Sumário

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes, que são reguladores críticos de várias doenças. MicroRNA-20a (miR-20a) foi previamente significativamente alterada numa gama de cancros. Neste estudo, foi detectada a relação entre o miR-20a e o desenvolvimento de cancro cervical por qRT-PCR, verificou-se que o nível de miR-20a expressão foi significativamente mais elevada em doentes com cancro do colo do útero do que em controlos normais, a expressão aberrante de miR -20 foi correlacionada com metástases em linfonodos, grau histológico e diâmetro do tumor. Então, nós estabelecemos com sucesso as linhas celulares de cancro estáveis ​​anti-miR-20a cervicais por lentivírus. Inibido miR-20a impediu a progressão do tumor, através da modulação do ciclo celular, apoptose, e metástase in vitro e in vivo. TIMP2 e ATG7 foram provou ser alvos directos de miR-20a, utilizando o ensaio de luciferase e Western blot. Estes resultados indicam que o miR-20a suprime a proliferação, migração e invasão de célula de cancro do colo do útero através de segmentação e ATG7 TIMP2. Os resultados suportam o envolvimento de miR-20a na tumorigênese do colo do útero, especialmente linfonodo metástases. Propomos que miRNAs pode ser usado como agente terapêutico para o câncer cervical

Citation:. Zhao S, Yao D, Chen J, Ding N, Ren F (2015) miR-20a Promove Cervical Cancer Proliferação e Metástase In Vitro e in vivo. PLoS ONE 10 (3): e0120905. doi: 10.1371 /journal.pone.0120905

Editor do Academic: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 25 Setembro, 2014; Aceito: 27 de janeiro de 2015; Publicação: 24 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro dos arquivos de informações de apoio

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Guangxi Natural Science Foundation (No.2011GXNSFA018184 e 2013GXNSFBA019132), National Natural Science Foundation da China (No.81460398), e apoiado pelo Departamento de Saúde de Guangxi (No.Z2013018). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical é o segundo tipo mais comum de cancro nas mulheres em todo o mundo, que é uma das principais causas de morte por câncer, resultando em cerca de 300.000 mortes por ano [1]. A maioria dos pacientes com câncer cervical receberam radioterapia padrão e quimioterapia. No entanto, os resultados clínicos variar significativamente. De acordo com o mundo, havia cerca de 500.000 novos casos cada ano, 85% dos tipos patológicos foram carcinoma de células escamosas. Embora a triagem citologia cervical beneficia muito na detecção e tratamento precoce nas últimas décadas, as taxas de morbidade do câncer cervical permanecem elevados, e havia mais e mais casos jovens recentemente. Assim, muitos pesquisadores se dedicam a encontrar patogênese e terapia de tumores mais eficaz. microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes de aproximadamente 21-25 nucleotídeos (nt) e atuam como reguladores pós-transcricional da expressão gênica [2]. Estas pequenas moléculas têm sido encontrados para regular os genes envolvidos em processos biológicos diversos, tais como a proliferação celular, o desenvolvimento, diferenciação, apoptose e outros. Numerosos estudos têm demonstrado que as alterações na síntese miARNs em cancros humanos estão muitas vezes relacionados com o desenvolvimento de tumores, progressão e metástase [3]. Nossos primeiros experimentos por matrizes de hibridação comparou o perfil de expressão de microRNA entre os tecidos cervicais normais e cervicais escamosas tecidos carcinomas, 89 miRNAs foram examinados, e miR-20a foi regulada de forma significativa. MiR-20a foi conhecida por pertencer ao cluster miR-17-92, que é o aglomerado mais extensivamente estudada que tem uma função oncogénica [4]. Neste estudo vamos nos concentrar no miR-20a que poderia ser um ponto de partida promissor para o desenvolvimento futuro terapia do cancro do colo do útero à base de miRNA.

