Abstract

Há necessidade significativa para identificar alvos de drogas câncer de próstata novos porque terapias hormonais atuais eventualmente falhar, levando a uma doença resistente à droga e fatal denominado câncer de próstata resistente à castração. Para identificar funcionalmente genes que, quando silenciada, diminuir a proliferação de células de câncer de próstata ou induzir a morte celular em combinação com anti-androgénios, empregamos uma tela de RNA de código de barras curto hairpin baseada em interferência de RNA em células de câncer de próstata humano LNCaP. Foram identificados e validados quatro genes candidatos (

AKT1

,

PSMC1

,

STRADA

, e

TTK

) que o crescimento deteriorado quando silenciada em receptor de andrógeno positiva células cancerosas da próstata e aumentou os efeitos antiproliferativos de anti-androgénios. A inibição da AKT com um inibidor farmacológico também induziu apoptose quando combinado com anti-androgénios, de acordo com recente evidência de PI3K e AR crosstalk via em células cancerosas da próstata. Recuperação de grampos visando uma via de cancro da próstata conhecido valida a utilidade de shRNA rastreio da biblioteca no câncer de próstata como uma estratégia ampla para identificar novos alvos de medicamentos candidato

Citation:. Dahlman KB, Parker JS, Shamu T, Hieronymus H, Chapinski C, Carver B, et al. (2012) moduladores de cancro da próstata proliferação e viabilidade celular Identificado por Short-Hairpin RNA Biblioteca de Triagem. PLoS ONE 7 (4): e34414. doi: 10.1371 /journal.pone.0034414

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de setembro de 2011; Aceito: 27 de fevereiro de 2012; Publicação: 11 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Dahlman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por AACR-Amgen, Inc. Fellowship em Clinical and Translational Research (KBD); Fundação do cancro da próstata (www.pcf.org) (BSC); Howard Hughes Medical Institute (www.hhmi.org) (CLS); Instituto Nacional do Câncer (www.cancer.gov) (CLS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. CLS é uma co-inventor da MDV3100 e possui ações de Medivation. KBD foi apoiada por AACR-Amgen, Inc., enquanto este trabalho estava sendo realizado. JSP é empregado por Análise de Expressão. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais. Os demais autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

O câncer de próstata é a segunda principal causa de morte por câncer em homens americanos com uma estimativa de 217,730 novos casos e mais de 32.000 mortes por a doença em 2010 [1]. Enquanto a maioria doença localizada em estágio inicial pode ser tratada com sucesso por terapia de radiação e /ou cirurgia, os homens que se apresentam com cancro metastático em estágio avançado têm uma sobrevida média de 3-7 anos [2]. Além disso, até 50% dos doentes tratados com doença localizada terão recorrência local ou metástases distantes [2].

tratamentos correntes para doença recorrente ou metastático incluem direccionamento do receptor de androgénio (AR), a sinalização através do uso de antiandrogénios , como bicalutamida, e as drogas que impedem a produção de andrógenos nos testículos e glândulas supra-renais, tais como agonistas do hormônio liberador de gonadotrofinas e cetoconazol [3]. Embora estas terapias hormonais atuais têm efeitos iniciais para reduzir a carga tumoral, muitos homens se tornam resistentes a essas terapias e desenvolver o câncer de próstata resistente à castração (CRPC). Homens com CPRC têm um mau prognóstico e conta para a maioria das mortes da doença.

homens com CPRC muitas vezes apresentam um aumento no receptor tumor andrógeno (AR) níveis [4]. Ar é um receptor de 110 kDa de hormona nuclear que, em resposta a androgénios, activa a transcrição de genes alvo envolvidos na proliferação celular, diferenciação e sobrevivência. No epitélio luminal da próstata, AR regula a diferenciação e a proliferação, e AR nas células cancerosas da próstata promove a progressão do ciclo celular [5]. trabalho anterior no nosso laboratório indica que este aumento do nível de AR é necessária e suficiente para a progressão do cancro da próstata a CRPC e a sua função é essencial para sustentar o crescimento do tumor [6]. Além CRPC,

AR

é expresso em quase todos os tumores da próstata e é necessária para a manutenção do tumor [4], [7], [8]. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a sinalização de AR desempenha um papel crítico na hormona-sensível e CRPC e continua a ser um objectivo importante para a terapêutica do cancro da próstata.

