Abstract

O consumo de alimentos que contenham resveratrol produz benefícios significativos para a saúde. Resveratrol inibe cancro, reduzindo a proliferação de células e metástase e pela indução de apoptose. Estas acções podem ser explicada pela sua capacidade de inibir (ERK-1/2), Akt e suprimir os níveis de estrogénio e de crescimento tipo insulina do receptor factor de -1 (IGF-1). Como estes processos se manifestam nas ações antitumorais de resveratrol não é clara. Utilizando estudos de microarray, mostra-se que o resveratrol reduziu a expressão de vários microARNs associados a tumores da próstata (miRs) incluindo

miR-21 Online em andrógeno-receptor de células de cancro da próstata humano negativo e altamente agressivos, PC-3M-MM2. Este efeito de resveratrol foi associada com a viabilidade celular reduzida, migração e invasão. Além disso, o resveratrol aumentou a expressão de supressores tumorais, PDCD4 e maspin, que são regulados negativamente pela

miR-21

. Curto interferência (si) RNA contra PDCD4 atenuado o efeito do resveratrol em células de câncer de próstata, e os efeitos similares foram observados após a sobre-expressão de

miR-21

com

pré-miR-21

oligonucleotídeos. As células PC-3M-MM2 também apresentaram níveis elevados de fosfo-Akt (pAkt), que foram reduzidas em ambos resveratrol e LY294002 (um inibidor de PI3-cinase).

miR-21

expressão nestas células parece ser dependente de Akt, tal como LY294002, reduziu os níveis de

miR-21

juntamente com um concomitante aumento na expressão PDCD4. Estes

in vitro

descobertas foram corroboradas em um modelo de xenotransplante grave imunodeficiência combinada (SCID) do rato de câncer de próstata. A administração oral de resveratrol não só inibiu o crescimento do tumor, mas, também diminuiu a incidência e o número de lesões pulmonares metastáticos. Estes efeitos tumor-e metastáticos-supressiva de resveratrol foram associadas a reduzida

miR-21 Comprar e pAkt, e níveis elevados PDCD4. Foram observados efeitos anti-tumorais semelhantes de resveratrol em células de câncer de próstata DU145 e LNCaP que foram associados com a supressão da Akt e PDCD4, mas independente do

miR-21

dados .Estes sugerem que as ações anti-tumorais do resveratrol na próstata câncer poderia ser explicado, em parte, através da inibição da Akt /

miR-21

via de sinalização

Citation:. Sheth S, Jajoo S, Kaur T, Mukherjea D, Sheehan K, Rybak LP , et ai. (2012) Resveratrol reduz o crescimento do cancro da próstata e metástases através da inibição da Akt /MicroRNA-21. PLoS ONE 7 (12): e51655. doi: 10.1371 /journal.pone.0051655

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de março de 2012; Aceito: 05 de novembro de 2012; Publicação: 13 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Sheth et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo NIH Grant (R15CA135494), Escola SIU de Medicina Cancer Center Grant e Escola de Medicina SIU Excelência em Academic Award Medicina para VR. SJ foi apoiado pelo Departamento de Defesa dos EUA Grant (PC100127). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Uma série de produtos naturais, tais como a curcumina, isoflavona, o resveratrol e epigallactocatechin-3-galato (EGCG), mostram uma eficácia em controlar o crescimento e metástase de vários tipos de cancro [1]. Estudos sugerem que a ingestão dietética de alguns destes produtos pode ajudar na prevenção do cancro ou aumentar a eficácia de agentes quimioterapêuticos padrão. O resveratrol (trans-3, 4 ‘, 5-trihidroxiestilbeno) é um antioxidante polifenólico encontrados nos amendoins, uvas e no vinho tinto [2], [3], que possui benefícios significativos para a saúde [4]. Este composto mostrou efeitos benéficos em modelos experimentais de cancro, em que suprime a iniciação, promoção e progressão de tumores [5]. Estudos recentes implicaram a activação da via apoptótica como um mecanismo de contabilidade para os benefícios anti-tumorais de resveratrol. Por exemplo, o resveratrol inibe a proliferação celular e induz a apoptose de células de carcinoma da próstata DU145 humanos [6] e células de leucemia linfoblástica aguda [7]. Resveratrol também produz a parada do ciclo celular de células andrógeno-insensitive PC3 e DU145 [8]. Em um modelo de ratinho transgénico Adenocarcinoma do rato próstata (TRAMP), o resveratrol foi mostrado para exercer a sua acção anti-tumoral através do aumento da expressão de receptor de estrogénio β e diminuindo o crescimento insulina factor-1 de cinase regulada (IGF-1) e o sinal extracelular 1 /2 (/2 ERK1) fosforilação [9]. As últimas acções de resveratrol pode ser produzido pela sua capacidade para servir como um agonista /antagonista nos receptores de estrogénio em células de cancro da próstata [10].

