Abstract

carcinoma da nasofaringe (NPC) é um tumor maligno epitelial única associada ao EBV, mostrando fenótipo altamente invasivo e metastático. Apesar da evidência crescente demonstrando o papel crítico do câncer de células estaminais-like (CSCs) na manutenção e progressão de tumores em uma variedade de tumores malignos, a existência e as propriedades da CSC no NPC associada ao EBV são em grande parte desconhecido. Nosso estudo visa elucidar a presença eo papel dos CSCs na patogênese da doença maligna. células formadoras de esfera foram isolados a partir de uma linha celular NPC EBV-positiva C666-1 e suas propriedades de iniciação do tumor foram confirmadas pelo

in vitro Comprar e

in vivo

ensaios. Nestes esferóides,-regulação de vários marcadores de células tronco foram encontrados. Por citometria de fluxo, que demonstrou que tanto CD44 e SOX2 foram sobre-expresso na maioria das células formadoras de C666-1 esfera. As células CD44 + SOX2 + foi detectado em uma população menor em xenoenxertos EBV-positivas e tumores primários e considerado como potencial CSC no NPC. Notavelmente, as células CD44 NPC isolado + eram resistentes a agentes quimioterápicos e com maior eficiência de formação esferóide, mostrando propriedades CSC. Por outro lado, a análise microarray revelou um certo número de genes diferencialmente expressos envolvidos na regulação da transcrição (por exemplo,

FOXN4

,

GLI1

), a resposta imune (

CCR7

,

IL8

) e transporte transmembranar (por exemplo,

ABCC3

,

ABCC11

) nos esferóides. Entre estes genes, aumento da expressão de CCR7 em CD44 + CSCs foi confirmada em xenoenxertos de APN e tumores primários. É importante ressaltar que o bloqueio de CCR7 aboliu a capacidade de formação de esfera de C666-1

in vitro

. Expressão de CCR7 foi associada com doença recorrente e metástases à distância. O estudo atual definiu as propriedades específicas de uma subpopulação de CSC na NPC associada a EBV. Nossas descobertas proporcionaram novas perspectivas sobre o desenvolvimento de terapias eficazes que visem em CSCs, potenciando, assim, a eficácia do tratamento para pacientes NPC

Citação:. Lun SW-M, Cheung ST, Cheung PFY, a KF, Woo JK-S, Choy KW , et ai. (2012) CD44 + Cancer Stem Cells-Like em EBV-Associated nasofaríngea carcinoma. PLoS ONE 7 (12): e52426. doi: 10.1371 /journal.pone.0052426

Autor: David Loeb, da Universidade Johns Hopkins, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de julho de 2012; Aceito: 12 de novembro de 2012; Publicação: 21 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Lun et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado pelo Conselho de Bolsas de Investigação de Hong Kong (GRF: Grant No. 470.321, 471.610, 471.211, 471.709; GRF: Grant No. CUHK8 /CRF /11R; AoE /M-06/08) e do Conselho de Bolsas de Investigação (GRF776608M; GRF777809M). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Atualmente, co-autores Kwok-Wai Lo, Siu Tim Cheung, Pierre Busson e Sai Wah Tsao são membros da PLOS ONE conselho editorial. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Não-queratinizante carcinoma da nasofaringe (NPC) é um tumor maligno epitelial distinta decorrente da cabeça e na região do pescoço. Ele consistentemente associa com o vírus Epstein-Barr (EBV) e mostra característica clínica e patológica. Com a expansão clonal de uma única célula de progenitor infectadas com EBV, a expressão constitutiva de genes virais latentes e acumulação de múltiplas alterações genéticas contribuir para a iniciação e progressão de cancro esta [1], [2].

NPC demonstra forte preferência geográfica, mostrando alta prevalência no sudeste da Ásia, especialmente na região cantonês, incluindo Hong Kong, com uma incidência anual de 25-50 por 100.000 pessoas [1]. O principal tratamento para o NPC é ou radioterapia ou combinados quimio-radioterapia que mostra sobre a taxa de cura de 90% em pacientes com doença em estágio precoce [3]. No entanto, o resultado para pacientes com doenças loco-regional avançadas e metástases à distância são insatisfatórios. significativas taxas de recaída distante e metástase ainda ocorrem nesses pacientes após a radioterapia ou quimio-radioterapia. Um dos principais mecanismos de recorrência pós-terapêutica como da NPC tem sido sugerido pela “célula-tronco-como o cancro» (CSC) proposição [4].

