Abstract
Na Taiwan Balcãs e, a relação entre a exposição ao ácido aristolóquico e risco de neoplasias uroteliais foi inferida a partir da A T característica genética em
gene TP53
a partir de células malignas. Este estudo teve como objetivo caracterizar o
TP53
espectro mutacional em cânceres urothelial consecutivos para aristolóquico Ácido Nefropatia na Bélgica. secções congeladas de tumor de série a partir de pacientes do sexo feminino (n = 5) expostas a ácido aristolochic durante regime de perda de peso foram utilizados alternativamente, quer para a imunocoloração de p53 ou microdissecação a laser. foram seleccionados áreas do tecido com, pelo menos, 60% de núcleos de p53-positiva para microdissecting secções de acordo com as áreas correspondentes de p53-positivos. Todas as áreas parecia ser o carcinoma in situ. Após a extração de DNA, mutações no
TP53 região dos hot spot (exons 5-8) foram identificados utilizando nested-PCR e sequenciamento. controles falso-negativos consistiram na microdissecting tecidos tumorais fresco congelado, tanto a partir de um paciente com síndrome de Li-Fraumeni que carregava uma mutação constitucional p53, e de
Kras
adenocarcinomas mutantes. Para descartar resultados falso-positivos potencialmente gerados por microdissecção e nested-PCR, um carcinoma urotelial associada a fenacetina e tecidos ureteral frescos normais (n = 4) foram processados com alto poder de laser. Não há resultados inesperados ser identificado, a análise molecular foi perseguido em tecidos malignos, apresentando pelo menos uma mutação em todas as (seis mutações diferentes em dois pacientes), com 13/16 exônico (nonsense, 2; missense, 11) e 3/16 intrônica ( site de uma emenda) mutações. Eles foram distribuídos como transições (n = 7) ou transversões (n = 9), com uma prevalência de igual a T e G T (3/16 de cada). Embora os resultados atuais estão em linha com A prevalência T previamente relatado em estudos dos Balcãs e Taiwan, eles também demonstram que várias mutações no
TP53 região dos hot spot e uma alta freqüência de G T transversion aparecer como um complemento assinatura refletindo a toxicidade de uma dose cumulativa de ácido aristolóquico ingerida durante um curto período de tempo
Citation:. Aydin S, Dekairelle AF, Ambroise J, Durant JF, Heusterspreute M, Guiot Y, et al. (2014) Detecção inequívoca de múltipla
TP53
Gene Mutações no AAN-Associated câncer urotelial na Bélgica Utilização da captura de Laser Microdissecção. PLoS ONE 9 (9): e106301. doi: 10.1371 /journal.pone.0106301
editor: Robert Hurst, Oklahoma University Health Sciences Center, Estados Unidos da América
Recebido: 02 de junho de 2014; Aceito: 29 de julho de 2014; Publicação: 03 de setembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Aydin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. A declaração de ética foi introduzido sob o número de registo belga B40320095694
Financiamento:.. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Competir interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O aristolóquico ácido Nefropatia (AAN) foi relatada pela primeira vez no início dos anos 1990 em pacientes belgas após ter efectuado um regime de perda de peso contaminada com ácido aristolóquico (AA) [1], [2] . AAN é caracterizado por uma nefropatia intersticial rapidamente progressiva com proteinúria tubular e glicosúria, cedo anemia grave, fibrose intersticial extensa hipocelular diminuindo a partir do exterior para o interior do labirinto cortical, e um rápido desenvolvimento de tracto urinário carcinomas de células transicionais, em 40-46% da pacientes dentro de 2-6 anos após a cessação da exposição [3] – [6]. AAN é agora reconhecida como uma doença devastadora que ocorre a nível mundial com mais de 100 milhões de pessoas potencialmente em risco de exposição AA [7]. Embora o mecanismo de nefrotoxicidade AA continua a ser explorado completamente, a atividade carcinogênica está actualmente atribuída a genotoxicidade da AL (aristolactam) adutos -DNA caracterizadas por uma elevada frequência de A T transversion na TP53
gene supressor de tumor de tumores associado à AA. Isto tem sido bem documentada em experiências com animais [8], [9] e, embora não consistente, em pacientes que apresentavam semelhanças histopatológicas e clínicas com os casos originais AAN belgas [10] – [14]. Considerando adutos AL-DNA demonstrando exposição AA têm sido bem documentadas em tecidos renais da coorte belga [6], [15], [16], a presença de A T transversion testemunhando a relação causal entre a exposição ea doença maligna ainda tinha que ser investigada. O objetivo do presente trabalho foi, portanto, para caracterizar o
TP53
espectro mutacional em amostras congeladas de tecidos uroteliais malignas de pacientes AAN belgas utilizando métodos de genotipagem completamente validados.