Identificação de novas abordagens para o tratamento do cancro da próstata é uma área de desenvolvimento terapêutico intensa . Recentemente acetato de abiraterona foi aprovado com base em um benefício significativo de sobrevivência em pacientes com CRPC, e os novos anti-androgénios, MDV3100 e ARN-509, foram introduzidos com resultados promissores; no entanto a maioria dos tumores adquirido resistência a esses agentes terapêuticos [9] – [13]. Até à data, entre os agentes quimioterapêuticos apenas o docetaxel e taxanos cabazitaxel foram mostrados para melhorar a sobrevivência global em pacientes com CRPC [14] – [16]. Como resultado da falta de agentes que sustentam a regressão do câncer de próstata, câncer de próstata novos alvos terapêuticos justificar uma investigação mais aprofundada.

Para descobrir potenciais alvos terapêuticos de câncer de próstata, foi realizada uma tela shRNA multiplex imparcial que identificou moduladores de câncer de próstata a viabilidade celular na presença de bicalutamida. Quatro genes foram validados para amplificar os efeitos antiproliferativos de anti-androgénios em uma linha de células de cancro de próstata quando silenciado. Estes dados fornecem uma estratégia geral para identificar alvos de drogas câncer de próstata.

Resultados

shRNA tela multiplex para identificar moduladores de sensibilidade bicalutamida

A fim de identificar os genes que, quando silenciada , reduzir a viabilidade celular por si só ou em combinação com o anti-androgénio, bicalutamida, utilizou-se uma tela de shRNA baseado no RNA de interferência em multiplex utilizando uma biblioteca validado anteriormente (Figura 1A). Esta tecnologia emprega exclusivamente com código de barras shRNAs, expresso a partir de um vector retroviral, cuja abundância depois de manipulação de células podem ser identificados por microarranjo [17]. A biblioteca era composta por ~6,000 shRNAs segmentação quinases, genes envolvidos na regulação do ciclo celular, e outros genes conhecidos por estarem envolvidos no cancro [17]. Análise de dados de expressão a partir de 147 amostras de tumor de próstata [18] mostrou que 97% dos genes alvo por shRNAs na biblioteca são detectadas em, pelo menos, 50% dos tumores. Utilizámos a linhagem celular LNCaP do receptor de androgénio -positivo (AR) para o ecrã, porque eles sofrem uma paragem do crescimento quando tratados com o antagonista de AR bicalutamida, crescem de forma relativamente rápida, e são facilmente infectadas com retrovírus (Figura S1). células cancerosas AR-negativos PC3 próstata humana serviram como controle negativo da sensibilidade anti-andrógeno (Figura S1). Correlação entre experiências duplicadas biológicos em cada linha celular foi alta e não se alterou em momentos posteriores ou com o tratamento bicalutamida (Tabela S1).

(A) Esquema da tela shRNA. Detalhes podem ser encontrados na secção Materiais e Métodos. (B) Um mapa de calor foi gerado por grupos, com base em sondas que foram perdidos ou enriquecidos (log2 bicalutamida /veículo ≤ +/- 0,58 e um p-value≤0.01) na bicalutamida (0,4 uM e 1,0 uM) tenha sido tratada com células LNCaP em t = 1 e t = 2 em comparação com as células tratadas com o veículo com as mesmas marcas de tempo. O gene alvo shRNA associada com cada uma das sondas está indicado à direita do mapa de calor. Os genes alvo que aparecem mais do que uma vez na heatmap indicam que mais do que uma sonda marcado para aquele gene.

