Abstract

Fundo

Os microRNAs (miRNAs) têm sido implicados na iniciação e progressão do câncer através de sua capacidade de afetar a expressão de genes e proteínas que regulam a proliferação celular e /ou morte celular. Transcrição dos três membros da família miRNA miR-34 foi encontrado recentemente para ser regulada directamente pela p53. Entre as proteínas-alvo regulados pelo miR-34 são proteínas da via Notch e Bcl-2, sugerindo a possibilidade de um papel para o miR-34 na manutenção e sobrevivência das células-tronco do câncer.

Metodologia /Principais Conclusões

Nós examinamos os papéis de miR-34 em humanos linhas celulares de cancro do pâncreas p53 mutante MiaPaCa2 e BxPC3, ea ligação potencial de células-tronco do câncer de pâncreas. Restauração do miR-34 de expressão nas células de cancro do pâncreas, quer por transfecção de miR-34 imita a infecção ou com lentivírus miR-34-MIF downregulated Bcl-2 e de Notch1 /2. miR-34 restauração inibiu significativamente o crescimento clonogénico e invasão celular, apoptose induzida e G1 e G2 /M no ciclo celular de detenção, e as células sensibilizadas à quimioterapia e à radiação. Identificou-se que as células CD44 + /CD133 + MiaPaCa2 são enriquecidas com células tumorais de iniciação tumorsphere-moldagem e ou cancro da haste /células progenitoras com altos níveis de Notch /Bcl-2 e a perda de miR-34. Mais significativamente, miR-34 restauração levou a uma redução de 87% da população de células iniciadoras de tumores, acompanhado por inibição significativa da tumorsphere crescimento

in vitro

e tumor formação

in vivo

.

Conclusões /Significado

os nossos resultados demonstram que o miR-34 pode restaurar, pelo menos em parte, o tumor função do p53 em células de cancro pancreático humano deficientes em p53 supressora. Os nossos dados suportam a ideia de que o miR-34 pode ser envolvido em células estaminais cancro auto-renovação do pâncreas, potencialmente através da modulação directa de alvos a jusante de Bcl-2 e Notch, o que implica que o miR-34 pode desempenhar um papel importante em células estaminais do cancro do pâncreas auto-renovação e /ou especificação autônoma. Restauração de miR-34 podem ser uma esperança significativa como uma terapia molecular romance para o cancro pancreático humano com perda de p53-miR34, potencialmente através de inibir as células-tronco do câncer de pâncreas

Citation:. Ji Q, Hao X, Zhang M, Tang W, Yang H, Li L, et ai. (2009) MicroRNA miR-34 inibe cancro do pâncreas humano Células-Iniciando tumor. PLoS ONE 4 (8): e6816. doi: 10.1371 /journal.pone.0006816

editor: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Janeiro, 2009; Aceito: 05 de agosto de 2009; Publicado: August 28, 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Ji et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo NIH concede CA121830-01, CA128220-01 e CA134655-01A1 (L. Xu.), e pelo NIH através da Universidade de Suporte Grant Cancer Center de Michigan (P30 CA46592). JTD é um estudante da Universidade de Michigan Graduação Programa Oportunidade Research (UROP). Os financiadores não tiveram nenhum papel na concepção e realização do estudo, na coleta de dados, análise e interpretação e decisão de publicar, revisão, aprovação, ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe conservada de 20-22 nt pequenos RNAs não-codificantes que regulam a expressão gênica e proteica através da ligação ao mRNA levando a degradação do mRNA ou a inibição da tradução [1], [2]. miARNs provável regulam diversos processos biológicos, incluindo a diferenciação de tecidos e manutenção, e tem funções que contribuem em processos de doenças variadas, incluindo o cancro [2], [3], [4]. Algumas evidências sugere que miARNs também desempenham um papel essencial em células estaminais auto-renovação e diferenciação, regulando negativamente a expressão de determinados genes-chave envolvidos na auto-renovação e sobrevivência, os chamados “stem genes celulares” [1], [2] , [4], [5]. Recentemente, os três membros da família de miR-34 foram encontrados para ser regulada directamente pela p53 e a actividade funcional de miR-34 indicou um papel potencial como um supressor de tumor [6], [7], [8], [9] [10], [11], [12]. Nós previamente relatado que a proteína Bcl-2 é regulada directamente pela miR-34 [10]. O relatório de He et al. indicaram que a expressão ectópica de miR-34 induz a paragem do ciclo celular em ambas as linhas celulares primárias e derivadas de tumores, o que é consistente com a capacidade de miR-34 para regular negativamente um programa de genes que promovem a progressão do ciclo celular [11]. Mostrámos recentemente que a expressão de miR-34s é dramaticamente reduzida em células de cancro gástrico p53 mutante e que o restabelecimento da expressão de miR-34 inibiu o crescimento de células de cancro [6]. Perda de miR-34 foi ligada à quimiorresistência de cancro [13]. miR-34a tem sido referida como estando envolvida na apoptose mediada por p53 no cancro do cólon e cancro do pâncreas [8], [9]. Chang et ai. relataram que 15 linhas de células do cancro do pâncreas têm pelo menos uma redução de 2 vezes na expressão de miR-34a como comparado com a expressão em linhas de células normais epiteliais do ducto pancreático [8]. Tomados em conjunto, os estudos publicados sugerem miR-34 membros da família podem ter função supressora de tumores de p53 a jusante. Além disso, porque mais de 50% dos cancros humanos primários têm mutações de inactivação função de p53, as descobertas deram impulso para explorar a restauração funcional de miR-34 como uma nova abordagem para inibir cancros com p53 por perda de função.