Pacientes e métodos
Ética Declaração
em 2001, um estudo sobre o polimorfismo genético das enzimas envolvidas no metabolismo do ácido aristolóquico entre os pacientes AAN belgas foi aprovado pelo Prof JM Maloteaux, presidente da Faculdade de Medicina e Ciências da Saúde de Ética em Pesquisa Comitê da Université Catholique de Louvain (Bélgica). Após a aprovação do Comitê de Ética, um consentimento informado por escrito foi fornecido por cada paciente da série AAN belga. Esses dados do estudo permaneceram inéditos.
Em 2009, uma emenda ao estudo piloto definido especificamente a corrente
TP53
pesquisa que foi realizada em amostras de tecido de pacientes 5 AAN relatados neste estudo, e foi aceite como tal pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Católica de Louvain (Bélgica) como uma continuação do estudo começou em 2001. as amostras de tecido de pacientes 1-5 que foram todos parte do estudo original (2001) foram anónimos antes análise.
As amostras de sangue foram parte de um estudo anterior (de referência Comitê de Ética UCL aprovação não. 2003/05/03/08) [17]. amostras de adenocarcinoma e ureterais cirúrgica foram coletadas de pacientes com AA não relacionados como parte de seu tratamento médico e foram anónimos antes da análise. Depois de informação escrita, tecidos de adenocarcinoma foram armazenadas na biblioteca UCL Biológica (https://www.centreducancer.be/fr/show/index/section/8/page/34). amostras ureterais relacionados com AA não tomadas a partir nephroureterectomies removidos no momento do transplante renal foram utilizados como controle neste estudo, com uma codificação após a análise histopatológica de acordo com as leis belgas sobre bancos de tecidos (2008).
O snap espécime de tumor de células da granulosa a partir de -frozen o paciente de Li-Fraumeni foi obtido a partir da biblioteca biológica UCL (o mesmo que acima). Após o consentimento por escrito dos pais, esta amostra foi anônimos antes de usar.
Anterior apresentaram dados incluem adutos AL-DNA identificados no tecido renal de pacientes 1, 3, 4 [15], [16], [18 ] e
TP53
sequenciamento genético realizado em um TCC da bexiga do paciente 1 [10].
pacientes AAN
Cinco pacientes AAN referido Cliniques Universitaires Saint-Luc (Bruxelas, Bélgica) foram estudados (Tabela 1). Todos eram mulheres com idade média de 42,8 anos (variação: 27-53) a apresentação. Um paciente era fumante. Nenhum deles tinha um histórico de abuso de analgésicos ou características típicas de nefropatia analgésica. Todos eles foram submetidos a nephroureterectomy bilateral quer no momento do transplante renal ou posteriormente para neoplasias do trato urinário superior. Além disso, um paciente também foi submetido a ressecção transuretral da carcinoma recorrente de células transicionais (TCC) da bexiga e, finalmente, cystectomy. O diagnóstico de AAN foi baseada nos seguintes critérios: a ingestão de AA através de um regime de perda de peso fitoquímico demonstrada como contaminados (pacientes 1, 2, 3 e 5), a histologia renal típica de fibrose intersticial (todos os cinco pacientes), identificação de AL -DNA adutos em tecido renal (pacientes 1, 3 e 4) e desenvolvimento da malignidade do trato urinário superior (todos os cinco pacientes) [15], [16], [18]. Em paciente 4, a ingestão de AA poderia no entanto, nunca ser formalmente comprovada como ela alegou ter assistido a clínica de perda de peso antes de o regime contaminado com AA (a chamada “fórmula 2”) foi introduzido [1]. No entanto, todos os cinco pacientes preenchem os critérios propostos recentemente para um diagnóstico definitivo de AAN [19] na atual série de casos. Embora sem o TP53
estado de mutação, é importante notar que o paciente 1 é n ° 3 em referências 4, 5, 15 e 16, o paciente 2 é n ° 7, em referência 5, paciente 3 é n ° 4 nas referências 15 e 16, n ° 5 em 5 de referência, e o paciente n ° 4 é 2 na referência 20 e o número n ° 8 na referência 18, enquanto que o paciente 5 ainda não foi avaliado.