Microarray análises revelaram que 23 sondas, associados com 15 genes, foram esgotados exclusivamente no-tratados bicalutamida As células LNCaP, quando comparada com células tratadas com veículo (log2 bicalutamida /veículo ≤-0,58, p≤0.01) (Figura 1B, Tabela 1, e a Figura S2). Não foram observadas diferenças nas sondas esgotados através doses bicalutamida altas e baixas ou início e timepoints final (dia 8 ou 21 dias); Por conseguinte, os dados foram combinados para as análises. Dos 15 genes identificados, 11 eram quinases (

TTK

,

MAST3

,

CIT

,

PRKACG

,

IGF1R

,

TSSK2

,

VEGFβ

,

MAPKAPK5

,

ABL2

,

PLK2

, e

AKT1

) conhecido ter funções na regulação do ciclo celular ou a viabilidade celular (Tabela 1). Esta alta freqüência de recuperação de visitas de quinase podem ser relevantes para a biologia das células de câncer de próstata, mas também provavelmente reflete um viés na seleção de genes para a biblioteca shRNA. Os 4 hits de genes restantes têm funções diferentes: ligação de calmodulina (

STRN3

), activação de GTPase (

RABGAP1

), adaptadores quinase (

STRADA

), ou envolvidos com o proteassoma (

PSMC1

). Uma tela paralela também foi realizada na linha celular independente de androgénios, PC3, e, nomeadamente, nenhuma das sondas empobrecido em células LNCaP foram empobrecido em células PC3, na presença de bicalutamida usando o mesmo de corte, proporcionando evidência para a especificidade em células sensíveis Antiandrogen (Tabela S2).

Validação de genes candidatos

Para examinar ainda mais esses 15 genes candidatos, empregamos a tecnologia knockdown independente (siRNA transfecção utilizando siRNAs segmentação sequências distintas das utilizado na tela de shRNA) numa segunda linha de células dependentes de AR (VCaP), que tem sido mostrado para ser resistente a bicalutamida, mas sensível à segunda geração de anti-androgénio MDV3100 [19]. O silenciamento dos genes foi confirmada por qRT-PCR (Figura 2B). Como um controlo positivo, as células foram transfectadas com VCaP AR siRNAs e, como esperado, o silenciamento de AR reduzidos a viabilidade celular (Figura 2A). Silenciamento de

AKT1

,

STRADA

,

PSMC1

, e painel de

TTK

aumentou o efeito inibidor do crescimento de MDV3100 em células VCaP (Figura 2A, esquerda ), consistente com os efeitos observados com bicalutamida na tela original em células LNCaP. Curiosamente, silenciando

AKT1

e

PSMC1

em células VCaP também diminuiu a viabilidade celular na ausência de anti-andrógeno (Figura 2A, painel esquerdo).

genes alvo Candidato a partir da tela LNCaP as sondas que foram perdidos na presença de bicalutamida foram selectivamente alvo utilizando siARN. (A, painel esquerdo), as células foram transfectadas com VCaP siRNAs que marcados na tela de LNCaP e de drogas foram incubadas com 1 uM MDV3100 ou veículo, e o número de células viáveis ​​foi medida 6 dias pós-tratamento. (A, painel da direita), foram transfectadas células VCaP e tratou-se como em (A, painel esquerdo), excepto Caspase 3/7 actividade foi medida depois de 3 dias de tratamento.

PLK1

siARN transfecção foi usada como um controlo positivo. As linhas tracejadas indicam o nível de inibição do crescimento ou a apoptose induzida por MDV3100, para comparação. NT, não-alvo siRNA. (B) silenciamento do gene (10-50%) foi confirmada por RT-qPCR 6 dias pós-transfecção de células com o siRNA VCaP SMARTpools. As reacções foram realizadas em triplicado e normalizadas para RPL27 para cada ADNc e em seguida normalizada para NT tratado com veículo. foi calculado o erro padrão da média. Bic, bicalutamida.

