5 h à temperatura ambiente. Depois de ser lavado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 3 vezes, as membranas foram incubadas com anticorpos contra PDCD4 (1:500; Cell Signaling Technology, EUA), TWIST1 (1:2000, Novus Biologicals, EUA), caracol (1:1000 , Cell Signaling Technology, EUA), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), a E-caderina (1:1000, Cell Signaling Technology, EUA), vimentina (1:1000, Cell Signaling Technology, EUA ), e β-actina (1:2000, Sigma-Aldrich, EUA), como um controlo de normalização, a 4 ° C durante a noite, em seguida, com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano à temperatura ambiente durante 1 h. Depois de uma lavagem, as bandas imunorreactivas foram visualizadas por quimioluminescência aumentada (Millipore Corp., Billerica, MA, EUA). Western blotting foi realizado 3 vezes para cada amostra. A proteína foi carregada em 20 a 50 ug por pista.

Imunohistoquímica

amostras de tecido embebidos em parafina foram de-parafinado com xileno e desidratadas com uma série graduada de álcool. recuperação de antigénio por tratamento térmico realizado em tampão de citrato 0,1 M. E bloquear a atividade da peroxidase endógena foi utilizado por 3% H

2O

2. Em seguida, as lâminas foram incubadas com anticorpos contra PDCD4 (1:200), TWIST1 (1:500), vimentina (1:100) ou E-caderina (1:500) e anticorpos secundários correspondentes peroxidase de rábano conjugada e DAB para núcleos. Anticorpos para coloração imuno-histoquímica foram os utilizados para a transferência de western. Finalmente, hematoxilina foi usado para contracoloração slides. diferenciação do tumor de tecidos de câncer foi determinada de forma cega. O primeiro anticorpo foi substituído por solução salina tamponada com fosfato como controlo negativo. Os espécimes foram vistos sob uma Nikon Eclipse E800 (Nikon, Tokyo, Japão) microscópio.

Todos os cortes corados foram observados e marcado por 2 investigadores cegos independentes e lâminas foram dado um índice de coloração total (SI) pontuação de acordo com a intensidade de coloração e a percentagem de células tumorais positivas. intensidade da coloração foi classificada como 0, nenhuma coloração; 1, coloração fraca; 2, coloração moderada; e 3, de coloração forte. proporção de células de tumor foi pontuada como 0, as células de tumor positivas ≤20%; 1, 20% de células tumorais positivas para -40%; 2, 40% de células tumorais positivas para -60%; 3, 60% de células tumorais positivas para -80%; e 4, ≥80% de células tumorais positivas. Ao avaliar o SI, os resultados de coloração foram registados definitivamente a 0-4, baixa expressão; 4-6, expressão moderada; e 12/06, de expressão elevada. Se a interpretação coloração diferiu entre os investigadores, os dados para a secção foram descartados.

ensaio de invasão de Matrigel

ensaio de invasão de Matrigel envolveu uma câmara de Transwell (Costar, Nova Iorque, EUA). células SGC-7901 foram transfectadas com 2 ug pCDNA3.1, pEGFP-C1; pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1; ou pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-PDCD4. Após 48 h, 1 × 10

5 células transfectadas post foram tripsinizadas e semeadas em transpo� câmaras pré-revestidas com 20 ug Matrigel. Meio contendo 20% de FBS na câmara inferior serviu como o quimioatractivo, e a câmara superior foi preenchida com o meio contendo 10% de FBS. As células que não migraram foram removidas com cotonetes após 24 ou 48 h. As células que migram para a parte inferior do filtro foram coradas com 0,1% de violeta de cristal e contadas com um microscópio. Finalmente, as células remanescentes foram colhidas para a proteína e o isolamento de ARN. Cada tratamento foi repetido 3 vezes.

A análise estatística

Os dados são expressos como média ± SD. Estudante

t

teste ou teste do qui-quadrado foi utilizado para comparar 2 grupos. A análise de dados envolvidos SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA).