estudos pré-clínicos indicam as acções benéficas do resveratrol na prevenção e tratamento do cancro, com poucos efeitos secundários associados. Um estudo epidemiológico 10 anos mostraram uma redução superior a 50% no risco de câncer de mama em mulheres que ingeriram resveratrol através do consumo de uvas, mas não de vinho [11]. Várias fases I e II de ensaios clínicos de fase estão em andamento para resveratrol no Instituto Nacional de Saúde (http: /clinicaltrials.gov). Por exemplo, o resveratrol está sendo investigado na Fase I de ensaios contra a via Wnt no câncer de cólon. Resveratrol também está sendo usado em ensaios de Fase II em pacientes com linfoma [12].

A eficácia de produtos naturais, tais como o resveratrol, pode ser explicado, pelo menos em parte, através da sua regulação de microRNAs (miRNAs) [ ,,,0],13]. MiRNAs são pequenos RNAs não-codificantes que regulam RNAs de codificação ao nível pós-transcricional [14]. Vários relatórios recentes implicam miRNAs no crescimento e metástase de vários tipos de câncer [15], [16]. A regulação de

miR-

21 foi detectada num certo número de cancros [14], incluindo o cancro da próstata [17], [18], [19], sugerindo que este miARN pode servir como um biomarcador para esses tipos de câncer. Vários estudos têm implicado

miR-21

em oncogênese. Por exemplo,

miR-21

regula o crescimento de células de câncer de mama (MCF-7)

in vitro Comprar e em um rato modelo de xenotransplante [20]. Estes investigadores posteriormente mostrou que

metástase de câncer de miR-21

mama regulamentada por baixo regulando genes supressores de tumor, tais como a morte celular programada 4 (PDCD4) e maspin [21].

miR-21

tem também sido implicada na proliferação e metástase de células de cancro hepatocelular, diminuindo fosfatase e tensina homólogo suprimida no cromossoma 10 (PTEN) [22]. Além disso,

miR-21

regula intravasation e metástase de câncer de cólon cancro do cólon, visando PDCD4 para a regulação para baixo [23]. Relatórios recentes também identificaram receptor de proteína morfogenética óssea II (BMPRII) [24] e lucine ricos de repetição (em Flii) interagindo proteína 1 (LRRFIP1) [25] como alvos de

miR-21

. A inibição de

miR-21

aumento de apoptose de células de glioblastoma humano [26], sugerindo um papel anti-apoptótico deste miARN. O papel anti-apoptótica de

miR-21

é também atribuído à indução da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 [20] e, possivelmente, para a activação do factor nuclear (NF) -κB [27].

neste estudo, nós mostramos que o resveratrol reduz a viabilidade e capacidade de invasão das células PC-3M-mM2 no crescimento da cultura e do tumor no modelo de ratinho de xenoenxerto inibindo

miR-21

expressão. Esta acção é mediada pela inibição da Akt, um regulador a montante de

miR-21

gene.

Ensaio

MTS foi realizado em células PC-3M-MM2 tratados com veículo ou concentrações diferentes de resveratrol ( 5-100 uM) durante 72 h, o que mostrou que a viabilidade das células resveratrol dependentemente da dose reduzida.

B,

diminuição da viabilidade celular pelo resveratrol era nos grupos tratados com resveratrol (25 e 50 uM) em comparação com veículo dependente do tempo.

C,

resveratrol (25 e 50? M) aumento da apoptose de células PC-3M-MM2 de uma maneira dependente do tempo, tal como determinado por coloração de anexina V-FITC e PI.