Em seguida, examinaram o efeito de silenciar

AKT1

,

STRADA

,

PSMC1

, e

TTK

em apoptose, utilizando

PLK1

siRNAs como um controlo positivo. Silenciamento de

AR

,

AKT

, e

STRADA

em combinação com o tratamento MDV3100 induzida apoptose celular VCaP sobre siRNAs controle (NT) tratados com MDV3100 Figura 2A, painel (direita ). Com a excepção de AR, nenhum dos siRNAs testados induziu a apoptose na ausência de MDV3100 (Figura 2A, painel da direita). Embora o silenciamento de

TTK

em combinação com MDV3100 não induziu a apoptose nas células com NT MDV3100, a combinação se reduzir o número de células viáveis ​​mais do que MDV3100 sozinho nas células NT (Figura 2A, painel da esquerda). Tomados em conjunto,

AKT

,

STRADA

, e

TTK

siRNAs sinergia com MDV3100 para reduzir a viabilidade celular VCaP. Considerando

AKT1

e

STRADA

silenciamento reduz a viabilidade celular, pelo menos parcialmente, devido ao aumento da apoptose quando combinado com MDV3100,

TTK

parece funcionar através de um mecanismo inibidor do crescimento alternativa . Embora

PSMC1

não marcou nas células PC3 na shRNA tela da biblioteca inicial, siRNA knockdown de

PSMC1

viabilidade prejudicada de células PC3, levantando a possibilidade de que estes efeitos antiproliferativos podem não ser específico para células cancerosas da próstata AR-positivas (Figura S3). Por esta razão, nós não prosseguir a caracterização de

PSMC1

.

superexpressão do

TTK

está associada com aumento da probabilidade de recorrência bioquímica

Para explorar se

AKT1

,

STRADA

, e

TTK

são alteradas no câncer de próstata humano, avaliou-se o número de cópias e expressão status desses genes em uma próstata humana previamente relatado dataset câncer [18]. Dos tumores de próstata 218, 34,4% tinham reduzido expressão de

STRADA

, 18,3% apresentaram superexpressão de

expressão TTK

, 11,7% quer overexpressed ou tinha reduzido de

AKT1

, e 15,6% dos tumores sobre-expressos ou tinham amplificado

AR

(Tabela 2). A sobre-expressão foi definido como Z-score≥2 e expressão reduzida foi definida como índice z 2, comparado com a expressão em amostras de próstata normais. Ao contrário de

AR

,

STRADA

,

TTK

, e

AKT1

mostrou pouca evidência de amplificação do gene ou perda de tumores de próstata humanos. O grande número de tumores de próstata com alterações no

STRADA

,

TTK

, e

AKT1

expressão levou-nos a olhar para a sua correlação com recorrência bioquímica. Curiosamente, a sobre-expressão de

TTK

exibiram uma associação significativa com recorrência bioquímica (p = 0,003) (Figura 3). expressão TTK não se correlacionou significativamente com as seguintes características clínicas:. margem cirúrgica, estado linfonodal, vesícula seminal, pontuação de Gleason, antígeno específico da próstata tratamento (PSA), PSA, ou uma extensão extracapsular (Tabela S3) significa

Kaplan Meier do risco de recorrência bioquímica em pacientes (n = 131) com superexpressam TTK tumores de próstata (n = 20; linha verde) versus aqueles sem TTK superexpressão (n = 111; linha azul) tumores (p = 0,003, log- rank).

bloqueio AKT coopera com bicalutamida para induzir a apoptose de células LNCaP

para investigar ainda mais o papel potencial desses genes como alvos terapêuticos no câncer de próstata, nos viramos para inibidores farmacológicos. Foi avaliado o número de células viáveis ​​utilizando um LNCaP inibidor AKT1 /2 na presença e ausência de bicalutamida. O tratamento com bicalutamida ou o inibidor de AKT reduziu o número de células viáveis ​​em 10% e 45%, respectivamente (Figura 4A). Em contraste, a combinação dos compostos reduziu a proliferação celular por 100% e induziu apoptose, como demonstrado por um aumento da clivagem de PARP (Figura 4B). Estes dados sugerem que a AKT pode ser um alvo terapêutico para o cancro da próstata em combinação com a terapia anti-androgénio, consistente com a evidência recente utilizando inibidores de PI3K [20].