Materiais e Métodos

Declaração de ética

A processo de aprovação e a condutância deste estudo foram aprovados pelo Comitê da Universidade Medical Guangxi Ética. O estudo foi realizado em conformidade com os princípios estabelecidos na Declaração de Helsinki. Os dados foram coletados de forma anônima. Consentimento informado verbal foi obtido de todos os assuntos, testemunhou, e formalmente registrado para cada pesquisa. O consentimento por escrito para a utilização de amostras para fins de investigação foi obtido de todos os pacientes antes da cirurgia. experiência com animais foi realizado em estrita conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos EUA National Institutes of Health, e o protocolo do estudo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Medicina de Guangxi.

pacientes e amostras

amostras de tecido do colo do útero foram coletadas a partir do departamento de oncologia ginecológica, o tumor Affiliated Hospital de Guangxi Medical University, entre 2010 e 2011. Oitenta amostras de cancro do colo do útero da Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO ) stageⅠ-ⅱA foram obtidas de pacientes submetidos a tratamento cirúrgico. Vinte amostras de stageⅡB-Ⅳ foram obtidos a partir de biópsia cervical. Todas as amostras foram carcinoma de células escamosas. Nenhum tratamento local ou sistêmico anterior tinha sido realizados sobre esses pacientes antes da operação ou biópsia. LNM foi confirmado em pacientes de estágio Ⅰ-ⅡA que usamos operação para o primeiro tratamento. A idade média dos pacientes foi de 49 anos, com um intervalo de 25 a 69 anos. amostras de epitélio cervical normal foram coletados de 120 pacientes que tiveram histerectomia por doenças benignas. A idade média para indivíduos do grupo controle foi de 45 anos, variando de 33 a 57 anos. Os tecidos foram congelados em azoto líquido imediatamente após a remoção cirúrgica e armazenado a -80 ° C até à sua utilização.

quantitativa em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase

O ARN foi extraído a partir de tecidos de cancro do colo do útero frescos congelados, tecidos do epitélio cervical normal e células de cancro do colo do útero, utilizando o kit de isolamento de miRcut miARN (Tiangen, China) de acordo com as instruções do fabricante. As reacções de transcrição reversa foram realizadas utilizando um Kit MiraMasTM (Bioo científica, EUA), que contém poli polimerase (A) utilizado para poliadenilação de miARN. qRT-PCR foi realizada utilizando um kit padrão SYBR Green PCR (Takara, Japão) .Os iniciadores foram sintetizados (Xangai GenePharma, China) como se segue: o miR-20a encaminha iniciador: TAC AAA GAT CTT ATA GTG GTG CAG GTA G. U6 frente iniciador: ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT. Universal iniciador inverso: GTC CTT GGT GCC CGA GTG. A mistura de PCR 20 l consistia em 12,5 ul SYBR supermix Verde, 3,5 mL de água livre de RNase, 1 mL primers para a frente, 1 primers ul reversa e 2 reverter ul produto transcrito. As condições de reacção foram 40 ciclos de amplificação de 95 ° C durante 3 min, 95 ° C durante 12 s, e 62 ° C durante 50 s utilizando um bio-chromo4 (Bio-Rad, EUA) quantitativa em tempo real do sistema de PCR. U6 foi utilizado como referência para miRNAs. Cada amostra foi analisada em triplicado. ciclo limiar comparativa (CT) Método vezes mudança (2-ΔΔCT) foi utilizado para analisar mudanças relativas.

Cultura celular

As linhas celulares CC SiHa, HCC94, C33A e CaSki foram obtidos a partir laboratório Central do Hospital Tumor Affiliated de Guangxi Medical University. Estas células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% em meio RPMI-1640, com soro bovino fetal a 10%.

Estabelecer as linhas cervicais anti-miR-20a estáveis ​​de células de cancro por lentivírus

os vetores lentivirais com miRNAs que foram baseadas no quadro de miR-20a foi construído pelo GeneChem Company (Xangai, China). Resumidamente, o oligonucleótido de cadeia dupla que codifica anti-miARN e controlo negativo foram emparelhados e inseridos no eucariótica Pfu-GW-009 vector linearizado (GeneChem). Todos estes vectores foram confirmados por sequenciação. Os vectores e os vectores de recombinação de embalagem (pHelper 1.0 e 2.0) (pHelper GeneChem) foram co-transfectados para células 293T (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) com Lipofectamine2000 (Invitrogen). Os sobrenadantes de cultura foram colhidos às 48 horas após a transfecção, concentrada. Todos os vectores lentivirais expresso aumentada verde proteína fluorescente (GFP), o que permitiu a tittering e medindo a sua eficiência de infecção nas células infectadas. As células foram divididas em três grupos de acordo com os nossos objectivos: a: sem infecção do vírus (NC); b: a infecção do vírus de controlo (NC-LV); c:.. a infecção de anti-miR-20a vírus (anti-miR-20a-LV)

função de biologia celular no ensaio de viabilidade vitro

Cellular

A capacidade de proliferação celular foi medida com o ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT). Vinte e quatro horas após a transfecção, 1 × 10