D,

resveratrol (25 uM) aumento da apoptose de células PC-3M-MM2, como determinado pelo ensaio de TUNEL. As células foram tratadas com resveratrol durante 24 h e utilizadas para ensaios de TUNEL, como descrito em Métodos. Coloração DAPI foi utilizado para identificar os núcleos das células. Imagens representativas são mostrados. A barra de escala representa 100 fim.

E,

Bar gráfico indicam a porcentagem de células em apoptose na presença de 25 mM resveratrol mostrado na

D

. Os dados indicam a média ± SEM de pelo menos 3 experiências independentes. Asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa (p 0,05). A partir de células tratadas com o veículo

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

Foram realizadas Todos os estudos com animais de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de uso sanitárias e um protocolo aprovado pela Escola de Medicina Laboratory animal Care e do Comitê Use Universidade Southern Illinois.

ensaios de cicatrização de feridas foram realizados em células tratadas com veículo ou resveratrol (25 e 50? M) durante 24 h. O resveratrol inibiu significativamente a migração de células para as zonas desnudadas, como indicado pelas setas duplas

(A) Comprar e no diagrama de barras

(B)

.

ensaio de câmara de Boyden invasão C, D,

modificação mostraram que o resveratrol (25 e 50? M) durante 24 h tratamento de invasão de células PC-3M-MM2 significativamente inibida, como indicado pela seta vermelha

(C)

. Imagens representativas das células invasivas por grupo de tratamento são mostrados. Os dados apresentados no diagrama de barras

(B, D)

é a média ± SEM de pelo menos 3 experiências independentes. Asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa (p 0,05). A partir de células tratadas com o veículo

gene MicroRNA perfil matriz de genes regulados pelo resveratrol. As células PC-3M-MM2 foram tratados com veículo ou o resveratrol (25 uM) durante 24 h, após o que o ARN total foi isolado. As amostras foram então sujeitas a análise de micro-arranjo para a detecção daqueles

miRs

que são conhecidos por ser regulada no cancro da próstata [19] usando gene chip Affymetrix (ver Métodos). Painéis comparar

miRNA

perfil do veículo e células PC-3M-MM2 tratados com resveratrol. A intensidade da cor vermelha e verde indica a extensão da regulação para baixo-para cima e de

miRNAs,

respectivamente. Estudos semelhantes foram realizados em três amostras independentes para cada grupo de tratamento. foi observada a maior variação para o

miR-21

como indicado.

B,

resveratrol diminui

miR-21

níveis de uma forma dependente da dose. As células PC-3M-MM2 foram tratados com veículo ou o resveratrol (5-100 uM) durante 24 h, após o que o RNA total foi isolado e

miR-21

níveis foram detectados por RT-PCR quantitativo utilizando TaqMan ® miARN ensaio.

C, D,

resveratrol aumenta os níveis de PDCD4 e maspina de uma forma dependente da dose. As células PC-3M-MM2 foram tratados com veículo ou o resveratrol (5-100 uM) durante 24 h, após o que foram preparados lisados ​​de células inteiras por transferência de Western para a detecção de PDCD4 e maspina, respectivamente.

E,

Resveratrol aumento da atividade luciferase PDCD4. O plasmídeo contendo PDCD4 UTR 3 ‘a jusante da sequência inserida que codifica a luciferase foi transfectado para as células PC-3M-mm2 para 48 h. As células foram então tratadas com resveratrol (25 uM) durante 24 h, após o que os lisados ​​celulares foram preparados e submetidos a ensaio de luciferase. Os dados são apresentados como a média ± SEM de pelo menos 3 experiências independentes. Asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa (p 0,05). A partir de células tratadas com o veículo

Cultura de Células

altamente invasivo, andrógeno-independentes carcinoma da próstata humano PC-3M-MM2 As células foram obtidas do Dr. Kounosuke Watabe (SIU Escola de Medicina, Springfield, IL). Esta linha celular é derivada de osso metastático culturas de células de injecções intra-cardíacos de células PC-3M-MM1 em ratinhos nus [28]. As células PC-3M-MM1, por sua vez foram obtidos a partir de células PC-3M [28], que são uma variante agressiva de células PC-3 [29]. Outras linhas celulares de cancro da próstata, DU145 e LNCaP, foram gentilmente cedidas pelo Dr. Daotai Nie (Escola SIU of Medicine, Springfield, IL). Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 50 unidades /ml de penicilina e 25 ug /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA ). As células foram cultivadas a 37 ° C na presença de 5% de CO ar ambiente

2 e 95%. Todos os experimentos foram realizados em meio completo utilizando monocamadas confluentes, salvo indicação em contrário.