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados de

1.. Expressão de TWIST1, E-caderina, vimentina e PDCD4 no cancro gástrico

Para investigar a associação da EMT e câncer gástrico, nós colhidas 30 amostras clínicas de tecido de pacientes com câncer gástrico. As biópsias foram divididos em tecido média /baixa diferenciação, tecido de alta diferenciação e tecidos não cancerosos adjacente ao carcinoma pela hematoxilina e eosina (Fig. 1A). Por imunohistoquímica, TWIST1 e expressão de vimentina foram mais elevados no tecido do que o tecido maligno não-canceroso, enquanto que a expressão de E-caderina e PDCD4 era oposta à da TWIST1 (Fig. 1A-E). TWIST1 expressão e PDCD4 foi associada com o grau de diferenciação do tumor, mas não o sexo ou idade (p = 0,021 e p = 0,013, Tabela 1). Como assim, a diminuição da expressão PDCD4 foi inversamente associado com expressão TWIST1 alterado durante câncer gástrico (p = 0,035, Tabela 2). Portanto, EMT pode desempenhar um papel importante na carcinogênese e desenvolvimento gástrico.

(A) Hematoxilina-eosina confirmaram o diagnóstico pré-operatório e grau histológico. coloração imuno-histoquímica representante da TWIST1, caracol, PDCD4, vimentina e E-caderina distinta no tecido normal adjacente e tecido de câncer de alta diferenciação e tecido de câncer de diferenciação média /baixa. (B-E) Quantificação de TWIST1-, SNAIL-, PDCD4-, expressão vimentin- e E-cadherin- em tecidos normais e cancerosas. O número total de amostras é de 30 e cada ponto representa uma amostra. Horizontal bar médio é média e bigodes são SD.

*

P Art 0,05 e

**

P

. 0,01 versus controlo

2. TWIST1, vimentina ou expressão de E-caderina em linhas celulares gástricas é regulada pelo CagA

Em seguida, exploramos se CagA, como um fator virulenta de

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, influenciou a EMT e, portanto, promoveu a invasão e metástase no câncer gástrico. Nós escolhemos 3 linhas celulares de cancro gástrico humano de status de diferenciação (AGS, bem diferenciado linha de células epiteliais gástricas; SGC-7901, linha de células moderadamente diferenciado e BGC-823 linha de células pouco diferenciado). CagA plasmídeo de expressão foi transfectado em várias linhas de células gástricas. Embora as alterações morfológicas das células de CagA-transfectadas não foram observados (dados não mostrados), a expressão de factores de transcrição e marcadores de células foram afectados por CagA. A expressão de ARNm e proteína de TWIST1 e vimentina foi regulada positivamente com CagA transfecção (fig. 2A-G) e que de PDCD4 e E-caderina foi regulada negativamente (Fig. 2A-G), mas não há mudanças significativas na expressão de Snail foi observada em CagA grupo transfecção. Portanto,

H. pylori

CagA pode afetar reguladores EMT incluindo TWIST1. Além disso E-caderina, como um importante marcador epitelial e vimentina, como um marcador mesenquimais regulada por TWIST1, foram também influenciado por CagA, e o gene relacionado com PDCD4 EMT foi regulada negativamente.

CagA plasmídeo de comprimento total foi transfectada em AGS, SGC-7901 e BGC-823 células por 48 h, e as células foram recolhidas para mRNA e análise de western blot. (A-C) Análise de RT-PCR quantitativa de níveis de mRNA de factores relacionados com o EMT PDCD4, transcrição (TWIST1 e caracol) e marcadores de células (vimentina e E-caderina) em 3 linhas celulares de cancro gástrico. Todos os valores foram normalizados para a p- actina ARNm na mesma amostra. (D) Análise de Western blot de nível de proteína de CagA, TWIST1, caracol, PDCD4, vimentina e E-caderina no controle ou células transfectadas-CagA. (E-G) densitometria de Western blot foi quantificada (ImageJ) e o nível de proteína indicado foi normalizada para p-actina. Os dados apresentados representam SD ± média de 3 ensaios independentes. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01 versus controlo

3. Expressão de TWIST1, vimentina e E-caderina foi influenciado por PDCD4

próxima analisado o mecanismo molecular da EMT regulada por

H. pylori

CagA em células cancerosas gástricas. PDCD4 suprime o crescimento de células através de uma interacção directa com TWIST1 no cancro da próstata humana [22]. A imuno-histoquímica e análise estatística demonstrou a importância da PDCD4 e TWIST1 existia no carcinoma gástrico (Fig. 1, Tabela 2). No entanto, os mecanismos subjacentes função PDCD4 em células cancerosas gástricas não eram claros. Assim AGS? SGC-7901 e células BGC-823 que transfectadas com um plasmídeo de sobre-expressar PDCD4. PDCD4 ARNm e a expressão da proteína foi regulada positivamente em todas as linhas de células transf ectadas com o plasmídeo (Fig. 3A-G). Além disso, o ARNm e proteína de níveis TWIST1 e vimentina, mas não caracol, foram reduzidos a vários graus, e os níveis de E-caderina foram aumentados (Fig. 3A-G). Portanto, TWIST1, vimentina e expressão de E-caderina pode ser regulamentada por PDCD4 em células epiteliais gástricas.