cirúrgico espécimes
os tecidos de cinco pelvi-ureterectomies e um único cistectomia foram seleccionados com base na disponibilidade de material congelado. Carcinoma
em
situ (CIS) e papilar TCC foram diagnosticados de acordo com a classificação 2004 da OMS de tumores uroteliais [21], [22]. Unilaterais CiS multifocais desenvolvidas no trato urinário superior direito (pelve, superior, médio e inferior ureter) em dois pacientes (pacientes 1 e 5). Enquanto ureteral CiS invadiu focally a lâmina no paciente 1, ela também desenvolveu bexiga papilar TCC. Bilaterais CiS multifocais desenvolveu no tracto urinário superior dos 3 pacientes restantes. Atraso entre o final da exposição e cirurgia média de 44.75 meses (intervalo 15-96) em pacientes 1, 2, 3, 5 e não estava disponível no paciente 4. Nos primeiros quatro pacientes, unilateral e bilateral TCC foram diagnosticados uma média de 61 meses ( intervalo: 27-96) e 41 meses (intervalo: 18-64) após o término da exposição conhecida, respectivamente
imuno-histoquímica p53 (IHC)
SIA foi identificado por microscopia de luz sobre eosina hematoxilina. secções coradas a partir de amostras pelvi-ureteral congelados. Fora de secções em série congeladas (7 um de espessura), as secções n ° 1, n ° 3 e n ° 5 foram utilizados para imuno-histoquímica de p53 (IHC) e mantidas durante a noite a 37 ° C, enquanto que secções n ° 2, n ° 4 e n ° 6 foram usadas para microdissecação a laser. Os últimos três secções foram colocadas em naftalato de polietileno (PEN) de membrana coberta lâminas bioquimicamente inertes e mantidos a -20 ° C até à sua utilização. Para IHC de p53, as secções mantida a 37 ° C, foram posteriormente fixadas em formaldeído a 4% durante 3 horas. peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogénio a 0,3% em água desionizada durante 30 min. As lâminas foram incubadas a 97 ° C durante 75 min e lavado numa solução contendo água desionizada e 0,05% de Triton. As secções foram então cobertas durante 30 minutos com soro de cabra normal a 10% (NGS) contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA), diluiu-se em Tris-Triton. Eles foram incubadas durante a noite à temperatura ambiente com o anticorpo monoclonal de murganho anti-p53 DO-7 (Biocarta, Europe GmbH) a uma diluição de 1:1000. Depois de lavagem com Tris-Triton a 0,05%, as lâminas foram incubadas à temperatura ambiente durante 75 min com um sistema anti-ratinho EnVision-Peroxidase de pronto-para uso (Dako, Glostrup, Dinamarca) de acordo com o protocolo do fabricante e contrastadas com hematoxilina. Um soro normal de cabra foi utilizado como controlo negativo.