A,

Western blot de todo o lisados ​​celulares de células PC-3M-MM2 transfectadas com qualquer disputa ou PDCD4 siRNA (10 nM) durante 48 h mostrou a sub-regulação dos níveis de PDCD4 e reduzida resposta ao resveratrol (25 uM). As células foram expostas ao resveratrol durante 24 h após a transfecção siRNA.

B,

PDCD4 siRNA (10 nM) reduziu significativamente a capacidade de resveratrol (25 fiM) para inibir a viabilidade de células PC-3M-MM2 como determinado por ensaio de MTS. Após 24 h de siRNA a transfecção, as células foram semeadas em placa de 96 poços e expostas ao resveratrol durante 72 h.

C,

PDCD4 siRNA reverte parcialmente a capacidade de resveratrol para induzir a apoptose em células PC-3M-MM2. Ensaio de apoptose foi realizada por anexina V-FITC coloração depois de 48 h de tratamento resveratrol (25 uM) após 24 h de siRNA transfecção.

D, E,

PDCD4 siRNA (10 nM) bloqueou a capacidade de resveratrol (25 fiM) para inibir a migração de células PC-3M-MM2 na ferida curando ensaio, como demonstrado pelas setas duplas

(D )

. As células foram transfectadas durante 24 horas, após o que a ferida foi criada e as imagens foram tomadas no tempo, 0 h. As células foram então tratadas com resveratrol durante 24 h e as imagens foram feitas de novo. Imagens representativas são mostrados. Os dados do

(D)

são apresentados no diagrama de barras no

(E)

.

F,

PDCD4 siRNA (10 nM) reverteu a inibição induzida pelo resveratrol de invasão de células PC-3M-MM2 no ensaio de câmara de invasão Boyden modificado. As células foram transfectadas em frascos durante 24 h antes da semeadura-los no compartimento superior. Os dados indicam a média ± SEM de pelo menos 3 experiências independentes. (*), (**) E (***) indicam diferença estatisticamente significativa (p 0,05) a partir de precipitação siRNA, de resveratrol + corrida siRNA e dos grupos de tratamento PDCD4 siRNA, respectivamente

. As células transfectadas com

pré-miR-21

(30 nm) revelou aumento dos níveis de

miR-21

. As células foram transfectadas com

pré-miR-21

sequência durante 48 h e foram depois utilizados para a determinação de

miR-21

níveis de RT-PCR quantitativo utilizando o ensaio TaqMan ® miARN. As células de controlo foram transfectadas com mexidos

pré-miR.

B,

Pré-miR-21

(30 nM) diminuiu os níveis de transfecção de PDCD4 e atenuou a resposta do resveratrol (25 uM durante 24 h), como determinado por Western mata-borrão.

C,

Pré-miR-21

(30 nM) reverteu a inibição induzida pelo resveratrol de invasão de células PC-3M-MM2 no ensaio de câmara de invasão Boyden modificado.

D, E,

ferida ensaio mostrando reversão da inibição induzida pelo resveratrol da migração de células PC-3M-MM2 curando

pré-miR-21

(30 nM). Imagens representativas são mostrados. Os dados em gráficos de barras são apresentados como média ± SEM de pelo menos 3 experiências independentes. Asteriscos (*), (**) e (***) indicam diferença estatisticamente significativa (p 0,05) dos tratados com disputa de controle, o resveratrol + disputa

pré-miR

e

pré-miR- 21

transfectadas células PC-3M mm2, respectivamente.

Reagentes

Resveratrol e LY294002 foram adquiridos de Sigma Chemical, Co (St. Louis, MO).