De acordo com o modelo de CSC, os cancros são organizadas hierarquicamente semelhante para os tecidos normais e o crescimento do cancro e progressão são accionados por um pequeno subconjunto de células do tumor com propriedades semelhantes a células estaminais, os CSCs. Esta subpopulação de células raras é responsável pela iniciação do tumor, manutenção e regeneração [4], [5]. CSCs foram identificados em várias malignidades humanas, tais como cancro da mama, da próstata, do ovário, do pulmão e carcinoma de cabeça e pescoço [5], [6], [7], [8], [9]. A capacidade destas células para iniciar o crescimento do tumor, sustentam a auto-renovação e facilitam a resistência aos medicamentos têm sido extensivamente demonstrada. Considerando as propriedades únicas de CSCs, a recidiva de tumores são sugeridos para ser devido à incapacidade de erradicar todos os CSCs e CSCs sobreviventes depois reconstituir o tumor em regiões locais e distantes.

CSCs Embora tenham sido mostrados para ser vital no desenvolvimento da maioria dos cânceres, informações sobre sua existência na NPC associada ao EBV é escassa. De qualquer pesquisa foi realizada utilizando linhas celulares EBV-negativo ou não foi capaz de elucidar quaisquer CSCs funcionais [10], [11], [12]. Nosso grupo tem estabelecido anteriormente várias linhas tumorais EBV positivos de pacientes NPC em regiões endêmicas [13], [14], [15], [16] e usando estas células tumorais EBV positivos nativas, que teve como objetivo identificar e caracterizar NPC funcional CSCs.

neste estudo, as células formadoras de esfera ( “esferóides”) de linha de células EBV-positiva C666-1 foram isolados e as suas propriedades semelhantes a células-tronco foram confirmados. Nós revelaram que CD44 e SOX2 foram expressos na maioria destes CSCs. Por análise de microarray, foram identificados expressos de maneira aberrante genes celulares em CSCs. Curiosamente, CCR7, um receptor de quimiocina da superfície da célula, verificou-se ser consistentemente expressos em linhas de APN e tumores primários. Coincidentemente, foi sobre-expresso em nosso NPC CSCs identificados e a neutralização deste receptor aboliu a capacidade de formação de esfera de C666-1. O nosso estudo corrente fornecida primeira evidência para a presença de CSCs tumorigénicas em NPC EBV-positiva e CCR7 pode desempenhar um papel na sua função tumorigénico. Os resultados acima irá melhorar a nossa compreensão sobre a natureza do NPC CSCs, que é crucial no desenvolvimento de intervenções terapêuticas mais eficazes contra esta doença.

Resultados

Capacidades CSC de esferóides NPC-derivados EBV positivos

CSCs possuía a capacidade para formar esferas de tumor independente de ancoragem, quando cultivada em meio isento de soro especializado. Como mostrado na Figura 1A,-flutuantes livres de tumor esferas foram formadas quando as células foram cultivadas C666-1 dissociadas em placas não revestidas em meio para mastócitos isento de soro. esferóides não aderentes foram observáveis ​​em 6-8 dias e foram enzimaticamente dissociada em células individuais para passagem semanal. esferóides prototípicas distintos foram formados 28 dias após o plaqueamento. Esta auto-renovação flutuantes esferas de tumor poderia ser passado seriadamente e cultivadas por mais de 3 meses. Quando as células individuais a partir de esferóides foi cultivada em placas aderentes com meio completo (RPMI-1640 com FBS a 10%), as células aderiram à placa e sistemáticos colónias formadas, que mostram a morfologia das células epiteliais semelhante à das células parentais de monocamada C666-1 flutuante (Fig . 1A, painel da direita).