Outro papel potencial de miR-34 no início e progressão do câncer pode ser um link para células iniciadoras de tumores ou células-tronco cancerosas (CSC). Tem sido relatado que o miR-34 alvos Notch, c-Met e Bcl-2, os genes envolvidos na auto-renovação e sobrevivência das células de haste do cancro [10], [11], [14]. Actualmente, as ligações entre p53, o alvo a jusante miR-34 e as células-tronco do câncer de pâncreas presumíveis são desconhecidos. No presente estudo, nós examinamos os efeitos de restauração funcional de miR-34 por miR-34 imita e lentiviral miR-34a em células MiaPaCa2 do cancro do pâncreas p53 mutante humanos, bem como a potencial ligação à auto células-tronco do câncer de pâncreas -renovação. Delineando o papel de miR-34 na regulação do crescimento celular e progressão do tumor, ea sua ligação potencial de células iniciadoras de tumores ou células-tronco do câncer pode fornecer uma base para explorar o seu potencial como uma estratégia de tratamento romance.

Materiais e Métodos

cultura celular e reagentes

linhas de células de cancro pancreático humano e a linha celular de fibroblastos de pulmão humano WI-38 normais foram adquiridos à American Type Culture Collection e cultivadas em DMEM (Hyclone, Logan, UT), suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS; Hyclone, Logan, UT). mi

RIDIAN

miRNA miR34a, b, c imita e controle negativo miRNA mimic (NC mímica), mi

RIDIAN

miR-34 inibidores e controles negativos foram obtidos a partir Dharmacon (Chicago, IL) [ ,,,0],6]. Bcl-2 3’UTR plasmídeo repórter de luciferase ou o seu mutante foram relatados anteriormente [10]. iniciadores e anticorpos para Western blot qRT-PCR são descritas na nossa publicação recente [6].

A transfecção de miR-34 imita

MiaPaCa2 células foram transfectadas 24 horas depois de serem semeadas em 6 poços pratos. imita miARN (100 pmol) em 200 ul de, antibiótico-livre isento de soro, o meio foram misturados com 5 ul de Lipofectamina reagente de transfecção 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) dissolvido em 200 ul do mesmo meio e deixada em repouso à sala temperatura durante 20 min. As soluções de transfecção 400 ul resultantes foram, em seguida, adicionado a cada poço contendo 1,6 ml de meio. Seis horas mais tarde, as culturas foram substituídos com 2 ml de meio fresco suplementado com FBS 10% e antibióticos. Por Western blot, as células foram recolhidas após um 48 horas adicionais.

