Abstract

4-metiltiobutilo isotiocianato (MTBITC), um grupo alifático, composto sulfúrico a partir

Brassica e legumes, possui

in vitro

e

in vivo

atividade antitumoral. Recentemente, demonstrou o potencial inibidor do crescimento potente do agente prejudicial DNA MTBITC em células cancerígenas do fígado. Aqui nós agora mostram que MTBITC baixo regula telomerase, que sensibiliza células para indução de apoptose. Este é mediada pela activação de MAPK, mas independente da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Dentro de uma hora, MTBITC induzida danos no DNA em células cancerosas correlacionando a um aumento transitório na expressão de mRNA hTERT que depois se transformou em supressão de telomerase, evidente em mRNA, assim como o nível de atividade da enzima. Para esclarecer o papel da MAPK para a regulação da telomerase, as células cancerosas do fígado foram pré-tratados com inibidores específicos de MAPK antes MTBITC exposição. Isso mostrou claramente que elevação transitória da expressão de mRNA hTERT foi predominantemente mediado pelo membro da família MAPK JNK. Em contraste, activada de ERK1 /2 e P38, mas não de JNK, sinalizou a ab-rogação da telomerase e consequente indução da apoptose. danos no ADN por MTBITC também foi fortemente suprimida pela inibição MAPK. O estresse oxidativo, como analisado por ensaio de fluorescência DCF, espectroscopia de ressonância de spin eletrônico e formação de 4-hydroxynonenal foi encontrado como não relevante para este processo. Além disso, a N-acetilcisteína pré-tratamento não teve impacto na supressão da telomerase induzida MTBITC-despolarização ou do potencial de membrana mitocondrial como marcador de apoptose. Nossos dados, portanto, implica que a um dano de DNA por MTBITC, MAPK são essenciais para a regulação da telomerase e conseqüente comprometimento do crescimento em células de tumores do fígado e esse detalhe, provavelmente, desempenha um papel importante na compreensão da eficácia potencial quimioterápico da ITC

Citation.: Lamy E, Herz C, Lutz-Bonengel S, Hertrampf a, Márton MR, Mersch-Sundermann V (2013) a MAPK Pathway Sinais telomerase Modulação em resposta ao dano DNA isotiocianato Induzida de células de câncer de fígado humano. PLoS ONE 8 (1): e53240. doi: 10.1371 /journal.pone.0053240

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de julho de 2012; Aceito: 27 de novembro de 2012; Publicação: 31 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lamy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. E.L. é financiado por uma bolsa acadêmica da Fond Social Europeu e pelo Ministério da Ciência, Investigação e Artes de Baden-Württemberg, Alemanha. H-R.M. foi financiado em parte para este projecto pelo Programa Operacional Setorial “Desenvolvimento de Recursos Humanos 2007-2013” do Ministério do Trabalho, da Família e da Protecção Social romeno através do Acordo Financeiro POSDRU /88 /1,5 /S /60203. O estudo foi parcialmente financiado por uma bolsa da Fundação Mattern, Alemanha. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

telomerase fornece um alvo promissor para a

selectiva

abordagem terapêutica de doenças malignas em que 80 a 90% de células cancerosas de forma estável (re) expressar esta enzima ao mesmo tempo que é reprimido na maioria dos tecidos normais somáticas [ ,,,0],1]. hTERT, a subunidade catalítica da enzima, é conhecido por exercer efeitos anti-apoptóticos e interagir com a via de resposta a danos no ADN. Em consequência células de cancro são mais resistentes contra os agentes quimioterapêuticos ou a terapia de radiação [2], [3], [4], [5].

isotiocianatos (ITC), que ocorrem naturalmente, componentes vegetais secundários da família