(a) de flutuação livre-esferas de tumor foram formadas a partir de células C666-1 EBV-positivo (painel esquerdo) e demonstraram capacidade de diferenciar comparativamente a monocamada de células após a administração de meio completo ( painel da direita). (B) por qRT-PCR, vários genes relacionados com a de células estaminais (OCT4, NANOG, ALDH1, CKIT, CD44, CD133) foram enriquecidas em esferóides quando comparado com C666-1 parental. A transcrição de SOX2 não foi aumentada nos esferóides. (C) proteína SOX2 foi frequentemente expressas em células formadoras de esfera C666-1. Por citometria de fluxo, SOX2-positivo (+) SOX2 células foram encontrados para ser enriquecido em e constituem mais de 60% da população de células formadoras de esfera. (D) Mais de 80% de células formadoras de esfera expressas marcador da superfície celular CD44 enquanto que as células CD44 + em detectados em C666-1 parental e outros xenoenxertos de APN foram significativamente menores (

P

0,001). Histogramas denotando média ± SE (n≥3) com significância estatística calculada pelo teste t (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001)

Para medir a capacidade tumorigénica de esferóides, vários números de células formadoras de esfera e células C666-1 parentais não selecionados foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus.. Descobrimos que 10.000 células formadoras de esfera pode formar tumores em todos os ratinhos inoculados (Tabela 1). A injecção de 1.000 células esferóides ocasionalmente formado um tumor dos seis ratos. No entanto, pelo menos, 500.000 células não seleccionadas foram C666-1 necessário para a formação de tumores. As células mostraram esferóides, pelo menos, 50 vezes mais elevado potencial tumorigénico do que as células não seleccionadas. Para verificar ainda se as células formadoras de esfera são capazes de propagação em série em ratinhos nus, a partir de xenoenxertos de esferóides foram desenvolvidos em série enxertados em ratinhos nus. Todos eles apresentaram transplantes bem sucedidos em série e tumores eram observáveis ​​em 3-4 semanas (dados não apresentados).

Em seguida, examinaram o padrão de vários marcadores de células estaminais e de antigénios de superfície em esses esferóides expressão. Por análise de qRT-PCR, verificou-se que a expressão de vários marcadores de células estaminais (OCT4, NANOG, ALDH1, CD44 e CD133) em esferóides foi significativamente maior do que o das células parentais C666-1 monocamada (All

P

0,05, Figura 1B).. O aumento da expressão CKIT, KLF4 e KLF5 nos esferóides também foi notada. Apesar de não detectar up-regulação da transcrição SOX2 nas células formadoras de esfera, expressando SOX2 (SOX2 +) células mostraram-se altamente enriquecido nos esferóides (70,8 ± 2,16%) por citometria de fluxo (todos os

P

0,001, Figura 1C).. Nós também detectou expressão SOX2 em 0,77 ± 0,13% de células em xenoenxertos de NPC. Os resultados confirmaram que os esferóides derivados de células C666-1 EBV-positivos apresentam fenótipos CSC.

Sphere-formação CSCs expressar a proteína superfície celular CD44

Uma vez que a transcrição de CD44 e CD133 foram significativamente aumentados em esferóides, que, em seguida, verificar se a expressão destes marcadores de superfície CSCs era específico para células formadoras de esfera NPC. Por citometria de fluxo e de coloração por imunofluorescência, que demonstraram que a maioria das células em esferóides C666-1 (84,14 ± 1,12%) foram positivas de CD44 (Fig. 1D e a Fig. S1). As células CD44 + foram também encontradas como uma subpopulação das células parentais C666-1 (5,28 ± 1,29%) e três xenoenxertos de APN, xeno-666 (12,31 ± 1,97%), xeno-2117 (9,58 ± 1,80%), e C17 (17,31 ± 1,76%) (Fig. 1D). No entanto, as células que expressam CD133-foi detectada apenas em 32,11 ± 2,35% das células de esferóides e 1,90 ± 0,84% das células parentais C666-1. Além disso, as células CD133 + estavam completamente ausentes em dois dos xenoenxertos (Xeno-666 e xeno-2117) (Fig. S2). Assim, propusemos que CD44 é um candidato CSC marcador de superfície comum para NPC EBV-positivo.