A sobre-expressão de p53 foi definida como uma coloração nuclear, independentemente da intensidade de IHC. coloração p53 extensa pela IHQ foi anteriormente recomendado para aumentar a taxa de detecção de mutação do
TP53
[23]. Assim, foram seleccionados apenas as áreas de tecido que contenham mais de 60% de núcleos positivos para microdissecação. áreas que corresponde exatamente a partir de cortes seriados ainda não transformados (n ° 2, n ° 4 e n ° 6) foram submetidos microdissection como a seguir mencionadas.
captura de Laser microdissection
Após a coloração azul de toluidina, cada unfixed congelada área de tecido que combinava exatamente a área de interesse definida de acordo com a p53 IHC lâminas foi isolado utilizando um sistema de PALM microlaser (Bernried, Alemanha) equipado com um laser pulsado de UV de azoto (comprimento de onda: 337 nm; pulso de energia 270 μJ, duração de impulso 3nsec , frequência de pulso 1-30 /sec) e do PALM Robot Software Versão 2.2. O sistema foi ligado a um microscópio Axiovert 200 e um plano de Neofluar 20x (Zeiss, Oberkochen, Alemanha). focos foram microdissecadas catapultado para um microtubo de tampão e congelou-se a -20 ° C até à extracção de ADN (Figura 1).
L-área TCC contendo mais do que 60% de p53 núcleos corados por IHC contrastadas com hematoxilina de secção congelada do ureter (O). Para a laser microdissecção de captura, um azul de toluidina área manchada em uma seção congelada representante foi correspondida (B), corte (C) e catapultou (D) na tampa de um microtubo (E). electrofograma sequenciamento 3′-5’dideoxy do segmento de p53 mostrando a sequência de tipo selvagem (F, seta) e A T transversion (G, seta) levando a mutação missense E286V no exão 8.
ADN extracção
Em cada tampa, 10 ul de uma solução contendo EDTA 0,001 M (pH 8), Tris-HCl 0,02 M (pH 8), 0,5% de Tween 20, de proteinase K (2 mg /ml) e água ultrapura foi incluído. Após mistura e centrifugação, cada tubo de reacção foi coberta com uma gota de óleo mineral para evitar a evaporação e incubadas durante a noite a 55 ° C com agitação contínua (600 rpm). Ultrapura água (5 mL) foi em seguida adicionado ao tubo de reacção para aumentar o volume final da solução. Após centrifugação, a solução foi aquecida a 99 ° C durante 10 min, para inactivar a proteinase K. Por fim, o extracto foi transferido para outro microtubo.
Nested-PCR
Os exões 5-8, correspondendo para o domínio de ligação ao ADN de p53, um assim chamado “ponto quente” de
TP53
mutações de genes [24], foram amplificados por nested-PCR. Para o primeiro ciclo de PCR, 3 ul de DNA extraído de cada amostra microdissecados foi adicionado a uma mistura final de 50 uL de PCR incluindo MgCl 2,25 mm
2, 0,2 U /mL de Taq ouro polimerase (Ampli Taq ouro, Applied Biosystems, Roche) , dNTP 0,2 mM e 0,2 pM /iniciadores ul (Eurogentec, Liège, Bélgica) (Tabela 2). Uma incubação inicial a 95 ° C durante 4 min foi seguido por 25 ciclos (95 ° C durante 30 seg, 60 ° C, com excepção do exão 7, em que a temperatura de recozimento foi 55 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 1 min) e um alongamento final para 7 min a 72 ° C. A segunda ronda de PCR foi realizada com 2,5 ul do primeiro produto de PCR, utilizando as mesmas condições como para a primeira fase, excepto que a 1,5 mM de MgCl
2 e 0,4 U /mL de Taq ouro polimerase foram usadas para exão 6. água ultrapura foi utilizada como controle negativo enquanto DNA extraído de amostras de sangue independentes foi utilizado como controle para
TP53
amplificação.
Sequência análise
Os produtos amplificados foram purificados utilizando o kit de rotação PCRapace MSB (STRATEC Molecular GmbH, Berlim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A análise da sequência foi levada a cabo num ABI automatizado 377 Um aparelho (Applied Biosystems, Foster City, CA), utilizando o kit de sequenciação do ciclo de Taq Dye Deoxy Terminator do mesmo fabricante, e de acordo com as suas instruções. O
TP53
sequência de referência de Genbank foi NC_000017.10.