Lentivirus miR-34a infecção

O vírus da imunodeficiência felina (FIV) sistema lentiviral expressar miR-34a (miR-34a-MIF) ou controlo de vector (MIF), bem como um sistema de embalagem de lentivírus, foram adquiridos a partir do sistema Biosciences (SBI, mountain View, CA). células MiaPaCa2 e BxPC3 foram infectadas com o sistema de lentivírus FIV expressando o miR-34a (miR-34a-MIF) ou controlo de vector (MIF), e as células infectadas foram seleccionadas através de resistência a antibióticos (zeocina de 50 ug /mL, Invitrogen), tal como recentemente descrito [6].

miR-34 Bcl-2-3’UTR ensaio repórter

MiaPaCa2 células foram transfectadas em placas de 6 poços, com 2 ug de proteína Bcl-2 3’UTR luciferase plasmídeo repórter ou sua mutante [6], [10], e 2 pg do plasmídeo de controlo β-galactosidase, por poço, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As células foram também co-transfectadas com 100 pmol de cada miR-34 mímica ou NC mímico, como indicado, utilizando Lipofectamine 2000. Os ensaios de luciferase foram realizados 24 horas depois da transfecção usando Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega). A actividade de luciferase foi a actividade de p-galactosidase normalizada em relação detectado pelo ensaio do sistema β-galactosidase (Promega). Em cada caso, mutante de Bcl-2 3’UTR indica a introdução de alterações nos locais complementares de semente de Bcl-2 3’UTR [10].

A formação de colónias e ensaio clonogénico

Para ensaio de formação de colónia, as células foram transfectadas com o miR-34 imita ou NC imitar durante 24 h, e depois semeadas numa placa de 6 poços em triplicado. 0,2 ml de FBS foi adicionado por poço no dia 5. Após 9-10 dias de incubação, as placas foram suavemente lavadas com PBS e coradas com 0,1% de violeta de cristal. Colónias com mais de 50 células foram contadas manualmente. eficiência de plaqueamento foi calculado dividindo-se o número de colónias formadas no grupo tratado pelo que no controlo. Para o ensaio de sobrevivência clonogénica, as células foram transfectadas com o miR-34 imita ou NC imitar durante 24 h, e depois semeadas em placas de 6 poços em triplicado, a densidade celular desejada (200~10,000 células /poço), seguida por radiação de raios-X . As curvas de sobrevivência de célula foram representados graficamente usando um modelo linear-quadrática e o rácio de aumento de radiação (ER) foi calculada como previamente descrito [15], [16], [17].

quantitativo em tempo real de RT- PCR (qRT-PCR)

qRT-PCR foi realizado para determinar os níveis de potenciais genes de miR-34-alvo [6] expressão. Vinte e quatro horas após o miR-34 transfecção mímico de células MiaPaCa2 com miR-34 imita (100 pmol por cavidade em placas de 6 poços), a expressão de genes alvo potencial foi medido por qRT-PCR com SYBR sistema de PCR verde (TaqMan) . Resumidamente, ARN total foi extraído das células transfectadas utilizando TRIZOL (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa foi realizada utilizando um Kit de Transcrição Reversa TaqMan (Applied Biosystems). Para qRT-PCR, foi aplicado 1 ml de iniciadores do gene com SYBR Green (Applied Biosystems) em 20 uL de volume de reacção. Os iniciadores foram concebidos como: Bcl-2, para a frente, 5′-CAT GCT GGG GCC GTA CAG-3 ‘, reverso, 5′-GAA CCG GCA CCT GCA CAC-3′; HMGA2, para a frente, 5’-TTT GTA ATC CCT TCA CAG TCC-3 ‘, reverso, 5′-TTT CTC ACC CGC CCA C-3′; Notch1, para a frente, 5’-ATC CAG AGG CAA ACG GAG-3 ‘, reverso, 5′-CAC ATG GCA ACA TCT AAC CC-3′; Notch2, para a frente, 5’-GGA CCC TGT CAT ACC CTC TT-3 ‘, reverso, 5′-CAT GCT TAC GCT TTC GTT TT-3′; Notch3, para a frente, 5’-TGA TCG GCT CGG TAG TAA TG-3 ‘, reverso, 5′-CAA CGC TCC CAG GTA GTC A-3′; Notch4, para a frente, 5’-TGC GAG GAA GAT ACG GAG TG-3 ‘, reverso, 5′-CGG GAT CGG AAT GTT GG-3′; β-actina, para a frente, 5’-ATG CAG AAG GAG ATC ACT CG-3 ‘, reverso, 5′-TAG TCA TCC CCG TAG AAG CA-3’. Todas as reacções com TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) foram realizadas no Mastercycler Realplex 2 (Eppendorf, Westbury, NY). Os níveis de ARNm do gene alvo foram normalizados para ARNm de actina de acordo com a seguinte fórmula: [2- (C

T

alvo – C

T

Actina)] x 100%, em que C

T é o ciclo limiar. A expressão relativa foi calculada dividindo a expressão do gene alvo normalizado da amostra tratada com a do controlo não tratado, com o valor de NC imitam definido como uma unidade arbitrária. Para a expressão de genes-alvo nas células classificadas, os dados foram normalizados para a de actina (set actina = 1000 unidade arbitrária).