Brassicaceae,

são conhecidos por sua quimiopreventivo e ações -therapeutic tanto

in vitro

e

in vivo

[6], [7], [8]. Um número de estudos relataram o crescimento e suprimir a apoptose induzindo potência deste grupo em células cancerosas e investigadas vias de sinalização subjacentes [9]. ITC foram mostrados para interferir com muitos factores que são alteradas nas células cancerosas, tais como a interacção com a família Bcl-2, mas elas também têm sido mostrados para diminuir selectivamente a actividade de HDAC [10]. Recentemente ITC foram mostrados inibidores de telomerase como potentes durante a indução de apoptose em células de cancro diferentes [11], [12], [13], [14]. Sulforafano (SFN), e. g. suprimida da telomerase durante a sua inibição de proliferação de células MCF-7, bem como MDA-MB-231 células cancerosas da mama [11]. A telomerase revogação por SFN ou feniletilo CIT também se correlacionou com a morte programada de células HeLa cervicais bem como células de cancro da próstata PC-3 [13], [14]. Além disso SFN inibida da telomerase em células cancerosas humanas Hep3B do fígado que igualadas morte celular programada [12]. Esta inibição foi, em seguida, sugeriu ser mediados pela produção de espécies de oxigénio reactivas (ROS). Outros estudos têm demonstrado até agora que o estresse oxidativo e ativação do (MAPK) via de sinalização ativada por mitógeno estavam envolvidos na morte de células cancerosas pelo ITC [15]. No entanto, os dados publicados até agora implica que ROS dependência de morte celular, bem como o envolvimento de MAPK poderia ser célula específica.

Em estudos anteriores, que já demonstrou o comprometimento do crescimento eficiente das células de câncer de fígado pelo ITC [16]. Nós assim como objectivo no presente estudo para investigar a relevância da ativação de MAPK e estresse oxidativo de morte celular e regulação da telomerase em células cancerígenas do fígado. Portanto utilizou-se linhas celulares de telomerase positiva HCC (HepG2, Huh7 e Hep3B) que diferem na sua supressor tumoral p53 status (TP53), bem como os hepatócitos primários humanos saudáveis, desprovidas de telomerase. Os resultados confirmaram a activação de todos os três MAPK (JNK, ERK1 /2 e P38) por tratamento MTBITC independente do TP53 ou o estado de malignidade da células. Poderíamos, além disso, mostram que a deficiência de crescimento, bem como alterações no nível de telomerase foi sinalizado por MAPK mas não relacionados com a produção de ROS. danos no DNA desencadeada por MTBITC foi inibida em células quando MAPK foram especificamente bloqueados.

Materiais e Métodos

Chemicals

N-acetilcisteína (NAC), menadiona, 2 ‘, 7 ‘diclorofluoresceína diacetato de (DCF-dA), dexametasona, Tween® 20, benzo [a] pireno (B (a) P e iodeto de propídio (PI) foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (Steinheim, Alemanha) de DMSO (pureza . 99% ) foi de Applichem (Darmstadt, Alemanha). β-mercaptoetanol e valinomicina foi adquirido à Fluka (Buchs, Suíça). Dulbecco Minimal Essencial Médium (DMEM), soro fetal de vitelo (FCS), a tripsina 10 × (25 mg /ml), tripsina-EDTA a 10 × (5 mg /ml, respectivamente, 2,2 mg /ml), L-glutamina e solução salina de fosfato tamponada (PBS, sem Ca e mg) foram de PAA Laboratories GmbH (Cölbe, Alemanha). A penicilina-estreptomicina (P /S) solução, RPMI-1640, 5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodeto (JC-1), insulina-transferrina-Selen (STI) e SYBR ouro 10.000 × eram da life Technologies Invitrogen (Darmstadt, Alemanha) ,. 4-hydroxynonenal (ENH) foi comprado de Cayman Europa (Tallinn, Estónia). 4-metiltiobutilo isotiocianato (MTBITC, erucin) foi sintetizado pelo Inst. of Organic Chemistry, Universidade de Giessen, Alemanha, tal como descrito antes [17].