Avaliação do potencial de
TP53
alterações -artifactual em amostras de tecido
(a) Para avaliar a capacidade do processo microdissecação corrente para identificar mutações no DNA, quatro adenocarcinomas colo-rectal anteriormente investigados para
Kras
mutação por testes clínicos de rotina em FFPE foram seleccionadas amostras de tecido (embebidos em parafina e fixados em formalina). Dois deles carregava uma mutação e dois eram do tipo selvagem. Estas quatro amostras foram escolhidas porque uma contrapartida snap-congelado foi mantida armazenada a -70 ° C no cancro humano Bio-banco da Université Catholique de Louvain (https://www.uclouvain.be/416846.html). microdissecação laser e extracção de ADN de amostras de adenocarcinoma snap-congelados foram realizadas utilizando o procedimento descrito acima e os resultados de
Kras
testes foram comparados. Além disso, um piscar de olhos congelados espécime de tumor de células da granulosa de uma jovem de 15 anos com uma síndrome de Li-Fraumeni foi analisada utilizando o mesmo procedimento microdissection. Embora a mutação constitucional já tinham sido identificadas por FASAY (análise funcional dos alelos separados em levedura) do
TP53
ARNm extraído de células mononucleares periféricas do paciente [25], a amostra de tumor foi estudada para confirmar ainda mais a capacidade do procedimento microdissection atual para identificar corretamente esta TP53
mutação em seções congeladas do tumor.
(b) se as secções de tecido snap-congelados podem ser afetados por um efeito induzido por laser é não conhecida e esta pode até ser agravada por factores interferentes adicionais, tais como um efeito deletério da fixação, coloração e /ou procedimentos de PCR aninhados. Para excluir esse viés tecnológico, espécimes ureter cirúrgicos foram coletadas após nephroureterectomies (n = 4) colhidas de pacientes transplantados renais de uremia terminal de devido à doença renal policística (n = 2), nefrite intersticial idiopática crónica definitivamente não relacionada à ingestão AA (n = 1 ), e glomerulosclerose diabética (n = 1). Estas amostras foram imediatamente incorporados em Tissue-Tek e snap-congelados, e áreas uroteliais foram processadas concomitantemente em três maneiras diferentes. Microdissecção foi realizado sob duas intensidades diferentes (de baixo significa UV-energia: 68; e média alta UV-energia: 69.4) e posteriormente processados como relatado aqui para as amostras AAN-paciente. Em comparação, cortes seriados adicionais a partir da mesma amostra ureter foram submetidos a um simples slide coçar, efectuada em
Kras
testes de mutação de rotina em amostras de tecido FFPE. extracção de ADN, amplificação e
TP53
sequenciação foram realizadas de acordo com o método descrito neste artigo.
(c) Como controlo adicional de
TP53-AA não relacionado
alterações artifactual potencialmente induzida pela análise de corrente, um carcinoma urotelial induzida pela fenacetina, que é declaradamente caracterizado pela ausência de uma transversões de T
TP53
gene [26] foi removido a partir do ureter inferior de uma mulher de 64 anos de idade, embebidos em Tissue-Tek, congelados instantaneamente em azoto arrefeceu-2-metilbutano líquido (isopentano) e armazenado a -70 ° C. IHC, microdissecção, extração de DNA e
TP53
sequenciamento foram realizadas de acordo com os métodos descritos acima.
Avaliação do limite de detecção para seqüenciamento Sanger
Para o limite de detecção estudo , DNA foi extraído de duas linhas principal e de pescoço de células escamosas carcinoma de células (SC173 e SC263, gentilmente cedido pelo AC Begg, Holanda Cancer Institute, The Netherlands) que transportam diferentes
TP53
mutações e de um tipo selvagem
TP53
linha de células de CECP (HN30, gentilmente cedido por M. Flinterman, Departamento de Medicina Oral e Patologia, faculdade Londres do rei, O Instituto de chuva, UK). Caracterização da
TP53
estatuto foi previamente realizado em nosso laboratório, utilizando análise FASAY [25]. SC173 carrega uma mutação sem sentido no exão 5: R175H (CGC CAC). SC263 apresenta uma alteração heterozigotos compostos envolvendo uma mutação nonsense R306X no exão 8 (CGA TGA) e uma deleção de 32 bp no exon 7 (del 704-735) (dados laboratoriais CTMA). DNA de ambos
TP53
mutado células foi diluída em série e cravado no ADN da célula de tipo selvagem ter 50 a 1,25% com as taxas de DNA mutante do tipo selvagem. Amplificação e análise de sequenciação foram realizadas como descrito acima.