Os plasmídeos de pEGFP-C1 e pEGFP-C1-PDCD4 foram respectivamente transfectado em AGS, SGC-7901 e BGC-823 as células durante 48 h, e, em seguida, as células foram colhidas para o isolamento de ARN celular total ou de proteína. (A-C) Análise de qRT-PCR do nível de mRNA de TWIST1, caracol, PDCD4, vimentina e E-caderina em AGS, SGC-7901 e as células BGC-823. Todos os valores foram normalizados para a p-actina ARNm na mesma amostra. (D) Análise Western blot da expressão de proteínas alvo 5 em células de controlo e células superexpressão PDCD4. (E-G) resultados de Western blot foram quantificados (ImageJ) e o nível de proteína alvo foi normalizada para p-actina. Os dados são média ± SD de 3 ensaios independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 versus pEGFP-C1 con

4.. A EMT é regulada pelo CagA via inibição PDCD4 em células epiteliais gástricas

Com base nas conclusões acima, as hipóteses de que o processo EMT induzida por

H. pylori

CagA ocorreu por downregulating PDCD4, que co-transfectadas células epiteliais gástricas com plasmídeo CagA e PDCD4 plasmídeo superexpressão. A expressão diminuída de PDCD4 foi recuperado com CagA e sobre-expresso PDCD4 transfecção. Assim, o aumento da expressão de vimentina TWIST1 e foi inibida e a diminuição da expressão de E-caderina foi regulada positivamente no grupo co-transfectadas. Estas alterações ocorreram em ambos o ARNm e os níveis de proteína (Fig. 4A-G). A migração da linha celular de cancro gástrico humano SGC-7901 transfectadas com plasmídeos foi determinada por ensaio de invasão de Matrigel. Os resultados mostram que foi induzida pelo plasmídeo CagA. Ensaio de migração celular também revelou que a sobre-expressão regulada negativamente PDCD4 CagA induzida por sua invasão e metástase capacidade (Fig. 5A). FIG. 5B mostra o número de células migradas de SGC-7901 em grupo transfecção CagA são, obviamente, mais do que grupo de controlo, enquanto que a quantidade de células migradas no grupo de co-transfecção é significativamente menos do que o grupo de transfecção CagA. Os fenômenos biológicos demonstram promoção EMT pelo CagA foi recuperado em parte, pela expressão PDCD4 elevada. Com base nas evidências, inferir que PDCD4 pode ser necessária para

H. pylori

progressão do cancro gástrico mediada por CagA

Todos os experimentos foram divididos em três grupos:. 1) pCDNA3.1 + pEGFP-C1 (controle), 2) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1, 3) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4. De acordo com vários grupos, os correspondentes plasmídeos foram transfectados em AGS, a SGC-7901 e células BGC-823. Em seguida, as células foram colhidas para o mRNA e análise de Western blot. (A-C) Análise de qRT-PCR de ARNm de nível TWIST1, caracol, PDCD4, vimentina e E-caderina em linhas celulares de cancro gástrico. Todos os valores foram normalizados para a p- actina ARNm na mesma amostra. (D) Análise de Western blot de CagA, TWIST1, caracol, PDCD4, vimentina e expressão da proteína caderina-E em todas as células. (E-G) resultados de Western blot foram quantificados (ImageJ) e normalizado para p-actina. Os dados apresentados representam SD ± média de 3 experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 versus con,

Δ

P Art 0,05,

ΔΔ

P Art 0,01 versus pEGFP + CagA

(A) O experimento foi dividido em três grupos:. 1) pCDNA3.1 + pEGFP-C1 (controle), 2) pCDNA3.1- CagA + pEGFP-C1, 3) correspondentes plasmídeos pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4.The foram transfectados em células SGC-7901 de acordo com vários grupos. A capacidade de invasão e metástase de células foi analisada por ensaio de invasão de Matrigel. (B) quantitativos, o número de células migraram de SGC-7901 em três grupos. Os dados mostrados representam média ± DP de 3 experiências. *

P Art 0,05 em relação con,

Δ

P

. 0,05 em relação pEGFP + CagA

Discussão

A principais conclusões deste estudo são resumidas como segue: 1)

H. pylori

CagA é responsável pela indução de TWIST1 ou vimentina e inibição da E-caderina em células de cancro gástrico. 2) transição epitelial-mesenquimal induzida pelo CagA é em parte dependente de regulação PDCD4. 3) TWIST1 e PDCD4 envolve na EMT de câncer gástrico.