Pré-miR-21

oligonucleótido,

pré-miR

controlo negativo, PDCD4 siRNA e ARNsi de controlo negativo foram adquiridos da Ambion (Houston, TX). O anticorpo anti-PDCD4 foi de Epitomics, Inc. (Burlingame, CA), enquanto que, os anticorpos contra a fosfo-Akt foi adquirido a Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Os anticorpos contra maspina e Akt foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) e anticorpo anti-β-actina foi adquirido de Sigma Chemical, Co. Todos os reagentes e materiais foram de grau mais elevado disponível e foram adquiridos a partir de fontes convencionais.

O resveratrol Akt inibe a fosforilação de um modo dependente da dose. As células PC-3M-MM2 foram expostas ao veículo ou diferentes doses de resveratrol (5-100 uM) durante 24 h e os lisados ​​de células totais preparados a partir destas células foram utilizadas para a transferência de Western.

B,

inibição da Akt fosforilação por LY294002. As células PC-3M-MM2 foram tratados com LY294002 (10 uM), um inibidor de PI3-quinase, durante 24 h e utilizado para transferência de Western para avaliar a activação de Akt.

inibição C,

Akt reduziu

miR-21

níveis, conforme determinado por análise de arranjo de microRNA. As células PC-3M-MM2 foram tratados com veículo ou LY294002 (10 uM) durante 24 h, após o que o ARN total foi isolado. As amostras de ARN foram então sujeitas a análise de micro-arranjo de

miRs

.

miRs

que são conhecidos por ser regulada no cancro da próstata [19] são mostrados usando gene chip Affymetrix. Painéis comparar

miRNA

perfil do veículo e células PC-3M-MM2 tratados com LY294002. A intensidade da cor vermelha e verde indica a extensão da regulação para baixo-para cima e de

miRNAs

, respectivamente. Estudos semelhantes foram realizados em três amostras independentes para cada grupos de tratamento.

D,

LY294002 aumento dos níveis PDCD4. As células PC-3M-MM2 foram expostas a LY294002 (10 uM) durante 24 h e utilizado para transferência de Western.

E,

LY294002 aumento da atividade PDCD4-luciferase. O plasmídeo contendo PDCD4 3′-UTR a jusante da sequência de codificação do gene de luciferase foi transfectado para as células PC-3M-mm2 para 48 h. As células foram então tratadas com LY294002 (10 uM) durante 24 h, após o que os lisados ​​celulares foram preparados e submetidos a ensaio de luciferase. Os dados no gráfico de barras são apresentados como a média ± SEM de pelo menos 3 experiências independentes. Asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa (p 0,05). A partir de células tratadas com o veículo

células PC-3M-MM2 foram tratados com veículo ou LY294002 (10 uM) durante 72 h e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTS.

B,

LY294002 (10 uM) durante 48 h tratamento apoptose induzida em células PC-3M-MM2 como determinado por coloração de anexina V-FITC e PI que foi quantificada por citometria de fluxo.

C,

LY294002 (10 uM) aumento da apoptose de células PC-3M-MM2, como determinado pelo ensaio de TUNEL. As células foram tratadas com LY294002, durante 24 h e, em seguida, utilizado para o ensaio de TUNEL, como descrito em Métodos. Coloração DAPI foi utilizado para identificar os núcleos das células. Imagens representativas são mostrados. barra de escala é de 100 mm. gráfico de barras

(D)

mostra a porcentagem de células em apoptose em presença de 10 mM LY294002.

E, F,

LY294002 (10 uM) durante 24 h de exposição a migração de células PC-3M-MM2 reduzidos, tal como determinado pelo ensaio de cicatrização da ferida. Imagens representativas são mostrados.