análise estatística comparativa do número e do tipo de mutações no atual e anterior
dados
Um modelo de regressão de Poisson foi construído para comparar a prevalência e tipo ( a T e G T) de
TP53
mutações no sítio de ligação de p53 entre corrente (n = 5) e anterior [BEN (n = 11 e n = 97) e Taiwan (n = 151)] clínica series [11], [12], [14], e comparar os resultados desta análise com os de pacientes com neoplasias uroteliais (bexiga, ureter, do trato urinário superior e pelve renal) (n = 1111), como relatado no
TP53
banco de dados IARC [27]. Vale a pena notar que os dados associados com a exposição AA foram descartados do
TP53
resultados de banco de dados da IARC.
Resultados
Avaliação do potencial artifactual
TP53
alterações na amostras de tecido
Usando o procedimento microdissection permitiu uma correta identificação das mutações do DNA conhecidos caracterizados por testes de rotina anterior. Em relação à identificação de
Kras
mutações no snap-congelados adenocarcinomas, os resultados foram rigorosamente idênticos aos anteriormente obtidos em amostras FFPE (ou seja, a identificação de mutações G12S e G12D no
Kras
tecidos mutantes e estado de tipo selvagem nos outros dois tumores). Em relação à identificação de um g.13380 constitucional G A, p.R248Q mutação identificados por ensaio FASAY em células de sangue periférico de um doente com síndrome de Li-Fraumeni, esta mutação foi também encontrado em células malignas do tumor de células da granulosa, utilizando a extracção do ADN, microdissecção, nested-PCR e sequenciamento procedimentos utilizados no presente estudo.
por outro lado, não artifactual
TP53
foram encontradas alterações nos vários controlos realizados para testar a ocorrência de
TP53 danos relacionados com a extracção de DNA, microdissecção, nested-PCR e os procedimentos de sequenciamento de DNA
-induzido. Nenhuma mutação foi encontrada em três das quatro amostras ureter usados para testar um
TP53
danos iatrogênica. A única exceção foi a amostra ureter a partir de um paciente diabético tipo 2 com um G A transição (g.12455, p.R156H) no exão 5 do
TP53
gene após microdissecção sob alto poder de laser. Nenhuma mutação foi encontrada no domínio de ligação ao DNA p53 (exons 5 a 8) quando da análise do DNA extraído de um carcinoma urotelial induzida por fenacetina.
Avaliação do limite de detecção para seqüenciamento Sanger
O limite de detecção para a sequenciação de Sanger foi identificada em 6,25% de mutante a proporção de ADN do tipo selvagem com os dois
TP53
mutado linhas de células, independentemente da mutação ou deleção avaliada. Nesta relação de DNA, o heterozigoto A /G pico com diluições de DNA série de SC173 /HN30 DNAs mistos ainda era visível como também foi o heterozigoto pico T e C combinada com uma deleção de 32 bp no exon 7 com diluições de DNA série de SC263 /HN30 DNAs mistos.
Morfologia
Todos p53 áreas positivos foram de TCC papilar ou a instituições de crédito que contenham anaplásico e células displásicas (Tabela 1). Intra-urothelial e lâmina inflamação propria, hiperplasia e atipia reativa estavam ausentes. No caso da paciente 2, células neoplásicas e displásicas foram agarrados à membrana basal (agarrados CIS).