Caspase-3 ativação ensaio

ativação Caspase nas células MiaPaCa2 transfectadas foi determinada seguindo as instruções de um kit de ensaio Caspase-3 activação (BioVision, mountain View, CA). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lisadas e os lisados ​​de células inteiras a (20 ug) foram incubados com 25 ^ M de substrato fluorogénico DEVD-AFC num tampão de reacção (contendo 5 mM de DTT) a 37 ° C durante 2 h. libertação proteolítica de AFC foi monitorizada a λex = 405 nm e λem = 500 nm, utilizando um leitor de microplacas de fluorescência (BMG LABTECH, Durham, NC). Relativa activação da caspase-3 foi calculado através da normalização do sinal de fluorescência em cada amostra tratada com a do controlo NC mímica ou MIF definido como unidade arbitrária 100 [16].

citotoxicidade celular ensaio

MiaPaCa2 células foram transfectadas com miR-34 mímica ou NC imitar durante 24 h, plaqueadas em placas de 96 poços (5.000 células /poço), e tratou-se com agentes quimioterapêuticos diluídas em série, em triplicado. Após 96 h de incubação, foram adicionados 20 ul /poço de reagente de CCK-8 e foram incubadas a 37 ° C durante 1-3 h. A densidade óptica foi medida a 450 nm e 650 nm utilizando um leitor de microplacas (BMG LABTECH, Durham, NC). IC

50, a concentração de fármaco que inibe o crescimento celular de 50% foi calculado por GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA) como descrito anteriormente [18].

Análise

ciclo celular e apoptose

para o ciclo celular e a análise da apoptose por citometria de fluxo, as células MiaPaCa2 foram transfectadas com miR-34 imita ou NC imitar em placas de 6 poços, tripsinizadas 24 horas mais tarde e lavou-se com solução salina tamponada com fosfato e fixadas em 70% de etanol em gelo . Após centrifugação, as células foram coradas com 50 ug /ml de iodeto de propídio e 0,1 ug /ml de RNase A, e analisadas por citometria de fluxo utilizando um FACStar Plus ™. Cada histograma foi construída com os dados a partir de pelo menos 5.000 eventos. Os dados foram analisados ​​para calcular a percentagem de população de células em cada fase, utilizando o software CellQuest, bem como a% de células em sub-G1 (Becton Dickinson) [18].

CD44 e CD133 coloração e separação de células

MiaPaCa2

células foram incubadas com conjugado com PE anti-humana anticorpo CD133 /1 e anticorpo CD44 anti-humano de APC-conjugado (Miltenyi Biotec, Aubum, CA, EUA) em PBS contendo 2% de FBS. do mesmo isotipo imunoglobulina de ratinho serviram como controlos. Por citometria de fluxo, as amostras foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur e o software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Para separação de células por citometria de fluxo, as amostras foram analisadas e classificadas num BD FACSVantage SE (BD Biosciences). Alíquotas de CD133

+ e CD133

– células separadas foram avaliadas quanto à pureza com um software de máquina e CellQuest FACSCalibur (BD Biosciences), utilizando PE-conjugado anticorpo anti-humano CD133 /2 (Miltenyi Biotec) [19].

cultura Tumorsphere

As células MiaPaCa2 ordenadas foram suspensas em DMEM meio de cultura isento de soro contendo 1% de suplemento de N2, 2% de suplemento B27, 1% antibotic-antimicótico (Invitrogen), 20 ng /ml de FGF-2 humano (Sigma), e 100 ng /ml de EGF (Invitrogen), e plaqueadas em placas de 24 cavidades de ligação de ultra-baixo (Corning) 2.000 células por poço. 7-10 dias mais tarde, as placas foram analisadas para tumorsphere formação e foram quantificados usando um microscópio invertido (Olympus) a 100X, 200X, e 400 × ampliações. Para a quantificação subsequente do número de células por tumorsphere, tumorspheres foram recolhidos com um crivo de 40 mm (BD Biosciences, San Jose, CA) e dissociados com tripsina para fazer uma suspensão de células individuais. As células viáveis ​​foram então contadas utilizando exclusão com azul de tripano.