4 células foram semeadas em placa de 96 poços de microtítulo durante 24, 48, 72, e 96 h, respectivamente. Em seguida, as células foram incubadas com 20 ul de MTT (5 mg /ml, pH = 7,4) durante 4 h a 37 ° C e 150 uL de sulfureto de dimetilo foram adicionados para solubilizar os cristais durante 20 min à temperatura ambiente. A densidade óptica (OD) foi medida a um comprimento de onda de 490 nm. Todos os experimentos foram realizados três vezes e foram calculados utilizando resultados médios, que usamos para desenhar as curvas de crescimento. taxa de inibição do crescimento foi calculada como se segue: (AC-AT) /AC × 100% (AC = valor de absorção do NC e AT = valor de absorção do grupo experimental)

ensaio de ciclo celular.. As células foram fixadas em etanol a 70% durante 2 h a 4 ° C. Após lavagem com PBS, as células foram tratadas com ARNase (50 ug /ml) e coradas com iodeto de propídio (25 ug /ml) durante 30 min a 37 ° C. As amostras foram analisadas usando um citômetro de fluxo e distribuição de fases do ciclo celular foi determinada utilizando Modfit Software (BD Biosciences). O índice proliferativo foi calculada como a percentagem de células em S /G2 /M-fase.

ensaio celular apoptose.

As células foram recolhidas e coradas com anexina V-PE e utilizando 7AAD anexina Kit de V-PE (Beckman) de acordo com o protocolo do fabricante e submetidas a análise citométrica de fluxo.

ensaio invasiva e migração.

50.000 células foram semeadas em Transwell Insert (Corning) suplementado com 1640 com 10% de soro. O lado inferior da transwells foi preenchido com 1640 com 20% de soro. Para o ensaio de transmigração, Matrige l (BD Biosciences) foi semeada em Transwell Insert e deixou-se crescer até à confluência durante 1 dia. 50.000 células foram semeadas em inserções Transwell suplementado com 1640 com soro a 10%. O lado inferior da transwells foi preenchido com 1640 com 20% de soro. Após 24 horas, as membranas foram coradas utilizando coloração com hematoxilina-eosina, as células foram contados sob o microscópio de fluorescência. Esta experiência foi realizada de forma independente três vezes em duplicado.

ensaio de formação de colónia.

Cerca de 500 células foram colocadas numa placa de 6 poços fresco durante mais 12 h e mantidas em RPMI 1640 contendo 10% SBF durante 2 semanas. As colónias foram fixadas com metanol e coradas com 0,1% de violeta cristal em 20% de metanol durante 15 min. As células foram contadas sob um microscópio fluorescente. Esta experiência foi realizada de forma independente por três vezes em duplicata.

Ensaios In Vivo para a proliferação do tumor

Vinte e quatro de 6 semanas de idade, pesando 19-21 g imunodeficientes bege /nu /xid nu /nu feminino os ratinhos foram adquiridos a partir de Guangxi Medical University, e mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos com ração irradiada. Na nossa experiência, 2 × 10

6 células de diferentes grupos em 0,2 mL de PBS foi injectada subcutaneamente no tronco de 24 ratos, que conduz à formação de um tumor por animal. hidrato de cloral 0,2 ml foi injectado por via intraperitoneal para captar imagens fluorescentes após a anestesia quando o diâmetro do tumor era de 2 cm. Desenhe a curva de crescimento. O crescimento do tumor foi monitorado pelo volume do tumor, que foi calculado conforme descrito:. Desconto (mm