mutações do gene TP53
Incluindo dois resultados reportados anteriormente [10], um total de 16 exônico totalmente diferente (n = 13) ou intrónica (n = 3) de mutações
gene TP53
foram encontrados em tecidos malignos uroteliais da coorte AAN belga (Tabela 1). No paciente 1, duas mutações foram encontradas no mesmo exão (o exão 7), enquanto que uma única mutação foi encontrada em dois pacientes (exão 5) e 3 (intrão 7). Os pacientes 4 e 5 abrigava 5 exônico diferente e 1 mutações intrônicas. Entre as 13 mutações ex�icas, dois eram sem sentido (pacientes 2 e 5) e mutações missense 11 (pacientes 1, 4 e 5). Eles foram localizados no exão 5 (3 mutações), exão 6 (3 mutações), exão 7 (3 mutações) ou exon 8 (4 mutações). Uma das três mutações intrónicas (g.12627 a T, paciente 5) foi localizado no local aceitador de splice a AG. pares a nível mundial, as mutações afetadas A:T (7/16) e pares G:C (9/16). Houve um número aproximadamente igual de transições (7/16) e transversões (9/16). Transitions (7/16) ocorreu de fato com uma frequência semelhante em pares A:T (3/16) e pares G:C (4/16). A G, G A e C T (16/02) ocorreu com uma frequência semelhante como T C (1/16). Da mesma forma, transversões (9/16) foram encontradas em pares A:T (4/16) e pares G:C (5/16) distribuídos como se segue: A T (16/03), G T (3/16 ), G C (2/16) e A C (1/16)
análise estatística comparativa do número e do tipo de mutações no atual e anterior
dados
O modelo de regressão de Poisson. mostrou uma correlação altamente significativa (p 0,001) aumento relativo do TP53
prevalência mutação na p53 codões de ponto de acesso a partir da série clínica corrente, comparados com os resultados da base de dados IARC (Tabela 3). Em contraste, uma diminuição relativa significativa foi encontrada tanto no BEN (n = 97) [12] e os Taiwan (n = 151) [14] série clínico em comparação com a IARC e clínicas actuais dados (Tabela 3). A não-significativa (p 0,05) em relação diminuição /aumento foi encontrado no BEN (n = 11) [11] em comparação com o IARC e dados clínicos atuais (Tabela 3)
Quanto ao número de. a T transversion por paciente, um aumento relativo significativo foi encontrado no atual, tanto BEN [11], [12], e os taiwaneses [14] séries clínicas, em comparação com os resultados do banco de dados da IARC (Tabela 4). Não significativa (p 0,05). Resultados foram obtidos quando AAN anterior e séries clínica atual foram comparados (Tabela 4)
Em comparação com os resultados de banco de dados IARC, um 5.85 aumento significativo da G prevalência T foi encontrada na série clínica corrente (Tabela 5). No G T transversion foi encontrada em ambas as séries BEN. Em relação à série de Taiwan, houve uma diminuição relativa não-significativa no G . Prevalência T comparados com os dados da IARC que essa redução foi altamente significativo quando comparado com os resultados atuais (Tabela 5)
Discussão
Este é o primeiro relatório do espectro mutacional de
TP53
gene supressor de tumor em uma série de pacientes belgas (n = 5) com AAN e subsequente desenvolvimento documentado de TCC no trato urinário superior, juntamente com envolvimento da bexiga em um deles. Quatro deles tinham seguido dieta para perda de peso contaminada-AA e uma exposição negado a AA, enquanto de histologia renal típica de fibrose intersticial [20] com os adutores AL-ADN [18].
Usando exclusivamente amostras congeladas foi um pré-requisito absoluto para permitir a comparação adequada com os dados reportados. Com exceção de cinco dos 11 pacientes para os quais foram utilizados parafina fixado em formalina tecidos incorporados [11], todos os principais
TP53
investigações genéticas em casos que apresentam genotoxicidade induzida por AA e neoplasias uroteliais foram de fato levou usando tecidos congelados frescos [11], [12], [14]. Por outro lado, o objectivo era o de evitar o efeito deletério bem conhecida de fixação de formalina em termos de qualidade do ADN e caracterização do estado mutacional tecido [28]. Para provar que
TP53
mutações não resultar de artefatos tecnológicos quando se utiliza de congelação, uma atenção especial foi dada aos procedimentos de validação completas. A corrente
TP53
testes incluíram passos sucessivos (ou seja, a captura a laser microdissecção de células tumorais após a coloração azul de toluidina, extração de DNA, amplificação nested-PCR e sequenciamento). Este método não produzir resultados falso-negativos. Permitiu realmente uma correta identificação do
Kras
mutações oncogênicas conhecidos em adenocarcinomas. Ele também permitiu uma correta identificação de um
TP53
mutação constitucional caracterizado anteriormente associado com uma síndrome de Li-Fraumeni. Esta mutação foi encontrada em células tumorais ao passo que a caracterização anterior foi levada a cabo por um ensaio funcional em células mononucleares periféricas.