(a) número de células viáveis ​​LNCaP tratadas durante 5 dias com veículo , bicalutamida (1 uM), Akt1 /2 inibidor (1 uM), ou uma combinação de bicalutamida e um inibidor de AKT. (B) A apoptose foi medida em células LNCaP por imunotransferência, utilizando um anticorpo de PARP em células LNCaP tratadas como em (A). A inibição da Akt fosforilada (pAkt (Ser473)) e fosforilado S6 (PS6) também foi medida. Actina foi usado como um controle de carga.

Discussão

As terapias atuais para o câncer de próstata incluem antiandrogénios tais como bicalutamida e MDV3100. Embora praticamente todos os doentes têm de resposta a estas drogas, muitos tumores tornam-se resistentes a estas terapias, resultando em CRPC. Devido ao importante papel que a AR desempenha no câncer de próstata primário e CRPC, AR continua a ser um alvo terapêutico relevante. Identificação de novas abordagens para o tratamento do cancro da próstata, incluindo o desenvolvimento de terapias de combinação com anti-androgénios, é uma área de desenvolvimento terapêutico. Portanto, nós executamos uma tela shRNA multiplex imparcial para identificar moduladores da viabilidade das células de câncer de próstata. Nosso objetivo foi identificar genes que possam ser exploradas para a novela terapia-alvo.

Na tela shRNA e

in vitro

siRNA experimentos de validação em uma linha de células independentes, foram identificados e validados

AKT1

,

STRADA

, e

TTK

como genes candidatos que sinergia com antiandrogénios (Figura 1 e Figura 2). Embora

AKT1

,

STRADA

, e

TTK

teve como inibidores da proliferação de células LNCaP no contexto de bicalutamida, a validação com siRNAs na mesma linha celular revelou que eles possam diminuir a viabilidade celular na ausência de bicalutamida (Figura S4A). Este efeito era específico para LNCaP e não foi observado em células PC3 AR-negativo. Uma explicação para esta diferença no fenótipo é a força de shRNA knockdown no ecrã versus o siARN nas experiências de validação, uma vez que os siRNAs geralmente uma maior do que o knockdown shRNAs numa MOI≤0.5. Na verdade, os siRNAs fez exibem um alto nível de silenciamento de genes nos experimentos de validação (Figura S4B).

Ela será de interesse para entender o mecanismo pelo qual a inibição da

AKT1

,

STRADA

ou

TTK

melhora a actividade anti-andrógeno. Uma possibilidade é através da regulação da transcrição dependente de AR, mas não conseguimos observar uma diminuição nos níveis de mRNA de

AR

ou genes (AR-alvo

TMPRSS2

,

FKBP5

,

NKX3.1

, ou

KLK3

) quando estes genes foram silenciados em células LNCaP (dados não mostrados). Outra possibilidade é a interrupção da sinalização crosstalk caminho, como ilustrado por evidências recentes de feedback negativo recíproca como uma explicação para a sinergia observada com inibição da via PI3K /AR combinado [20].

TTK, também conhecido como eixo monopolar 1 (MPS1), é uma cinase de serina /treonina e tirosina que tem sido implicado na manutenção do ponto de verificação montagem do fuso e é necessário para a segregação adequada cromossoma durante a mitose [21], [22]. TTK é de particular interesse uma vez que outros autores relataram que a redução dos níveis de

TTK

células tumorais humanas sensibilizadas a doses sub-letais de taxol, enquanto que as células não tumorigénica não poderia ser sensibilizadas ao taxol [23]. Aqui descobrimos que esse silenciamento

TTK

resultou na sensibilização de células VCaP a um antiandrogénio potente. O facto de 18% dos tumores da próstata humanos sobre-expressam TTK e que estes tumores têm um resultado clínico diferente sugere que os inibidores TTK em combinação com anti-androgénios podem ser de interesse.

relacionadas com o adaptador STE20 alfa quinase, ou STRADA, é um pseudokinase que é referido como sendo necessário para a actividade adequada do supressor de tumor, quinase hepática B1 (LKB1) [24].