CD44 + células SOX2 Express e exibem maior Clone- e Sphere-formação Eficiência

A expressão de transcrição de células-tronco factor de SOX2 foi consistentemente detectados em uma sub-população de células tumorais em NPC primário e crê-se ser um marcador potencial para NPC CSCs [12]. Em consequência, avaliou-se a co-expressão de CD44 e SOX2 em esferóides e células C666-1 monocamada não seleccionada, bem como 3 e 5 xenoenxertos de tumores primários por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 2, mais de 60% das células de esferóide (66,57 ± 2,72%) expressaram tanto CD44 e SOX2. Coincidentemente, a expressão SOX2 foi raramente detectada na fracção CD44- de células formadoras de esfera C666-1, sugerindo uma expressão preferencial deste factor de transcrição de células estaminais em células CD44 +. A co-expressão de CD44 e SOX2 também foi detectada em 0,1-9% de células da linha de células de NPC, e xenoenxertos de tumores primários. Os resultados implicou que as células CD44 + SOX2 + são potenciais CSCs em NPC. Para provar esta hipótese, foram realizados ensaios funcionais em células CD44 + e CD44- isoladas a partir de células parentais C666-1. valores representativos de expressão de CD44 em células CD44 + e CD44- isolados são mostradas na Figura S3. Como mostrado na Figura 3A, significativamente maior eficiência de formação de clones foi detectada na fracção de CD44 + de células do que a de fracção CD44- (

P

0,01). Além disso, as células CD44 + podem gerar número significativamente maior de esferóides em comparação com as células CD44- (

P

. 0,001, Figura 3B).

por citometria de fluxo, SOX2 foi encontrado para ser preferencialmente expressa em células CD44 + e coincidentemente, expressão SOX2 raramente foi detectada em células CD44-. Células coexpress� tanto CD44 e SOX2 foram encontrados para ser enriquecido em esferóides. Histogramas denotando média ± SE (n≥3) com significância estatística calculada pelo teste t (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001)

CD44 + fracção de células exibiram uma significativamente maior (a) formação de clones eficiência e (B) a eficiência de formação de esfera, quando comparado com fracção de células CD44-. Além disso, (C) células CD44 + exibiram significativamente mais elevada taxa de proliferação de células CD44-. (D) recurso hierarquia de desenvolvimento de células CD44 +. Percentagem de CD44 + células foram continuamente reduzidos no CD44 + de células fração isolada ao longo do tempo. (E) células CD44 + exibiram maior resistência ao tratamento com 5-FU quando comparado com o CD44- e células parentais C666-1. Todos os gráficos que denota média ± SE (n≥3) com significância estatística calculada pelo teste t (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001)

proliferação de CD44 + células

por ensaio de proliferação WST1, as células CD44 + exibiram uma taxa de proliferação significativamente maior quando comparado com o CD44- e parental células C666-1, enquanto as células CD44- mostrou uma taxa de proliferação significativamente menor quando comparado com células C666-1 parentais. (todos P . 0,01, Fig 3C)

relação hierárquica de células CD44 + e CD44-

de acordo com propriedades CSC, que revelou que os C666-1 células CD44 + classificadas possuía a capacidade de dar origem tanto a CD44 + e as células CD44-. Como mostrado na Fig. 3D, uma diminuição da fracção de células CD44 + nas células escolhidas CD44 + foi detectada por citometria de fluxo ao longo do tempo. É provável que classificados células CD44 + dar origem a uma população heterogénea através da regulação negativa de CD44 num subconjunto destas células após cultura

in vitro.

No entanto, não houve mudança significativa na percentagem de fracção de células CD44 + em ambos não triados parental e ordenados CD44- células foi detectada após 3-6 dias de passagem. Os resultados sugerem uma relação hierárquica de células CD44 + e CD44- na NPC associada ao EBV.

chemoresistance de CD44 + células

Para examinar a chemoresistance de CD44 + células a agentes quimioterápicos anti-câncer, realizamos os ensaios de sobrevivência celular para as fracções de células CD44 + e CD44- tratados com f luorouracilo (5-FU), a cisplatina ou doxorrubicina. A fracção de células CD44 + de C666-1 exibiram forte quimiorresistência de 5-FU em comparação com as células não seleccionadas C666-1 parentais e fracção CD44- (All

P

0,05) (Fig. 3E). O quimiorresistência de células CD44 + para com cisplatina ou doxorrubicina foi semelhante para células CD44- e C666-1 parentais (dados não mostrados).