De igual modo, o procedimento actual não criar falsos resultados positivos na análise de espécimes normais ureter recolhidos após nefroureterectomia em pacientes com doenças AA-relacionado ou um carcinoma induzido por fenacetina, e tendo genotipagem convencional atual como padrão-ouro. Isto também se aplica ao executar a laser captura microdissection com alta intensidade. A única mutação encontrada foi um único G A transição (g.12455, p.R156H) na amostra de tecido de um paciente diabético tipo 2 sem qualquer história de neoplasia. De interesse, não há diferença significativa na prevalência de G A transição entre a população em geral e os pacientes diabéticos de tipo 2 [29]. Como avaliado por diluições em série de DNA
TP53
mutado, o limite de detecção do processo de genotipagem de corrente era de 6,25% do mutante a proporção de tipo selvagem.
De interesse, a partir de todos os pacientes a actual série eram mulheres e cada um deles apresentaram pelo menos um
TP53
mutação em seus tecidos malignos uroteliais enquanto uma razão homem /mulher mais equilibrada foi encontrado (53% /47%) em estudos anteriores [11], [14] . Em estudos anteriores, a prevalência de pacientes com
TP53
mutação hotspot variou de 100% (11/11 pacientes BEN) [11] para 37% (36/97 tumores BEN) [12] ou 47% ( 71/151) AA-pacientes de Taiwan [14]. Considerando-se que apenas um único paciente foi relatado com uma mutação na base de dados quíntuplo IARC, a observação corrente que 40% (05/02) dos pacientes abrigava múltipla
TP53
mutações, cada um com seis mutações diferentes (cinco exônico e um mutações intrônicas, entre os quais uma emenda mutação site na paciente 5) foi um impressionante e descoberta muito incomum. É também interessante notar que esta mutação quíntuplo também foi encontrada na série BEN [12], que é um dos maiores até agora relatado série humana de AA Relacionado
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mutações. Em comparação com os dados de cânceres urothelial não relacionados com o AA na base de dados da IARC (n = 1111) e da série de Taiwan (n = 151), a actual série apresentaram o maior aumento da prevalência relativa de mutação e G T transversion no
TP53 e região hotspot. Independentemente da série AA atual ou anterior, a prevalência de A T transversion foi significativamente e consistentemente mais elevada do que no banco de dados da IARC [27]. A nossa descoberta confirma que o número eo perfil de
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mutações por doente é altamente incomum, provavelmente refletindo a súbita exposição altamente tóxico. Se essas múltiplas mutações ocorreram em diferentes clones malignos não foi avaliada. No entanto, o número de áreas tumorais distintos associados a este espectro mutacional complexo certamente reflete a heterogeneidade ampla dentro-tumor com células uroteliais malignas poli- ou multiclonais.
Olhando em detalhes sobre o tipo de mutação hotspot neste estudo, o ponto mutações em pares A:T eram tão frequentes como as que estão em pares G:C (7/16 contra 9/16, respectivamente). Eles foram dominados pela transvers�s com A T e G T representando cada um para 18,7% (3/16) de todo o
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mutações. Curiosamente, a T transversão no tumor urotelial relacionada-AA humano foi relatada pela primeira vez num paciente Reino Unido [30], mas a T transversão foi então frequentemente encontrado na região de p53 ponto de acesso a partir de carcinoma urotelial associada com a nefropatia endémica Balcãs (BEN) [ ,,,0],11], [12], bem como em Taiwan [14]. Em todos estes estudos, a população foi exposto a AA por muitos anos, com valores tão elevados como 66% (33/50) a 72% (13/18) e 55% (46/84) de todos os
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mutações, respectivamente. Na série atual, um tumor com vários
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mutações abrigava dois de A transversões de T, uma característica também comumente relatados no BEN e uma série de Taiwan [11], [12], [14].