3) = largura

2 (mm

2) × comprimento (mm) /2

western blot

As proteínas celulares foram preparadas utilizando tampão de lise celular (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% de NP-40, 2 mM de EDTA, 10 mM de NaCl, 2 mg /ml de aprotinina, 5 mg /ml leupeptina, 2 mg /mL de pepstatina, 1 mM de DTT, 0,1% de SDS e 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo). Quantidades iguais de proteína (50 ug) foram separados por 10% SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de nitrocelulose (NY, USA) por electrotransferência. As membranas foram bloqueadas com BSA a 5% em TBST (Tris-HCl a 10, pH 8,0, NaCl a 150 mM e 0,05% de Tween 20) durante 1 h, e, em seguida, incubadas com anticorpos primários (Santa Cruz) durante a noite a 4 ° C antes de incubação subsequente com um segundo anticorpo (BD) durante 1 h a 37 ° C. A proteína foi visualizada utilizando reagente de quimioluminescência aumentada (Santa Cruz).

Luciferase Assay

Os locais da UTR 3 ‘ATG7 /TIMP2 mutante ou UTR 3’ de ligação de miR-20a foram clonados no repórter pGL3 vector de luciferase (GeneChem). Para o ensaio de repórter, 100 nM de miR-20a mímica ou controlar miARN foi co-transfectada com 0,1 ug do tipo selvagem ou ADN plasmídicos pGL3-3’UTR mutantes em células SiHa em placas de 96 poços utilizando Lipofectamine 2000. A actividade de luciferase foi medida 48 horas após transfecção como descrito anteriormente.

a análise estatística

Todos os dados foram processados ​​usando PASW Statistics 16. Os dados foram apresentados como média ± SEM. usando testes t para comparações 2-grupo. Embora os resultados não apresentaram distribuição normal, optou-se por analisar os dados com métodos não paramétricos. (Teste de Mann-Whitney U e entre dois grupos de teste de Kruskal-Wallis H para três ou mais grupos). A

P

valor menor que 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados

miR-20a é regulado para cima em Câncer cervical

Usando um qRT- método de PCR, os níveis de miR-20a foram detectados em 100 tecidos de cancro do colo do útero e do colo do útero 120 tecidos normais, bem como linhas de células cervicais. Entre os 100 pacientes com câncer cervical, os dados relatados na Fig. 1A mostra miR-20a é definitivamente-regulada no tecido prejudicada com mediana de 6,92, o que sugere que o aumento de miR-20a foi um evento frequente no cancro cervical. Pacientes com expressão sobre-regulada de miR-20a tendem a ter LNM (

P

= 0,001) como na Fig. 1B, o aumento dos tamanhos dos tumores (

P

= 0,013, Mann-Whitney U), estágio avançado (

P

= 0,004, Kruskal-Wallis H), e grau histológico avançado (

P

= 0,027, Mann-Whitney U) de câncer cervical. Estes resultados sugerem que o miR-20a pode desempenhar um papel crítico na metástase do cancro do colo do útero e progressão

A:. MiR-20a foi medida por qRT-PCR. Dados foram apresentados como log10 de fold-change. O teste de Mann-Whitney foi realizado para analisar a diferença entre os controlos normais e pacientes com cancro do colo do útero, de Kruskal-Wallis H teste foi utilizado para definir a diferença entre as fases I-IV de doentes com cancro do colo do útero. B: Nós comparamos a expressão entre os pacientes que tiveram metástase lymp ou não no mesmo palco. C: Os níveis de miR-20a expressão foi detectada por qRT-PCR em linhas celulares de cancro do colo do útero (SiHa, HCC94, C33A e Caski).

P

-valor. 0,05 foi considerado significativo

Além disso, os níveis de miR-20a expressão foram detectados por qRT-PCR em linhas celulares de cancro do colo do útero (SiHa, HCC94, C33A e CaSki) (Fig. 1C), que foi mais elevada na linha de células SiHa.

miR-20a facilita o crescimento do câncer do colo do útero e metástase in vitro

Observando a correlação entre-regulada níveis de miR-20a e progressão do cancro do colo do útero, investigamos o efeito de miR-20a sobre as capacidades de crescimento, migração e invasão de linhas celulares de cancro do colo do útero. linha de células SiHa foi infectado com qualquer anti-miR-20a ou controlo lentivírus e estabelecer a linha de células SiHa estável anti-miR-20a (Fig. 2A). Em comparação com a expressão do grupo de controlo, o miR-20a foi significativamente regulada para baixo na linha de células SiHa após a infecção com anti-miR-20a-LV (Fig. 2B). As células foram divididas em três grupos de acordo com os nossos objectivos: a: sem infecção do vírus (NC); b: a infecção do vírus de controlo (NC-LV); c:. contaminação de anti-miR-20a vírus (anti-miR-20a-LV)