modelo animal e em estudos in vivo a formação de tumores

de cinco a seis semanas de idade atímicos fêmea NCr-nu /nu ratinhos nus foram adquiridos a partir de NCI. células MiaPaCa2 foram transfectadas com mímica miR-34a ou NC imitar durante 24 h. As células foram colhidas e inoculadas em ratinhos nus por via subcutânea (s.c.) em ambos os flancos, depois da preparação do álcool da pele, utilizando uma agulha estéril de calibre 22 com 0,2 ml de suspensão de células de 1 x 10

6 células, com retenção manual. Os tamanhos dos tumores foram medidos com paquímetro. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: (comprimento x largura

2) /2. No Dia 38, todos os tumores foram recolhidos para medir os pesos tumorais. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo aprovado pela Universidade de Michigan Diretrizes para Uso e tratamento dos animais.

A análise estatística

Two-way ANOVA e bicaudal

t

-Testes foram empregados para analisar o

in vitro

e

in vivo

dados usando Prism 5.0 software (GraphPad, San Diego, CA).

P

. 0,05 foi definido como estatisticamente significativa

Resultados

A expressão de miR-34 em linhas celulares de cancro pancreático humano

Nós examinamos uma série de linhas de células de cancro pancreático humano, MiaPaCa2, BxPC3, Capan1, Capan2, Panc-1, e a linha celular de fibroblastos de pulmão humano WI-38 normais, para miR-34a, b, c expressão. Foram também avaliadas em paralelo a expressão de genes alvo de miR-34-regulados presumíveis e proteínas, utilizando os iniciadores e os métodos como descrito recentemente [6]. células MiaPaCa2 e BxPC3 têm níveis de expressão muito baixos de ambos os primário e amadurecer miR-34a, b, c, mas altos níveis de genes miR-34-alvo

BCL2 Comprar e

Notch1

, e diferentes níveis de

Notch2-4

(Figura 1). Eles também têm baixos níveis de expressão de p21 (Figura 1

C

), um outro alvo de ARNm de p53, consistente com o estado de p53 mutante da linha celular. Com base nestes dados e nossa observação de que eles são altamente tumorigénico e reprodutível formar tumorspheres

in vitro

, nós escolhemos as duas linhas de células para o estudo atual.

A

, A análise de western blot.

B

, análise de qRT-PCR dos níveis de expressão relativos de miR-34s.

C

, análise de qRT-PCR dos níveis de expressão de miR-34 genes alvo em linhas celulares de cancro pancreático humano, bem como células normais de fibroblasto humano WI-38. As células foram lisadas para extrair o ARN total de qRT-PCR, os dados foram normalizados para a de actina e os níveis relativos são mostrados (actina = 1,000). Nota p21 é um gene alvo de p53.

miR-34 restauração por transfecção de células MiaPaCa2 com miR-34 imita

Para investigar os efeitos de miR-34 restauração sobre o câncer de pâncreas células, nós transfectadas células MiaPaCa2 com miR-34 imita ou controle não específica miRNA mimic (NC mímica). A análise de transferência de Western (Figura 2

Um

) mostrou que a transfecção de miR-34 imita regulada negativamente a expressão de genes alvo, Bcl-2, Notch1 e Notch2 ao nível da proteína, mas não teve efeito sobre a Bcl-xL e Mcl -1 expressão, indicando que o gene alvo knock-down por miR-34 imita afeta transcrições abrigando miR-34 sites de destino. miR-34a, miR-34b e miR-34C imita todos tinham actividades semelhantes. Figura 2

B

mostra a análise de qRT-PCR dos potenciais genes alvo; miR-34 imita fortemente inibida

BCL2

e

Notch1

expressão do gene, de acordo com os dados de Western blot. Eles expressão também inibida de p21 (Figura 2

B

), outro alvo de p53, mas têm efeito limitado sobre Notch3 e cMET. Curiosamente, a inibição da expressão Notch2 ao nível da proteína por miR-34 não foi acompanhado por inibição ao nível do ARNm, de acordo com relatórios anteriores que miARN inibe a expressão do gene alvo pós-transcricionalmente, com ou sem a degradação de ARNm [11], [20 ].