O SB203580 inibidor de p38, JNK e SP600125 inibidor de inibidor de JNK V foram adquiridos a partir de Santa Cruz, (Califórnia, EUA). O ERK1 /2 U0126 inibidor, inibidor de p38 SB202190 e ERK1 /2 PB98059 inibidor foram obtidos a partir de sinalização celular (Boston, EUA). Os seguintes anticorpos primários foram utilizados para imunoblotting: anti-P-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr201, 1:2000), anti-p-JNK (Thr 183 /Tyr185, 1:2000, clone G9), anti-PC-Jun Ser73 e anti-p-p38 (Thr180 /Tyr182, 1:500) de sinalização celular, anti-4-hidroxinonenal (1:250; clone 198960) a partir de R D Systems Europe (Abingdon, Inglaterra) e anti-beta-actina (1:10000, clone AC-74) a partir de Sigma Aldrich. A peroxidase de rábano (HRP) marcado com anticorpos secundários anti-murganho e anti-coelho foram adquiridos de sinalização celular. água livre de nuclease era de Qiagen (Hilden, Alemanha). Caspase 3/7 reagente GLO foi da Promega (Mannheim, Alemanha). inibidores MTBITC, menadiona e a MAPK foram dissolvidos em DMSO estéril. HNE foi dissolvido em etanol.

HCC Linhas Celulares

HepG2 (WT-p53) e Hep3B (null-p53) linhas de células foram obtidas a partir da Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares (DSMZ) , Braunschweig, Alemanha. células Huh-7 (MUT-p53), fundado originalmente pelos Nakabayashi et al. [18] foram gentilmente cedidas por H. Blum (Centro Médico da Universidade de Freiburg, Alemanha). As células foram cultivadas em baixo DMEM de glucose suplementado com 15% (HepG2) ou 10% (Huh7, Hep3B) de FCS e 1% de P /S em 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C até 70% de confluência e subsequentemente colhidas com tripsina. verificação linha celular foi feito por verificação microscópica da morfologia das células e para a análise da curva de crescimento, numa base regular. Apenas as células em número de passagens 4-10 foram usadas. A cultura de células foi ainda testado negativo para contaminação por micoplasma.

Primária hepatócitos humanos

hepatócitos normais foram isolados dentro de 2 h a partir de material retirado de pacientes que tinham sido submetidos a hepatectomia parcial e de quem prévio consentimento por escrito teve sido obtido. Esta parte foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Freiburg. Avaliação do parênquima hepático não-tumoral foi realizada por um patologista sênior, com experiência em patologia hepática. Os hepatócitos foram isolados usando a técnica de dois passos perfusão com colagenase de acordo com um protocolo modificado a partir de Guguen-Guillouzo

et ai.

[19] e Strom

et ai.

[20]. As células foram, em seguida, finalmente ressuspensas em meio RPMI-1640 suplementado com 15% de FCS, 2 mM de L-glutamina 1% de P /S, 1% de ITS, 100 nM de dexametasona e cultivadas num CO 5%

2 atmosfera a 37 ° C durante 20 horas.

Determination of Drug efeito

O efeito da droga foi testada em passagens precoces (P4-P10). Para as experiências, as células foram semeadas, suplementado com meio de cultura e incubadas durante 48 h a 37 ° C, 5% de CO

2 atmosfera. Depois disso, as células subconfluentes foram expostas a MTBITC durante 1 a 48 h e subsequentemente processada para os ensaios. Em algumas experiências, as células subconfluentes foram pré-tratados com o antioxidante N-acetilcisteína (NAC) em concentrações entre 1,25-10 mM durante 1 h. Em seguida, as células foram cuidadosamente lavadas com PBS antes da adição de MTBITC durante mais 24 h e preparação subsequente ensaio. Noutras experiências, as células subconfluentes foram pré-tratadas durante uma hora com inibidores de MAPK específicos, quer 10