A: GFP fluxo rotulagem citometria análise indicou que a percentagem de células positivas para GFP foram cerca de 97% no estábulo lentivírus-infectados linha de células SiHa. B:. MiR-20a foi expressa menor em linha de células SiHa anti-miR-20a estável, enquanto o nível de miR-20a expressão era ainda muito elevado em células infectadas com controle negativo

Em seguida, o crescimento celular características, ciclo celular, formação de clones, migração celular, adesão, foram realizadas experiências de invasão de células. As curvas de crescimento mostrou que a infecção de crescimento linha celular de cancro cervical anti-miR-20a retardado (Fig. 3A). A citometria de fluxo mostrou que o período médio de G1 de células no grupo de anti-miR-20a-LV é de 69,6%, enquanto o grupo de controlo correspondente foi de 55%, é na redução do ciclo de proliferação de células (Fig. 3B). taxa apoptótica foi aumentado e chegou a diferenças significância estatística em cada grupo (

P Art 0,001) (Fig. 3C). Migração, também foi detectada capacidade de adesão da invasão em células de câncer cervical, miR-20a poderia facilitar a metástase (

P Art 0,01) (Fig. 3D e 3E). A taxa de formação de colônias dos dois grupos, houve diferença significativa (

P Art 0,05) (Fig. 3F). Como esperado, down-expressão de miR-20a suprimiu significativamente habilidades de proliferação celular, migração e invasão

A:. Reguladas-Down miR-20a proliferação celular significativamente inibida em células SiHa por ensaio MTT. B: ciclo celular determinada por citometria de fluxo de coloração de PI. C: apoptose celular detectada por Anexina V-PE fluxo combinado citometria rotulagem, a taxa de apoptose aumentou e atingiu significância estatística diferenças em cada grupo. D, E representados os resultados de invasão celular e migração através da membrana com ou sem Matrigel, que mostrou que o anti-miR-20a reduzida a capacidade de migração celular e invasão. F: As taxas de formação de colónias de estes três grupos não apresentaram diferença significativa

miR-20a aumenta o crescimento tumoral in vivo

Com base nos decréscimos observados nos comportamentos migratórios, invasivos e proliferativa. em células SiHa infectadas com anti-miR-20a-LV, o próximo investigou o papel de miR-20a in vivo. Nós inoculados subcutaneamente ratinhos nus com um número igual (1 × 10

6 células por rato) de células SiHa com a expressão forçada de miR-20a ou NC, a incidência tumoral foi avaliada a cada cinco dias, e tumores apareceram em todos os ratinhos. Os resultados mostraram que lentivírus mediada por anti-miR-20a pode suprimir significativamente o crescimento de xenoenxertos de cancro do colo do útero em ratinhos nus (Fig. 4)

A:. Modelo de cancro cervical humano transplantados subcutaneamente em ratinhos nus foi criada. No final da experiência, os volumes dos tumores foram medidos para desenhar a curva de crescimento de diferentes grupos. No modelo de tumor subcutâneo a dimensão do tumor no grupo experimental é menor do que no grupo de controlo. Houve uma diferença significativa entre cada grupo (