L,

LY294002 (10 uM) durante 24 h a exposição reduzida a capacidade de invasão de células PC-3M-MM2, como determinado pelo ensaio de câmara de Boyden modificado. Os dados em gráficos de barras são apresentados como a média ± SEM de pelo menos 3 experiências independentes. Asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa (p 0,05). A partir de células tratadas com o veículo

Resveratrol suprimiu o crescimento do tumor

in vivo

. Doze ratos SCID foram divididos igualmente em dois grupos- tratamento com veículo e resveratrol (20 mg /kg de peso corporal). Os fármacos foram administrados por sonda oral todos os outros dias até ao fim do estudo. As células PC-3M-MM2 marcaram-luciferase (1 × 10

6) foram injectados na região do flanco de cada rato no dia 8 (seta) de tratamento com resveratrol e então monitorizados durante o crescimento do tumor. camundongos de resveratrol tratados apresentaram suprimiu o crescimento do tumor

(A)

, sinal de luciferase diminuiu

(B, C)

e tumores menores

(D)

. Imagens representativas são mostrados em

(B) Comprar e

(D)

, enquanto histogramas em

(C) Comprar e

(D)

representam ± médios EPM de seis ratinhos de cada grupo de tratamento.

E,

tumores isolados de camundongos tratados com resveratrol apresentaram níveis reduzidos de

miR-21

como determinado pelo ensaio TaqMan®.

F,

resveratrol regula a expressão de pAkt PDCD4 e no tecido do tumor. tumores isolados de ratos com veículo e tratados com resveratrol foram seccionados para a coloração imuno-histoquímica para pAkt e PDCD4. barra de escala é de 50 mm. Asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa (p 0,05). A partir de ratinhos tratados com veículo

ratinhos SCID foram tratados quer com veículo (N = 4) ou o resveratrol (20 mg /kg de peso corporal) (n = 6) por meio de gavagem oral, em dias alternados até ao final do estudo, começando uma semana antes da injecção de células PC-3M-mm2 (1 × 10

6), IV através da veia da cauda. Os ratinhos tratados com resveratrol foi significativamente menor, o número de lesões metastáticas (seta). Imagens representativas de pulmões de um rato por grupo de tratamento são mostrados.

viabilidade celular Assay (MTS Assay)

In vitro a proliferação de células

PC-3M-MM2 foi realizada utilizando CellTiter 96® Aqueous One Solution Kit de Ensaio de Proliferação celular (Promega, Madison, WI), de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, a 2500 células por poço foram semeadas numa placa de 96 poços. Após respectivos tratamentos, as células foram deixadas crescer durante 72 h. Após 72 h, 20 pi de CellTiter 96 Aqueous One Solution reagente foi adicionada a cada poço em 100 ul de volume total de meios de comunicação. As células foram incubadas durante 3 a 4 horas, e a absorvância foi registada a 490 nm utilizando um leitor de placas de ELISA. A absorvância é directamente proporcional ao número de células vivas e é expressa como percentagem de um em relação às células tratadas com o veículo.

Detecção de apoptose por citometria de fluxo

A morte celular por apoptose foi determinada utilizando FITC kit de detecção de apoptose -AnnexinV (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) e quantificado por citometria de fluxo como descrito anteriormente [30]. Resumidamente, no final do tempo de tratamento, as células PC-3M-MM2 foram lavadas uma vez com tampão fosfato salino (PBS) e recolhidas numa solução de tripsina /EDTA a 0,5% a 37 ° C, centrifugou-se a 220 ×

g

, durante 5 min e, em seguida, imediatamente re-suspensa no tampão fisiológico (1X) fornecido com o kit. As células (1 x 10

5 células /500 uL) foram então mantidos no escuro durante 15 min à temperatura ambiente com 5 uL de ambos iodeto de propídio e conjugado com FITC anexina V, após o que as amostras foram analisadas imediatamente por BD Biosciences

FACSCalibur

citómetro de fluxo (San José, CA). Os resultados foram quantificados utilizando o software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA).

Detecção de apoptose por TUNEL Ensaio

A morte celular por apoptose em células PC-3M-MM2 foi detectada pelo método TUNEL ensaio, utilizando o kit de detecção de fragmentação Fluoresceína FragELTM ADN (EMD Biosciences). Resumidamente, as monocamadas de células PC-3M-MM2 foram cultivadas em lamelas de vidro. No final do tratamento, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4%. As células foram, em seguida,

permeabilizadas utilizando proteinase K (1:100 diluição) (fornecido no kit), durante 20 min à temperatura ambiente. No final da incubação as células foram lavadas com soro fisiológico tamponado com Tris 1X (TBS). Após o que foram incubadas com tampão de equilíbrio 1X TdT para 10-30 min. Após a incubação terminou, 60 ul de TdT mistura de reacção de marcação foi aplicado em cada lamela e foram colocados numa câmara humidif içada e incubadas durante 1-1,5 h a 37 ° C. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com 1X TBS. As células contendo lamelas de vidro foram montadas utilizando meios de montagem Fluoresceína-FragELTM. Excesso do meio de montagem foi varrido e as bordas foram selados usando unha polonês. As lâminas foram então fotografadas utilizando um microscópio confocal Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY).