O câncer gástrico é um multi-passo e doenças gradual. O excesso de proliferação de células epiteliais é uma parte importante da angiogénese do tumor inicial ou crescimento inicial [5]. Subsequentemente, a invasão de células, inicialmente reflectida através da membrana basal, foi considerada um preditor de a fase final de cancro; que eventualmente leva à propagação metastática e mortalidade [26]. infecção patogénica pode causar tumorigênese cancro e transformação maligna de células hospedeiras. Como um importante fator de risco patogênico,

Helicobacter pylori

estavam intimamente relacionadas com úlcera péptica, linfoma do tecido linfóide associado à mucosa do estômago e adenocarcinoma gástrico [20], [27], [28], [29] . CagA, um dos fatores de virulência mais princípio de

H. pylori

, induz a ocorrência e desenvolvimento de câncer gástrico. A transformação maligna de células hospedeiras em rede envolve regulationary, incluindo numerosas proteínas celulares, RNA não codificante, e outras moléculas de actividade biológica. No entanto, os efeitos CagA subjacentes mecanismo sobre a mucosa gástrica é de forma complexa e pouco clara.

O EMT é um processo biológico altamente conservada no desenvolvimento embrionário de órgãos, o que permite que as células epiteliais para perder fenótipo epitelial e obter o fenótipo mesenquimal. Isto inclui a perda da polaridade celular em células epiteliais, perda da capacidade de ligar com a membrana basal, o acesso para o fenótipo mesenquimal, tais como uma maior migração e invasão, anti-apoptose, e a capacidade para degradar a matriz extracelular [8], [30] . EMT desempenha um papel essencial em doenças inflamatórias crónicas, doenças fibróticas, a progressão do tumor e processo de reconstrução de tecidos, especialmente na aquisição de capacidade migração e invasão por células epiteliais malignas. actividade anormal na epith EMT de células epiteliais adulto inibiam moléculas de adesão celular, causaram diminuição da capacidade de adesão celular, e desse modo activado células tumorais para espalhar no corpo, em última análise, promovendo a metástase tumoral [31], [32], [33]. Portanto EMT é considerado o início da invasão e metástase e é também um sinal de forte capacidade de invasão e metástase de células tumorais.

H.pylori

induz transição epitelial-mesenquimal por TNF-α induzir proteína [34]. O presente estudo indica CagA pode levar células epiteliais para alterações morfológicas. Tem sido proposto que a expressão CagA não foi apenas suficiente para romper junções apicais mas também se assemelham a epitélio mesenquimal em células de rim de canino Madin-Darby [35]. As células epiteliais infectadas pela bactéria apareceu várias mudanças genômica, e os efeitos sobre os marcadores EMT induzida por

H. pylori

foi, provavelmente, em uma forma relacionados com cagPAI. Os dados mostraram que mesenquimais transição epitelial (EMT) genes relacionados com foram para cima ou para baixo-regulado por CagA-positivas

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estirpes em AGS [36], [37]. De nota, a rede reguladora do CagA envolvendo na EMT de câncer gástrico é ainda precisam ser esclarecidos.

Para investigar o mecanismo específico de EMT promovido pelo CagA no câncer gástrico, comparamos genes expressão de não-adjacentes tecidos de tumor e os tecidos do carcinoma gástrico por imuno-histoquímica. Os resultados indicaram que a expressão TWIST1 /vimentina em tecidos de carcinoma foram maiores do que os tecidos não tumorais adjacentes, e a sua expressão em tecidos de carcinoma de média /baixa diferenciação maior do que os tecidos elevada diferenciação. No entanto, a E-caderina e PDCD4 diminuiu no processo da transição epitelial-mesenquimal em cancro gástrico. Interessantemente, ele existe em uma correlação negativa para a expressão de TWIST1 e PDCD4. O nosso estudo sugere que os genes relacionados com o EMT estão associados com o processo de cancro gástrico, consistente com estudos anteriores observar a perda de proteína de células epiteliais e /ou a aquisição de a expressão de proteínas mesenquimais ocorreu no carcinoma gástrico. Além disso, eles foram, respectivamente, correlacionada com a histologia pouco diferenciado, estágio avançado e pior prognóstico do paciente [38]. Além disso, é uma molécula PDCD4 recém-descoberto que desempenha um papel vital em muitos processos biológicos que podem causar doença ou a ocorrência e o desenvolvimento do tumor. PDCD4 inibe o processo de tradução por ligação ao factor de iniciação da tradução eIF4A ou eIF4G. Diferentes indutores de apoptose estimular as células e regular positivamente a expressão de PDCD4, que poderia regular ainda P21, Cdk4, anidrase carbônica II e JNK /c-Jun /AP-1. PDCD4 poderia inibir relacionadas com a invasão uroquinase receptor do ativador do plasminogênio expressão, invasão ou infiltração dos vasos sanguíneos, e metástase; por conseguinte, a diminuição da expressão de PDCD4 desempenha um papel importante na ocorrência de tumor, desenvolvimento e prognóstico [17], [33], [39], [40]. Então, nós nos perguntamos se TWIST1 e PDCD4 participou da EMT induzida por CagA.