STRADA

é necessário para a função do supressor de tumor LKB1; portanto, silenciamento de

STRADA

poderia ser esperado para promover a tumorigênese. Nossa descoberta de que

STRADA

expressão reduzida exibido em uma grande porcentagem dos cancros da próstata humanos é consistente com um papel supressor de tumor (Tabela 2). No entanto, é possível que STRADA tem funções independentes de sinalização LKB1 /AMPK que promovem a inibição do crescimento celular em certos contextos. O papel potencial da STRADA na progressão do cancro da próstata e a possibilidade de funções LKB1 /independente de AMPK indicar uma atenção adicional.

Akt1 é uma quinase serina-treonina que retransmite sinais de fosfatidilinositol 3 ‘quinase (PI3K) pela sua fosforilação de alvos a jusante e a desregulação desta via é conhecida por contribuir para a progressão do cancro da próstata [25], [26]. É bem conhecido que a via PI3K /Akt desempenha um papel importante na viabilidade de células de cancro da próstata e tumorigénese e está a ser actualmente a ser investigada como um alvo terapêutico [27], [28]. Relatórios anteriores demonstraram que a Akt /PI3K regula o crescimento celular de LNCaP e que a expressão de AKT constitutivamente activa pode bloquear a inibição do crescimento induzida por bicalutamida [27], [29], [30]. Além disso, foi demonstrado Akt1 para interagir com AR [31]. A perda da função da fosfatase e tensina homólogo (PTEN), um regulador negativo da via PI3K /AKT, ocorre em pelo menos 50% de cancro avançado da próstata humana [32] – [34]. Esta perda de PTEN em função do aumento da expressão de Akt fosforilada e subsequente activação de alvos a jusante implicados na sobrevivência e proliferação das células [35], [36]. A inibição de AKT utilizando ARNsi ou um inibidor da apoptose induzida farmacológica em combinação com bicalutamida ou MDV3100 em células de cancro da próstata dependentes de AR (Figura 2A, painel da direita e Figura 4). Como resultado dos papéis relatados de Akt1 em tumorigênese do câncer de próstata, a via PI3K /AKT está sendo examinado de perto como um alvo terapêutico [25]. Os nossos dados suportam o uso de inibidores da Akt em combinação com anti-androgénios para tratar câncer de próstata.

Materiais e Métodos

cultura de células e antiandrogénios

linhas de células de carcinoma da próstata humana (LNCaP, PC3, e VCaP) e células embrionárias de rim humano (293T) foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e foram mantidas abaixo de 20 passagens em laboratório. As células foram cultivadas de acordo com as directrizes da ATCC. Nenhuma anormalidade foi observada no crescimento ou morfologia para qualquer linha celular sob suas respectivas condições de crescimento. Bicalutamide foi adquirida da AstraZeneca Pharmaceuticals LP (Wilmington, DE) e MDV3100 foi sintetizado no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center pela Facilidade Síntese Orgânica núcleo [19].

Preparação de RNA DNA biblioteca curto hairpin e vírus

a biblioteca de plasmídeo (PLMP) expressando ~6,000 RNAs curtos-hairpin (shRNA) quinases segmentação, genes envolvidos na regulação do ciclo celular, e outros genes conhecidos por serem envolvidos no câncer foi utilizado no ecrã actual [17]. O plasmídeo da biblioteca reunida foi amplificado em células electrocompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o ADN plasmídico foi isolado a partir de pelo menos 1.000 transformantes por hairpin. O vírus foi produzido em células 293FT por co-transfecção do vector de expressão pUMVC3-gag-pol (Addgene, Cambridge, MA), VSVG envelope pantrópica (Addgene), e o ADN da biblioteca de shRNA isolado acima.