A

, miR-34 restauração down-regula proteínas-alvo Bcl-2, Notch1 e Notch2, sem efeitos sobre Mcl-1. células MiaPaCa2 foram transfectadas com miR-34 imita ou controlo não-específica miARN mímico (NC imitador) (100 pmol por cavidade em placas de 6 poços por Lipofectamina 2000) durante 48 horas, em seguida, recolhido para análise de Western blot.

B

, em tempo real, análise de PCR quantitativa dos níveis de mRNA potenciais genes-alvo após miR-34 transfecção imitar em células MiaPaCa2. **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001, Estudante de

t

-teste, n = 2.

C

, Bcl-2 3’UTR luciferase Reporter Assay mostra que as transfectadas miR-34 imita são funcionais. células MiaPaCa2 foram co-transf ectadas com Bcl-2 3’UTR luciferase repórter ou seu mutante, vetor b-gal, juntamente com qualquer miR-34 imita ou NC mímica. ensaio de luciferase foi realizada 24 horas após a transfecção usando brilhante Glo Luciferase Assay System. A actividade de luciferase foi normalizada relativamente à actividade de b-gal. barra de erro indica �e.p.m

Para avaliar se os transf miR-34 imita são funcionais, foi realizado o ensaio de repórter Bcl-2 3’UTR como recentemente descrita [6], [10]. Os transf miR-34 imita inibiu a expressão do gene repórter de luciferase, o qual é controlado por Bcl-2 3’UTR na região promotora (Figura 2

C

). No entanto, a mutação na proteína Bcl-2 3’UTR complementar à sequência de semente de miR-34 aboliu este efeito, indicando que a actividade observada é específica da sequência. Os resultados demonstram que os miR-34s transfectadas são funcionais e confirmar que a proteína Bcl-2 é um alvo directo de miR-34, consistente com relatos anteriores [8], [10], [21].

Para avaliar os efeitos a longo prazo da restauração miR-34, que também empregado um sistema de lentivírus para expressar o miR-34a. O sistema de lentivírus da imunodeficiência felina vírus expressando o miR-34a (miR-34a-MIF), ou controlo de vector (MIF), foi usado para infectar células MiaPaCa2 e BxPC3 e a população de células infectadas foi seleccionado através de resistência à zeocina [6]. Figura S1 mostra a caracterização das mudanças de expressão nas células miR-34a-MIF. A análise de transferência de Western revelou que a proteína Bcl-2 foi regulada para baixo em células de miR-34a-MIF, em comparação com as células de controlo do vector de MIF (Figura S1

Um

), consistente com a análise de qRT-PCR da Bcl 2 nível de mRNA (Figura S1

B

). Bcl-2 3’UTR Luciferase Reporter Assay mostrou que o miR-34a é funcional nas células de miR-34a-MIF (Figura S1

C

).

miR-34 inibe a restauração de células MiaPaCa2 crescimento clonogênica e leva à ativação de caspase-3 e apoptose

Depois de validar que os transfectadas miR-34 imita eram funcionais, realizou-se um ensaio de clonogênica para examinar os efeitos de miR-34 restauração sobre o crescimento celular. Como mostrado na Figura 3

A-B

, miR-34 restauração inibiu significativamente o crescimento de células clonogénicas, com miR-34a imitar induzir 80% de inibição da formação de colónias em comparação com NC imitam (18,3 ± 3,8 colónias /bem vs. 95,3 ± 1,8% colónias /poço). Resultados semelhantes foram observados em células de miR-34a-MIF que cresceram mais lentamente do que células de controlo MIF, como indicado por tanto o número significativamente reduzido de Azul de Tripano-excluindo células viáveis ​​no ensaio de crescimento celular (Figura S1

D

) e a formação de colónias reduzida (Figura S1

e

). Nós também examinou o efeito de inibição da endógena miR-34 no crescimento celular por mi

RIDIAN

inibidores de miR-34. Eles são de cadeia simples quimicamente reforçada oligonucleotídeos que podem efetivamente inibem a endógena amadurecer miR-34. miR-34 inibidores induziu um aumento de quase 20% no crescimento clonogénicas, em comparação com o controle (120,3 ± 2,9 vs. colónias /poço 95,3 ± 1,8 colónias /poço) (Figura 3

A-B

). Nós também realizado um ensaio de invasão celular em células MiaPaCa2 com miR-34 restauração por ambos mímica miR-34a e miR-34a-MIF. miR-34 inibiu significativamente a capacidade de invasão das células MiaPaCa2 (Figura S2). Os nossos resultados demonstram que o miR-34 está envolvido no crescimento de células MiaPaCa2; restauração miR-34 inibe o crescimento clonogénico, e inibição de miR-34 endógena por inibidores de miR-34 promove o crescimento. Os dados são consistentes com a função supressora de tumores relatado de miR-34 [6], [8], [9], [11], [22].