genes diferencialmente expressos em NPC-derivado esferóides

Para caracterizar exaustivamente o Propriedades de NPC CSCs, examinámos a expressão de genes celulares e EBV em células formadoras de esfera NPC utilizando microarrays olignonucleotide e ensaios qPCR. Em primeiro lugar, foram avaliados número de cópias do EBV e o nível de expressão de genes de EBV incluindo EBNA1, LMP1, LMP2A, BARF1, EBER1 e BZLF1 em esferóides C666-1. As células formadoras de esfera apresentaram maior número de cópias e a expressão do gene de EBV latente do que as células parentais C666-1 (Fig. 4a). Detectamos elevação significativa da EBER1, BARF1 e expressão LMP1 nos esferóides (todo o

P Art 0,05). Não foi observada diferença significativa na expressão do EBV BZLF1 gene lítica imediato-precoce entre os esferóides e células C666-1 parentais.

(A) por qRT-PCR, vários genes de EBV (EBER, BARF1, LMP1, LMP2A, EBNA1 e BZLF1) foram encontrados a ser sobre-expressos em esferóides quando comparado com as células em monocamada C666-1. EBV número cópia nestas células foi determinada por qPCR. (B) genes seleccionados aberrantemente expressadas em esferóides foram confirmadas por qRT-PCR. Os genes significativamente upregulated incluem quimiocinas e receptores (CCR7, CCL4, CX3CL1 e IL-8), molécula de adesão celular SELE, moléculas de sinalização (GLI1, FOXN4) e transportadores ABC (ABCC3, ABCC11). CCR7 (C) à superfície da célula expressa verificou-se ser frequentemente expressas em células formadoras de esfera ( 60%) por citometria de fluxo. A subpopulação de células CCR7 + também foi detectado em linhas de APN e os tumores primários ( 5%). Foram também encontradas (D) células CCR7 + CD44 + para ser enriquecido em esferóides. Histogramas denotando média ± SE (n≥3) com significância estatística calculada pelo teste t (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001)

Os genes celulares diferencialmente expressos em esferóides e células monocamada C666-1 foram identificadas por análise de microarray. Expressão de 830 e 260 genes foram encontrados para mostrar aumento de mais de 5 vezes e diminuição das células formadoras de esfera respectivamente. Análise do gene ontologia revelou que os 5 principais catálogos função molecular enriquecidos nos genes expressos diferencialmente incluem: regulação da transcrição, da resposta imunitária, a regulação de apoptose, adesão celular, e o transporte transmembranar, cada um com valores de p significativos (Tabela 2 e Tabela S2). A selecção de genes expressos diferencialmente foi listada na Tabela 2. Por qRT-PCR, que validou a expressão de genes seleccionados envolvidos na manutenção de propriedades de células estaminais nos esferóides e C666-1 parental (Fig. 4B). Um aumento significativo de expressão (

P

0,05) de quimiocinas e receptores (IL8, CCl4, CX3CL1, CCR7), sinalização genes relacionados com a via (FOXN4 e GLI1), e moléculas de adesão celular (sele) foram confirmadas em os esferóides (Fig. 4B). Notavelmente, duas cassete de ligação a ATP (ABC) genes transportadores (ABCC3 e ABCC11) são também altamente expresso nos esferóides (All

P

0,01). A sobre-expressão destes genes podem ser responsáveis ​​para a função resistente à quimioterapia de NPC CSCs (Fig. 4B).

A expressão de CCR7 em CD44 + CSCs do NPC

Entre os genes diferencialmente expressos, CCR7, um receptor de quimiocina, mostrou a maior variação vezes na expressão nos esferóides por análise de microarray e, assim, foi seleccionado para posterior investigação. Por citometria de fluxo, um enriquecimento significativo de células CCR7 + foi detectada em esferóides quando comparado com as células parentais (All

P

0,001, Figura 4C.). Nós também detectou expressão CCR7 em 0,53 ± 0,14% e 2,87 ± 1,53% de células em xenoenxertos e tumores primários respectivamente. Multicolor análise de citometria de fluxo revelou que a maioria das células CCR7 + foram co-expressa com CD44. As células CD44 + CCR7 + foram enriquecidas em esferóides quando comparado com os xenoenxertos de tumores primários e (All

P

0,001, Figura 4D.). Esta fracção CSC candidato também foi detectada em linhagens tumorais da APN e tumores primários.