Em seguida, foram detectados fatores de transcrição e marcadores associados a EMT de expressão em linhas celulares de cancro gástrico CagA-transfectadas. Nossos dados mostraram que

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CagA poderia up-regular a expressão de TWIST1 e vimentina mas não caracol, e para baixo regular a E-caderina e PDCD4 em linhas celulares gástricas (AGS, SGC-7901 e BGC-823). Os resultados não foram afetados pelo estado de diferenciação da célula transfectada. Apesar de não observar as mudanças morfológicas das células CagA-transfectadas, invasão e capacidade de metástase das células cancerosas gástricas pode ser acelerada por CagA via transpoço ensaio de invasão celular. Isto é em parte causado por a heterogeneidade funcional de CagA em diferentes tecidos. Assim, o efeito da EMT induzida por

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precisava ser mais explorado. MiR-21 promovido processo de diferenciação miofibroblastos induzida por TGF-β, visando PDCD4. TGF-β induzida miR-21 de expressão em fibroblastos e miR-183 downregulated PDCD4 e inibiu a apoptose induzida por TGF-β em células de carcinoma hepatocelular humano [41], [42]. Enquanto isso, TGF-β regulada CARACOL, TWIST, ou ZEB1 e afetou a EMT e metástase [43]. Além disso, PDCD4 foi encontrado para ser envolvida na transcrição também. Com efeito, o terminal COOH de TWIST1 contendo o domínio básico helix-loop-helix foi sugerido que mediou a interacção directa com proteínas PDCD4. Assim, PDCD4 interage com o domínio de ligação ao ADN de TWIST1 e inibe a sua capacidade de ligação ao ADN de genes alvo em células de cancro da próstata humanos [22] .Portanto, que ainda testado se PDCD4 poderia regular TWIST1 em células de cancro gástrico. Nosso estudo mostrou que TWIST1 foi baixo regulada por PDCD4 plasmídeo alta expressão por PCR em tempo real e western blot, enquanto expressão de E-caderina foi oposto ao TWIST1 na AGS, SGC-7901 e BGC-823. A expressão de mRNA de Snail foi regulada negativamente em AGS e SGC-7901, enquanto preotein expressão não foi observado as mesmas alterações. Pode ser devido à complexidade da síntese de proteínas. Ou seja, a proteína não só está regulamentada em nível de transcrição, mas também tradução e virar nível. Ocasionalmente, parece que o ARNm não é uma indicação directa do nível de proteína nas células. Última, realizamos mais pesquisas sobre o papel das PDCD4 em transição epitelial-mesenquimal induzida pelo CagA. células epiteliais gástricas foram transfectadas com o plasmídeo de expressão CagA e PDCD4 plasmídeo superexpressão simultaneamente. Restauração de expressão PDCD4 poderia inibir TWIST1 e vimentina, e induzir a E-caderina, que regulado por CagA, PDCD4 também foi certificado que poderiam afetar a capacidade de invasão e metástases em células gástricas pelo ensaio matrigel invasão. Embora mais estudos são necessários para testar esta hipótese, nós basicamente concluiu que a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo CagA é em parte dependente de regulação PDCD4.

Em resumo, demonstramos que

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CagA induzir a expressão TWIST1 e EMT em células cancerosas gástricas regulando PDCD4 (Fig. 6). Nós fornecemos algumas dicas sobre a rede molecular do câncer gástrico induzida por

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infecção, e fornecer uma base teórica para PDCD4 como um alvo biológico para o diagnóstico ou tratamento do cancro. mouse modelos de pesquisa envolvendo futuros pode levar a uma melhor compreensão do papel da PDCD4 no

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EMT induzida de câncer gástrico.

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