MiaPaCa2 células foram transfectadas com o miR-34 imita ou inibidores, 24 horas mais tarde as células foram semeadas em placas de 6 poços (200 células /poço, em triplicado). Após 12-14 dias de incubação, as placas foram suavemente lavadas com PBS e coradas com violeta de cristal a 0,1%.

A

, imagens representativas das colônias.

B

, Colonies com mais de 50 células foram contadas.

C

, Restauro de miR-34 leva a ativação da caspase-3. ensaio de activação de caspase-3 foi realizada tal como descrito em

Materiais e Métodos

. vezes de aumento do sinal de fluorescência foi calculada pela divisão do sinal normalizado em cada amostra tratada com a do controlo não tratada. **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001, Estudante de

t

-teste, n = 3.

D

, a distribuição do ciclo celular de células MiaPaCa2 transfectadas com miR-34 imita. análise do ciclo celular foi efectuada um dia após a transfecção. As células foram coradas com iodeto de propídio após fixação etanol e analisados ​​por citometria de fluxo.

Como a função supressora de tumores de p53 é mediada, em parte, através da indução de apoptose [23], [24], examinámos o efeito de restauração miR-34 sobre a indução de apoptose em células MiaPaCa2 transfectadas com miR-34 imita. Como mostrado na Figura 3

C

, a transfecção transiente de miR-34 imita resultou num aumento de forma significativa a activação de caspase-3, uma indicação chave das células que sofrem apoptose [25]. Nós também avaliado o efeito do miR-34 imita no ciclo celular. miR-34 imita resultou em G1 significativo e G2 /M prisão e uma redução de células em fase S (Figura 3

D

), consistente com outros relatórios sobre miR-34 restauração em vários modelos de cancro [6], [7], [8], [10], [11], [21], [22], [26]. Este efeito sobre o ciclo celular é semelhante à da restauração p53 como relatado anteriormente [23], [24], [27], [28], indicando que o miR-34 restauração pode exercer efeitos semelhantes ao restabelecimento da função supressora de tumor p53, pelo menos em parte, nas células com perda de p53 da função.

miR-34 restauração sensibiliza células MiaPaCa2 à quimioterapia e radioterapia

em seguida, examinamos se miR-34 restauração poderia sensibilizar a células de cancro do pâncreas com um elevado nível de endógena de Bcl-2 para a expressão por quimioterapia e radioterapia. O ensaio de citotoxicidade baseado em WST-1 foi usado como descrito recentemente [6], [18], para avaliar a resposta das células a três agentes quimioterapêuticos, docetaxel, cisplatina, e gemcitabina, todos os quais são actualmente utilizados para a quimioterapia do cancro do pâncreas. Como mostrado na Figura 4

Um

, miR-34 em células MiaPaCa2 restauração rendeu as células 2-3 vezes mais sensíveis aos agentes quimioterapêuticos, em comparação com as células de controlo do vector, com base em dados de IC50. Em ensaios de apoptose, restauração de miR-34a aumentou significativamente gemcitabina ou a radiação induzida por ativação de caspase-3 (Figura 4

B

) e as células sub-G1 (Figura 4

C

). Nós também realizaram ensaio clonogênica, miR-34a imitar sensibilizadas células MiaPaCa2 a radiação de raios-X, com um rácio de aumento de radiação (ER) = 1,3 (Figura 4

D

). Os nossos dados demonstram que o miR-34 restauração pode superar quimio- /radiorresistência das células de cancro do pâncreas, que têm elevados níveis de Bcl-2 e baixos níveis basais de miR-34s, e são dependentes de Bcl-2 para a sobrevivência e resistência à terapia.

a

, miR-34 restauração sensibiliza as células a agentes quimioterapêuticos. O ensaio de citotoxicidade baseado em MTT foi realizado usando as células MiaPaCa2-miR-34a-MIF e MIF MiaPaCa2-estáveis ​​resistentes à zeocina.