tela interferência shRNA

A tela de interferência shRNA é mostrada na Figura 1A. células LNCaP e PC3 foram infectadas com o vírus 6K shRNA reunidas biblioteca (MOI≤0.5) em triplicado para gerar um total de 6 milhões de células infectadas por repetição, por linha celular. A infecção de células alvo pelo MOI≤0.5 foi confirmada por microscopia de fluorescência e de células activadas por fluorescência (FACS) 48 h após a infecção. células LNCaP e PC3 foram seleccionados com 3 ug /ml de puromicina, e as células foram contadas e plaqueadas em meio de crescimento contendo 0,4 uM bicalutamida, 1,0 uM de bicalutamida, ou veículo (DMSO). As células foram passadas, e bicalutamida e do veículo reabastecido, a cada 4 dias, sem permitir que a confluência. LNCaP e PC3 a partir de células de cada replicado foram colhidas e os sedimentos celulares foram rapidamente congelados e armazenados a -80 ° C a vários pontos temporais durante a tela. As células foram colhidas 48 h após a infecção (t = 0) e após 8 dias (T = 1) e 21 dias (T = 2) da exposição ao veículo ou bicalutamida.

Microarray

O ADN genómico foi extraído de células utilizando condições padrão. Os códigos de barras e meias-gancho de cabelo a partir do DNA de plasmídeo da biblioteca (usado originalmente para tornar o vírus) e LNCaP e PC3 ADN genómico de células isoladas acima, foram amplificados por PCR usando os seguintes iniciadores: 5′-TAGTGAAGCCACAGATGTA-3 ‘e 5′-AAAGCGCATGCTCCAGACTGCC-3’ . Os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese em gel e as bandas resultantes de 350 pb foram purificados em gel utilizando o kit de extracção de gel QIAEX II (Qiagen, Valencia, CA) fragmentos de ADN .Purified (1,5 ug) de células LNCaP ou PC3 foram marcados e a hibridação foi microarray realizada utilizando chips de mercadorias Agilent como previamente descrito [17].

Microarray análise de dados

Affymetrix exão dados de matriz de 147 amostras de tumor [18] foram usadas para determinar os níveis de expressão de genes alvo shRNA representado no rastreio da biblioteca. Sondas com fundo ajustado intensidade normalizada superior a 50 foram considerados como detectado.

software Extractor Característica Agilent foi usado para digitalizar imagens de microarray. Extractor recurso intensidade Cy3 normalizado para cada matriz foi compilada e todo o processamento foi realizada utilizando o pacote de software estatístico R 2.8.1. A qualidade foi avaliada em todo usando análise de componentes principais e mais formalmente através da comparação da variação interquartil ao longo das matrizes. As amostras com um log2 transformado intervalo interquartil menos de 6 foram considerados valores discrepantes e não é considerado na análise posterior. Quando as amostras duplicadas (réplicas) permanecem técnicas, foi utilizada a repetição mais recente de cada um. As amostras restantes foram sujeitos a normalização quantil. As sondas correspondentes aos ganchos de cabelo que não estão presentes na biblioteca foram usados ​​como controlos negativos. A intensidade de sinal do percentil 95 dos controlos negativos foi utilizado como a medida de fundo e foi estimada a partir de pré-selecção (T = 0) amostras. As sondas foram removidos de análises posteriores quando não exceder a estimativa fundo específico da amostra em uma maioria de amostras de pré-selecção. O teste estatístico foi realizado para identificar grampos cuja abundância variou ao longo do tempo em amostras não tratadas. O curso de tempo de análise implementado no software de extracção de expressão diferencial de genes (EDGE) foi usado para esta análise [37]. Para identificar grampos onde a abundância foi associada com a presença de bicalutamida foram utilizados os modelos lineares para biblioteca de microarray em R 2.8.1 [38]. Especificamente, um modelo linear foi construída com termos de tratamento, ponto de tempo, e replicar. Este modelo foi caber a cada sonda, e dobre mudanças e p-valores correspondentes ao efeito do tratamento foram utilizados para identificar sondas de interesse. As duas doses bicalutamida (0,4 uM e 1,0 uM) e os dois momentos recolhidos pós-selecção (T = 1 e T = 2) foram combinados para a análise para aumentar o poder estatístico. diferenças significativas entre doses bicalutamida e timepoints não foram observados. Os candidatos que tiveram uma mudança abundância que foi associada com a presença de bicalutamida foram seleccionados que resultou num log2 bicalutamida /veículo ≤-0.58 e um p-value≤0.01. Visualização dos candidatos foi realizada com agrupamento hierárquico e heatmaps. Todos os dados microarray é Miame compatível. Todos os dados em bruto foi depositado no GEO (série ID GSE32261).