cicatrização de feridas de modificação Ensaio

Números iguais de células foram semeadas em cada poço de doze poços placas de cultura. Após as células atingiram 70% de confluência de 80%, uma linha foi riscado no meio da cavidade utilizando uma ponta de pipeta para criar uma ferida. contraste de interferência diferencial (DIC) as imagens da área desnudada em três campos aleatórios por poço foram capturados por uma microscopia confocal apenas após o desnudamento (tempo, 0 h). As células foram então tratadas com diferentes reagentes e incubou-se durante mais 24 h, e as imagens foram gravadas novamente. Para a quantificação, a área de fecho da ferida é medida a partir da área desnudados e normalizados para os controlos tratados com veículo. Para estudar os efeitos da PDCD4 siRNA e

pré-miR-21

na cicatrização de feridas de células PC-3M-MM2, as células foram transfectadas com ARNsi PDCD4,

pré-miR-21

e seus respectivos controles negativos para 24 h após o que a ferida foi criado e as imagens foram tomadas no tempo, 0 h.

Modificado Boyden Invasion Câmara Ensaio

a capacidade das células cancerosas da próstata para migram através das membranas revestidas de Matrigel foi medido utilizando câmaras de 24 poços BD Biocoat Matrigel invasão (BD Biosciences, San Jose, CA). As células PC-3M-mm2 (5 × 10

4) foram suspensos em meio de cultura sem soro e foram semeadas sobre o topo do compartimento da câmara de invasão seguido de tratamentos respectivos. Meio Completo foi adicionada à câmara inferior. No final de 24 horas, os insertos celulares foram removidos, e as células foram cuidadosamente varrida da superfície superior da membrana com um cotonete. As células invasivas que aderem à superfície inferior da membrana foram coradas com 100% de metanol e 1% de azul de toluidina, respectivamente. As imagens foram tiradas sob um microscópio de luz usando uma objetiva de 20x. número total de células invadidas foi contado manualmente em quatro campos escolhidos aleatoriamente por tratamento por pastilha. Para estudar os efeitos da PDCD4 siRNA e

pré-miR-21

, as células PC-3M-MM2 foram transfectadas com PDCD4 siRNA,

pré-miR-21 Comprar e seus respectivos controles negativos para 24 h antes da semeadura-los no compartimento superior.

Análise Western Blot

no final do tratamento, as células PC-3M-MM2 foram lavadas com gelo frio 1X PBS e homogeneizadas utilizando um sonicador em tampão de lise gelado contendo Tris HCl 50 mM, MgCl 2 10 mM e EDTA 1 mM, na presença de mistura de inibidores de protease (Sigma) e inibidor da fosfatase 1 (1:100) (Sigma). Os lisados ​​de células inteiras foram então usados ​​para transferência de Western como descrito anteriormente [31]. Resumidamente, a concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford e igual quantidade de proteína de cada amostra foi misturada com tampão de solubilização (20% de SDS, Tris 1 M, glicerol a 20% e pitada de azul de bromofenol) e aqueceu-se em banho de água a 95 ° C durante 5 min. As amostras foram então resolvidos por electroforese em gel de poliacrilamida SDS. As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose, bloqueados numa solução contendo PBS 10X, 10 mM de EDTA, 20% de Triton X-100 e 5% de leite desnatado de baixo teor de gordura, durante 1 h, e, em seguida, incubou-se a 4 ° C durante a noite com o anticorpo primário. Após três lavagens em solução de bloqueio (BLOTTO), as manchas foram incubadas com o anticorpo secundário de rábano espécies marcadas com peroxidase específico de IgG durante 1 h à temperatura ambiente, lavou-se três vezes com 1X TBS contendo 1% de Tween 20. Isto foi seguido de três lavagens com TBS 1X, sem Tween 20. A mancha foi tratada com reagente de ECL mais (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL), e visualizado utilizando um dispositivo de carga acoplada LAS 4000 (Fujifilm North America Corporation, Valhalla, NOVA IORQUE). A análise densitométrica das bandas foi realizada usando software de versão MultiGauge 2.0. bandas individuais foram normalizados com qualquer total ou Akt-β-actina como a proporção de proteína alvo. Este foi ainda normalizado em% do controle utilizando os valores de controle como 100%.