B

, miR-34 restauração aumenta a ativação da caspase-3 induzida por gemcitabina ou radiação de raios X em células MiaPaCa2. Relativa activação da caspase-3 foi calculado através da normalização do sinal de fluorescência em cada amostra tratada com a do controlo mímica ou MIF como NC 100. *

P

0,05, ***

P

0,001, de Student

t

-test, n = 3.

C

, miR-34 restauração aumenta a apoptose induzida por radiação nas células MiaPaCa-2. As células foram transfectadas com mímica miR-34a ou NC mímica. 24 horas mais tarde, as células foram sujeitas a radiação de raios-X. As células foram recolhidas depois de mais 48 horas, coradas com iodeto de propídio após fixação etanol, e analisadas por citometria de fluxo para a% de células na fase sub-G1. *

P Art 0,05, teste t de Student, n = 2.

D

, miR-34 restauração radiosensitized células MiaPaCa-2. O ensaio clonogénico foi realizada como descrito em

Materiais e Métodos

Os dados são apresentados como média +/- SD (n = 3).

/CD44 + CD133 + são tumorsphere-formando e células com alta Bcl-2 e a perda de miR-34 de expressão de iniciação do tumor

Para investigar o efeito potencial de miR-34 restauração em células de iniciação de tumor na linha celular MiaPaCa2, examinamos primeiro o tumor- iniciar célula ou população de células estaminais em células de cancro MiaPaCa2 com vários marcadores de superfície celular. Tanto CD44 [29] e CD133 [19], [30] foram utilizados como marcadores para identificar as células estaminais do cancro do pâncreas de tecidos tumorais humanos. No entanto, não existe qualquer relato sobre as células estaminais em células MiaPaCa2 cancro. Foi avaliado o estado CD44 e CD133 em células MiaPaCa2 por coloração de imunofluorescência e FACS classificação. Cerca de 60% das células são CD44 + e 3-5% das células são CD133 +, no entanto, apenas 1-2% das células são CD44 + /CD133 + double-positivo (Q2 na Figura 5

A

). Para examinar o potencial de auto-renovação das células com diferentes perfis de marcador de superfície, que se comprometeu a cultura tumorsphere das células classificadas em uma placa de cultura de fixação ultra-low especial com meio condicional para tumorsphere cultura [29]. Sete a dez dias mais tarde, as células MiaPaCa2 CD44 + /CD133 + double-positivos cresceu tumorspheres típico, mas não as células dupla negativa CD44- /CD133-, enquanto CD44 células + /CD133- ou CD44- /CD133 + single-positivos tinham menos e menores esferas (Figura 5

B-C

). Um representante de tumorsphere CD44 + CD133 + /células é mostrada na Figura 5

B

(a pastilha). Nós também realizado um ensaio de diluição limitante tumor-iniciação em ratinhos nus utilizando as células separadas, e os dados estão resumidos na Tabela 1. As células CD44- /CD133- não formam tumores, enquanto que 1 × 10

4 CD44 + células /CD133 + tumor formado em 4 de 4 ratos, 1 × 10

3 CD44 + /CD133 + células de tumor formado em 2 de 4 ratos, e nenhum tumor formado com 1 × 10

2 células. Assim, nossos dados demonstram que o CD44 + /células MiaPaCa2 double-positivos CD133 + são enriquecidas com células iniciadoras de tumores ou células do cancro da haste /progenitoras capazes de auto-renovação, mas a /CD133- população dupla negativa CD44- não contém essas células. Os nossos resultados também sugerem que a CD44 /CD133 são marcadores adequados para células de iniciação de tumor na linha celular MiaPaCa2.

Um

, CD44 e CD133 coloração das células MiaPaCa2. MiaPaCa2 células foram coradas pelo anti-CD44-APC e anti-CD133-PE e ordenados por FACS. Cerca de 1-2% das células são CD44 + /CD133 + double-positivo (Q2).

B-C

, cultura Tumorsphere das células classificadas. As células separadas foram semeadas para tumorsphere cultura como descrito no

Materiais e Métodos

. 7-10 dias depois, tumorspheres foram contadas (

B

). A inserção mostra um tumorsphere representante de CD44 + /CD133 + células MiaPaCa2.

C

.