Desde CCR7 foi altamente expressa em células formadoras de esfera NPC e correlacionados com metástases em linfonodos em vários cancros humanos, nós então determinada a associação de CCR7 expressão com os parâmetros clínicos em 39 casos NPC primários. Representante padrões de expressão de CCR7 em tumores primários foram mostrados na Figura 5. CCR7 expressão é significativamente correlacionada com a expressão de CD44 nestes casos (Fig. S4). Entre as amostras NPC, 8 (20,5%) foram negativos para a coloração CCR7. expressão fraca, média e alta de CCR7 foram detectados em 13, 7 e 11 casos primários, respectivamente. Mais importante, verificou-se que a expressão CCR7 correlacionada com a presença de doença recorrente e metástase distante (Tabela 3). A constatação sugeriu que as células que expressam CCR7 pode contribuir para a progressão da doença.

representativos casos primários NPC com alto (A), média (B), de baixo (C) expressão de CCR7. (D) NPC primário com ausência de expressão de CCR7 foi mostrado. coloração CCR7 foram detectados em alguns linfócitos que se infiltram, mas não nas células tumorais. Os tumores primários com alta (E) e forma (F), a expressão de CD44 foram mostradas. Em (G) e (H), expressão de CD44 fraca foi detectada nas células tumorais, enquanto forte coloração CD44 em linfócitos infiltrantes era comumente encontrados.

Para investigar o papel do CCR7 na NPC CSC , utilizou-se um anticorpo de bloqueio de CCR7 para neutralizar a sua função nas células parentais, CD44 + e CD44- C666-1. As células foram tratadas com o anticorpo de bloqueio de 0-250 ng /mL CCR7 durante 24 horas e a proliferação de células foram medidos por ensaio de WST1. diminuição observável na proliferação celular foi observada na fracção de células CD44 + quando comparado com CD44- e células parentais C666-1. (Fig. 6A). Eficiência reduzida formação de clones também foi encontrado em células tratadas com anticorpo C666-1 CCR7 bloqueio (

P

0,05, Figura 6B.). É importante ressaltar que a capacidade de formação de esfera foi significativamente inibida após CCR7 bloqueando tratamento com o anticorpo (

P

. 0,001, Fig 6C). Os resultados forneceram evidências para o envolvimento de CCR7 na manutenção da função CSC no NPC.

Para avaliar a função de CCR7 em CSCs, C666-1 foi tratada com anticorpo CCR7 bloqueio e sua proliferação, formando-clone e sphere- formando eficiência foram investigadas. (A) A proliferação de células CD44 + foi inibida após o tratamento com o anticorpo de bloqueio CCR7. (B) A eficiência formação clone de células C666-1 foi diminuída após o bloqueio CCR7 e (C) a capacidade esferóide-formação foi significativamente inihibited (

P Art 0,001), quando comparado com os controles não tratados. Histogramas denotando média ± SE (n≥3) com significância estatística calculada pelo teste t (*

P Art 0,05, ***

P Art 0,001).