Oligonucle�ido e interferência curto (si) RNA Transfec�es

Synthetic

pré-miR-21

(30 ng) (ID # PM10206, Ambion, Austin, TX), PDCD4 siRNA (10 ng) (siARN ID # s223740, Ambion) e os seus respectivos controlos negativos foram entregues em células PC-3M-MM2 usando Lipofectamine ™ RNAiMAX ( Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células PC-3M-MM2 foram semeadas em placas de 6 poços a 30% de confluência. No dia seguinte, a quantidade apropriada de

seus controlos negativos pré-miR-21

ou PDCD4 siRNA e foram diluídas em meio isento de soro e 100 ul foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos com 5 ul de Lipofectamina ™ RNAiMAX reagente de transfecção para permitir a formação de complexos de transfecção, as quais foram adicionados às culturas de células por agitação suave das placas. O meio de cultura foi substituído com meio fresco após 5-6 h e as células foram incubadas durante 48 h. Para todas as outras experiências subsequentes, o mesmo protocolo foi seguido, a menos que especificado de outra forma.

Isolamento de ARN, transcrição reversa e TaqMan PCR em Tempo Real

Isolamento de ARN total a partir de células PC-3M-mm2, tecidos de tumor foi realizada utilizando QIAzol Reagente de lise (Qiagen, Valencia, CA) como indicado pelo fabricante.

miR-21

cDNA foi gerado a partir de 200 ng de RNA total que foi transcrição reversa usando

hsa-miR-21

qRT-PCR conjunto de primers (Applied Biosystems, Foster City, CA) e TaqMan ® MicroRNA Transcrição reversa (RT) kit (Applied Biosystems). Cada reacção de RT continham 1X RT primer específico, 1X tampão de reacção de RT, 0,15 ul de dNTPs 100 mM, 50 U /ul de enzima MultiScribe RT e 3,8 U /ul de inibidor de RNase. A mistura reaccional de 15 ul foram então incubadas durante 30 min a 16 ° C, 30 min a 42 ° C e 5 min a 85 ° C e depois mantida a 4 ° C num aparelho de ciclos de PCR. O PCR em tempo real foi realizada em Applied Biosystems ™ StepOnePlus Real-Time PCR System usando um kit de PCR TaqMan ® padrão (Applied Biosystems) protocolo. Resumidamente, após o passo de RT, 2 uL da reacção de RT foi combinado com 1 ul de 20X TaqMan® MicroRNA ensaio (iniciador directo, o iniciador inverso e sonda) e 17 ul de TaqMan® Universal PCR Master Mix em 20 uL de volume final. As reacções foram incubadas a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Madura

miR-21

expressão foi calculada usando a 2

-ddC

t método em relação ao U6-snRNA e expressa como alteração dobra. Todos os TaqMan-PCRs foram realizadas em triplicata.

análise de microarray

O microarray profiling miRNA foi realizada utilizando matrizes Affymetrix GeneChip miRNA v1 (Santa Clara, CA) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante e foi realizada pela Facilidade CFG Microarray Núcleo (Universidade de Albany, Rensselaer, NY). Resumidamente, 500 ng do ARN total extraído de células foi marcada através da adição de polimerase de poliA utilizando o kit Genisphere FlashTag HSR (Genisphere, Hatfield, PA). RNA foi hibridizado a matriz da Affymetrix miRNA v1 e digitalizados em um scanner GeneChip 30007G como recomendado pelo fornecedor. Os dados brutos foi verificada a sua qualidade usando software ferramenta de miRNA QC (Affymetrix). Uma análise mais aprofundada foi realizada utilizando GeneSpring Gx v11.3. Os valores de p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Como mostrado na Fig.