P Art 0,01). B:. Fotos de tumores em cada grupo

miR-20a Diretamente Metas e inibe ATG7 e TIMP2

Para entender como miR-20a facilita o crescimento do câncer cervical e metástases, foram utilizados três algoritmos (TargetScan, PicTar e Miranda) para ajudar a identificar alvos de miR-20a em cancros cervicais humanos. Destes genes alvo que foram previstos por todas as três algoritmos (Fig. 5a), relacionada autofagia proteína 7 (ATG7) e inibidores de tecido de metaloproteinase 2 (TIMP2) chamou nossa atenção como imediatamente eles têm sido implicados na tumorigénese e metástase. Nós clonado a ATG7 e TIMP2 3′-UTR num vector repórter de luciferase. ensaio de luciferase revelou que o miR-20a directamente ligado a ATG7 e TIMP2 3′-UTR, e através do qual ele notavelmente reduzida actividades da luciferase (Fig. 5B). No entanto, a mutação dos locais de miR-20a putativos no 3′-UTR de ATG7 e TIMP2 revogada a capacidade de resposta da luciferase para miR-20a. Para avaliar diretamente o efeito de miR-20a em ATG7 e TIMP2 expressão, foi realizada a análise western blot. Como pode ser visto na Fig. 5C, knockdown de miR-20a, através de infecção de anti-miR-20a-LV, em células SiHa aumentou os níveis de proteína ATG7 e TIMP2. Tomados em conjunto, estes resultados indicam ATG7 e TIMP2 são alvos a jusante diretas para miR-20a em células SiHa. Os resultados acima levaram-nos a examinar se miR-20a suprime o crescimento do câncer cervical e metástases através de reprimir ATG7 e expressão TIMP2

A:. Previsto emparelhamento consequente da região alvo e miRNA por TargetScan, PicTar e Miranda. B: A actividade da luciferase exibida uma diminuição significativa após miR-20a expressão aplicada em comparação com o grupo controle negativo. C:. Análises de Western blot knockdown mostrou de miR-20a, através de infecção de anti-miR-20a-LV, em células SiHa aumentou os níveis de proteína ATG7 e TIMP2

Discussão

A nossa grupo tem vindo a apostar no mecanismo molecular de desenvolvimento de carcinoma de células escamosas do colo do útero nos últimos anos, especialmente a dedicar à investigação de crescimento e metástase. metástase ganglionar (LNM) é o mais importante fator prognóstico dos pacientes com estágio IB ou IIA, a taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes declina drasticamente de cerca de 80-95% em pacientes sem metástases linfáticas, a cerca de 50-65% em pacientes com linfonodos positivos. Portanto, espera-se que a desregulamentação dos microRNAs pode facilitar o progresso avançado de carcinoma de células escamosas do colo do útero. Zhang J, et al lançar luz sobre o regulador negativo da NF-kB /miR-130a /TNF-α /NF-kB no cancro do colo do útero e pode fornecer insights sobre a carcinogênese do câncer [5] cervical. Wen SY, et ai verificaram que o miR-506 foi expressão sub-regulada em aproximadamente 80% do cancro do colo do útero e as amostras examinadas inversamente correlacionada com a expressão de Ki-67 [6]. Entre miARNs oncogénicos, um dos mais bem caracterizados é miR-17-92, um cluster de miARN policistrónico, designado como OncomiR-1 [7]. A transcrição precursor contém estruturas em grampo haste-laço de seis em tandem que, finalmente, produzir seis miRNAs maduros: miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 e miR-92-1 [8]. Em particular, o miR-17-92 está localizado em 13q31.3, uma região amplificada em várias malignidades hematopoiéticas e de tumores sólidos, incluindo os linfomas difusos de células B, os linfomas foliculares, linfomas de Burkitt, carcinoma do pulmão e [9].

descobertas recentes indicam que estas miARNs são componentes das vias moleculares que regulam o desenvolvimento do tumor e de manutenção do tumor integrado, os efeitos da sobre-expressão de miR-20a foram examinadas em vários modelos animais, os cancros humanos, e sistemas de culturas de células quanto à sua capacidade para regular um certo número de processos celulares que favorecem a transformação maligna [10-11]. Estes estudos como um todo revelou que as funções de miR-20a pleiotropicamente tanto durante o desenvolvimento normal e a transformação maligna para promover a proliferação, diferenciação inibir, aumentar a angiogénese, e sustentar a sobrevivência celular. No entanto, a função potencial deste microRNA na progressão do carcinoma de células escamosas do colo do útero humano tem alguns relatórios. No presente estudo, estamos interessados ​​no papel potencial do miR-20a na progressão maligna de células SiHa.