Discussão

Este estudo fornece a primeira evidência sobre a existência de CSCs altamente tumorigénicas no NPC EBV-positivo. Nós desenvolvemos um protocolo para obter CSCs NPC EBV positivos para posterior caracterização. A formação de esferóides é um importante característica funcional de CSCs em cancros humanos [17]. Neste estudo, foram isoladas com sucesso uma população potencial de CSC na linha celular NPC EBV-positiva C666-1 através de esferas de tumor de colheita. As propriedades semelhantes a células estaminais no formador de esfera subpopulação C666-1 obtidos foram confirmados através da demonstração da sobre-regulação de genes associados a células estaminais múltipla e elevada tumorigenicidade em ratinhos nus [9], [18], [19]. Através caracterização completa dos esferóides NPC, linhas de tumor e tumor primário, que revelaram que CD44 e SOX2 são potenciais marcadores CSC para NPC. marcadores de superfície celular são cruciais na identificação CSCs de entre as células tumorais heterogêneas. CD44 é um receptor de hialuronano e tem sido demonstrado ser marcador para os CSCs na cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermóide) [7]. Neste estudo, nós mostramos que a expressão de CD44 foi enriquecido em NPC CSCs. Como evidenciado a partir do significativamente maior capacidade de formação de esfera de células CD44 + NPC, CSC subpopulação foi confirmado para ser enriquecido neste CD44 + fração. A resistência de células CD44 + para o tratamento com 5-FU está em concordância com as propriedades propostas CSC. Para além de CD44, o nosso estudo também detectado o enriquecimento de células que expressam SOX2 nos esferóides, o NPC CSCs funcional. Curiosamente, nível semelhante de transcritos SOX2 foi encontrada em ambas as células formadoras de esfera e C666-1 parental. De acordo com a nossa descoberta não publicado, o aumento da expressão da proteína SOX2 pode ser devido à perda dos miARNs-reprimindo SOX2 (miR-183 e miR-203) nos esferóides. SOX2 é um factor de transcrição que controla pluripotência em células estaminais embrionárias e específicos de tecidos adultos [20]. Ela regula células-tronco auto-renovação e diferenciação e é freqüentemente encontrado para ser regulado para cima em cancros humanos [21]. Zhang

et al

. (2010) sugeriu que as células SOX2 + possuem propriedades stemness [12]. Eles demonstraram que SOX2 foi expressa e co-localizada com OCT4 na NPC primária. Em concordância com as conclusões de Zhang, nossos resultados revelaram que CD44 + SOX2 + células são enriquecidos na NPC CSCs.

O isolamento de células formadoras de esfera na linha de células NPC EBV-positivo nos forneceu uma oportunidade para avaliar a expressão do EBV latente e genes líticos em CSC. Notavelmente, a expressão elevada de produtos de genes latente de EBV, EBER1, BARF1 LMP1 e foram detectadas na subpopulação CSC. Demonstramos previamente que a expressão de EBER confere resistência ao stress apoptótico [22]. A expressão elevada EBER no NPC CSCs sugere que esta subpopulação de células talvez mais resistentes à apoptose. Por outro lado, LMP1 podem induzir EMT através da torção ou caracol, que coincide com a aquisição de propriedades CSC [23], [24], [25]. Além disso, Kondo

et al

. têm também mostrado recentemente que induz LMP1 CD44 + CSC em células epiteliais da nasofaringe [26]. Os resultados implicam que a expressão LMP1 podem desempenhar um papel crítico na manutenção CSC neste malignidade associada a EBV.

Para além dos genes de EBV latentes, a nossa análise de microarray revelou uma sobre-expressão de CCR7 nos esferóides NPC-derivados. O enriquecimento de CCR7 + população de células nas células formadoras de esfera foi confirmada por citometria de fluxo. CCR7 é um receptor de quimiocina que medeia a migração celular em resposta a CCL21 seu ligando [27]. É provável que a expressão do receptor CCR7 elevada em células formadoras de esfera vai aumentar a sua sensibilidade para os ligandos e activar a sua sinalização a jusante. CCR7 expressão aberrante em tumores malignos humanos tem sido associada à sobrevivência celular e vias metastáticas. A via CCL21 /CCR7 pode desempenhar um papel crucial na metástase de CCR7 + CSCs para os gânglios linfáticos [28]. Superexpressão de CCR7 em CSCs é susceptível de contribuir para os frequentes metástases em linfonodos cervicais em doentes com NPC [29]. A capacidade de formação de esfera abolida das células NPC após a neutralização CCR7 sugeriu CCR7 também pode regular propriedades CSC no NPC.