Neste estudo, descobrimos que miR-20a foi frequentemente sobre-regulada em amostras de tecido. Assim, suposto que o miR-20a pode ser uma nova oncogene do tumor e a sua desregulação miARN pode envolver o progresso avançado de cancro humano. Em seguida, investigou-se a função de miR-20a em células SiHa. Estabelecer as linhas celulares de cancro do colo do útero anti-miR-20a estáveis ​​por lentivírus, e preceder a características de crescimento celular, ciclo celular, formação de clones, a migração celular, adesão e experiências de invasão. O modelo de miR-20a xenoenxertos de cancro cervical expressa-down em camundongos nus Também foi estabelecido que explorar o potencial de anti-miR-20a in vivo. Em seguida, verificou-se que inibiu o miR-20a impediu a progressão do tumor, através da modulação do ciclo celular, a proliferação, a apoptose, e invasão. As curvas de crescimento mostrou que a infecção do crescimento linha de células de câncer cervical anti-miR-20a desacelerou. O modelo de miR-20a xenoenxertos de cancro cervical expressa-down em ratinhos nus foi estabelecida, os resultados mostraram que lentivírus mediada anti-miR-20a pode suprimir significativamente o crescimento de xenoenxertos de cancro cervical em ratinhos nus.

Nós ainda mais ATG7 caracterizado e TIMP2 alvos como funcionais de miR-20a por ensaios de gene repórter de luciferase e análise de western blot, respectivamente. Autophagy proporciona componentes citoplasmáticos para os lisossomas para a degradação e a reciclagem dos produtos de degradação, tais como aminoácidos, hidratos de carbono e lípidos que são utilizados para sintetizar novas proteínas e organelos ou metabolizados para fornecer energia [12]. Autophagy está intimamente associada com a morte da célula eucariótica e a apoptose. Na verdade, em alguns casos, as mesmas proteínas controlar tanto autofagia e apoptose. Apoptótica de sinalização podem regular a autofagia e inversamente autofagia pode regular a apoptose. Tem sido proposto que “morte celular autophagic” é um outro tipo de morte programada “activo” [13]. ATG7 é um dos reguladores principais da autofagia processo, responsável por duas reacções principais envolvidas na formação e na vesícula autophagosome progressão [14]. Além disso, já foi estabelecido que Atg7 – /- knockout camundongos morrem dentro de um dia desde o nascimento e show de redução do tamanho filhote, devido a uma via de autofagia deficiente [8]. Yoshihiro Inami, et ai descobriram que a perda de Atg7 em fígado de rato provoca adenoma hepatocelular [15]. Através da utilização de moléculas de ganho ou perder, nós demonstramos que o miR-20a foi capaz de modular os níveis de expressão autofagia variando ATG7 endógenos, e este efeito foi mediado através de uma sequência de consenso de miR-20a contido na 3′-UTR do gene .

Durante o processo de invasão tumoral, etapas essenciais incluem a degradação das membranas basais e remodelação da matriz extracelular (ECM) por enzimas proteolíticas, tais como metaloproteinases de matriz (MMPs) sob regulação por inibidores de tecidos de metaloproteinases (TIMPs ). As MMPs, especialmente de MMP-2 e MMP-9, são enzimas chave conhecida para degradar os componentes da ECM circundante durante a invasão e metástase [16] do cancro. A previsão computacional de sítios miRNAtarget sugeriu TIMP2 talvez o alvo de miR-20a, que foi verificado por Westernblot ea luciferase ensaio também.

Conclusões

Os nossos resultados sugerem que a expressão de miR-20a pode estar relacionado com processo maligno de câncer do colo do útero, especialmente invasão e metástase alvejando ATG7 e TIMP2. Em larga escala e estudos de acompanhamento a longo prazo são necessários para confirmar a importância do miR-20a em câncer cervical. MiRNAs pode ser um alvo atraente para intervenção terapêutica.

Informações de Apoio

S1 Fig. . Vector Mapa de A: mapa Lentivírus Vector; B pGL3 mapa promotor vetor

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s001

(DOC)

S2 Fig. Lentivírus vetor de sequenciamento resultados

doi: 10.1371. /Journal.pone.0120905.s002

(DOC)

S1 conjunto de dados. . sequências de genes alvo por síntese química

Ambos os lados das sequências codificantes foram XbaI Enzima de Restrição locais de corte, zonas marcadas foram binging locais

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s003

(DOC)

S1 Table. Associação entre a expressão de miR-20a com características clínico-patológicas em pacientes com câncer cervical

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s004

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S2 Table. valor OD após a infecção (MTT)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s005

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S3 Tabela. A inibição do crescimento de xenoenxertos de SiHa em ratinhos nus por anti-miR-20a-LV

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s006

(DOC)