A resistência às drogas é uma característica importante de CSCs, que constitui a base para a recorrência do tumor após os tratamentos quimioterápicos [30 ]. A expressão aumentada de cassete de ligação a ATP (ABC) transportadora família é responsável para o efluxo de drogas terapêuticas e é um mecanismo comum para a manutenção da resistência a drogas em CSCs [31], [32]. Como mostrado no nosso estudo microarranjo, a sobre-expressão significativa de ABCC3 e ABCC11 foi encontrado nas células formadoras de esfera. ABCC3 é um membro da subfamília da proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP) e mostrou ser sobre-expresso em carcinoma dos ovários e linha celular de cancro de pulmão resistente a doxorrubicina-[33], [34]. ABCC3 sobreexpressão pode contribuir para as propriedades de resistência à droga nas linhas celulares /cisplatina doxorrubicina-C666-1 resistentes (Fig. S5). ABCC11 é outro membro da família MRP-regulada em esferóides NPC-derivados. É o principal transportador de 5-fluorouracilo (5-FU) [35], que é uma das principais drogas quimioterapêuticas para [3] NPC. Sobre-expressão de ABCC11 em células formadoras de esfera sugere que a população CSC na NPC é resistente a drogas quimioterápicas e, assim, contribuir para a recorrência do tumor.

via de sinalização Hedgehog é um importante regulador da manutenção e função CSC. Em esferóides C666-1, o estudo de microarray também detectou a expressão aumentada de GLI1, um activador de transcrição importante da via de sinalização Hedgehog. No carcinoma do ovário, GLI1 foi relatado para regular o crescimento das CSCs [36]. Para elucidar o papel do GLI1 e via hedgehog em NPC CSCs, serão examinados os efeitos de silenciar a expressão GLI1 sobre a formação e as propriedades tumorigénicas de células formadoras de esfera. A elucidação sobre os mecanismos que regulam a proliferação e apoptose de NPC CSCs beneficiará terapias específicas nesta subpopulação de células resistentes à droga sinalização.

Em conclusão, nós identificamos CSCs altamente tumorigénicas no NPC EBV-positivo e isso poderia ser subpopulação enriquecida por CD44 da superfície celular e identificados, juntamente com SOX2. Nosso estudo descobriu várias moléculas cruciais incluindo CCR7 e ABCC11 envolvidos na manutenção das funções NPC CSC. Os achados forneceram uma base para o desenvolvimento de novas terapias enfocadas NPC CSC que pode potenciar a eficácia dos tratamentos atuais.

Materiais e Métodos

linhas celulares, xenotransplantes e tumores primários

Uma linha EBV-positiva NPC celular (C666-1) e 3 xenotransplantes (xeno-666, xeno-2117 e C17) foram incluídos neste estudo [13], [14], [15]. C666-1 parental foi cultivada em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Invitrogen). Para esfera cultura do tumor, as células foram cultivadas em DMEM-F12 isento de soro (Invitrogen) em placas ultra-baixas de fixação. Os esferóides foram dissociadas e passadas a cada 6-8 dias. Um total de 1 × 10

6 C666-1 células foram semeadas por poço eo número de esferóides formados foi contado.

Cinco biópsias de tumores endoscópicos para análise FACS foram obtidas de pacientes NPC com autorização por escrito do Departamento de Otorrinolaringologia do Hospital Príncipe de Gales, CUHK. Todos os casos foram positivos para

EBER Restaurant –

in situ

hibridação e histologicamente diagnosticado como NPC indiferenciado ou pouco diferenciado. Nós também recrutou 49 tumores embebidos em parafina fixadas em formalina de arquivo primários do banco de tecidos de Departamento de Anatomia Patologia Celular, CUHK para imuno-histoquímica (IHQ) coloração. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica da Universidade Chinesa de Hong Kong.

quantitativa transcrição reversa e Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) Análise

Total de RNAs foram extraídos utilizando o kit Qiagen RNeasy (Qiagen) e transcritos de modo inverso em ADNc utilizando o kit de síntese de ADNc SuperScript (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. RT-PCR quantitativa, em seguida, foram realizadas com iniciadores específicos (Invitrogen, sequências iniciadoras como listados na Tabela S1) e mistura de energia SYBR® verde de PCR (Applied Biosystems). expressão β-actina foi utilizada para normalizar os dados. Todos os qRT-PCR foram realizadas em triplicado em 7500 uma em tempo real do sistema de PCR da ABI (Applied Biosystems) conforme as instruções do fabricante.

de células activadas por fluorescência (FACS)

única célula As suspensões obtidas a partir de linhas celulares e tecidos tumorais foram lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS (10

5-10

6 células /100 uL). Para a coloração intracelular, as células foram fixadas em etanol a 70% durante 24 horas a -20 ° C antes da re-hidratação com PBS.