A viabilidade celular e apoptose ensaios

ON-TARGETplus não-alvo (NT) siRNA e siRNA SMARTpools segmentação

ABL2

,

AKT1

,

AR

,

CIT

,

IGF1R

,

MAPKAPK5

,

MAST3

,

PLK2

,

PRKACG

,

PSMC1

,

RABGAP1

,

STRADα (STRADA)

,

STRN3

,

TSSK2

,

TTK

, e

VEGFβ

foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific (Lafayette, CO). siRNAs segmentação

PLK1

foram usadas como controlo positivo para a apoptose e foram obtidos a partir da MSKCC Triagem Facilidade de alta taxa de transferência de droga. fase log LNCaP, PC3 e células VCaP foram transfectadas com 100 nM siRNA usando DharmaFECT (Thermo Fisher Scientific). A viabilidade celular foi determinada 3 e 6 dias após incubação com bicalutamida (1 uM), MDV3100 (1 uM), ou veículo utilizando o ensaio de viabilidade celular Titer-Glo Luminescent celular (Promega). A apoptose foi avaliada utilizando o ensaio da caspase-Glo 3/7 (Promega) e os valores foram normalizados para o ensaio celular Dia 3 Titer-Glo. Os ensaios foram realizados em triplicado e os erros padrão da média são relatados. Os ensaios de proliferação de células também foram realizados por incubação das células com veículo (DMSO), bicalutamida (1 uM), inibidor de AKT (1 uM) (Merck, Whitehouse Station, NJ), ou uma combinação de bicalutamida e inibidor de AKT e contando as células. Os experimentos foram realizados em triplicado e os desvios-padrão são relatados.

Immunoblotting

Os lisados ​​celulares para análises de Western blot foram preparadas utilizando tampão RIPA padrão. Os anticorpos utilizados para a análise de western blot e imunohistoquímica foram pAkt Ser473 (Cell Signaling Technology, 1:1000 diluição), Akt (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 1:1000 diluição), PS6 Ser235 /236 (Cell Signaling Technology, 1: 1000 diluição), PARP (Cell Signaling Technology, 1:1000 diluição), e actina (Cell Signaling Technology, 1:1000 diluição).

transcrição-PCR quantitativa reversa

LNCaP, PC3, e células sujeitas a VCaP siARN transfecção foram recolhidas 4 dias ou 7 dias após a transfecção para monitorar knockdown do gene (s) alvo por transcrição reversa quantitativa PCR (qRT-PCR) (ver Tabela S4). As reacções foram realizadas em triplicado e normalizadas para RPL27 para cada ADNc e em seguida normalizada para NT tratado com veículo. foi calculado o erro padrão da média.

A recorrência bioquímica

A expressão do gene e copiar status de número de

STRADA

,

TTK

,

AR

,

AKT1

,

SKT22B

,

PSMC1

, e

PRKACG

no câncer de próstata humano primário e metastático (n = 218) foi determinada usando o MSKCC Cancer Genomics Pathway Portal [18]. Vinte dos 131 tumores tinham

TTK

sobre-expressão definido como z-score≥2. Os casos foram classificados como

TTK

alta e

TTK

Normal /Baixa. A probabilidade de liberdade de recorrência bioquímica após prostatectomia radical (BCR definido como 0,2 ng antígeno específico da próstata ml e subindo /) foi relatada por meio de análise de Kaplan-Meier. P-valor foi calculado pelo teste de log-rank.

Informações de Apoio

Figura S1.

Bicalutamide inibiu a proliferação de células LNCaP. Após a infecção com a biblioteca de shRNA e LNCaP selecção puromicina (A) e células PC3 (B) foram contadas e plaqueadas em meio de crescimento contendo 0,4 uM bicalutamida, 1,0 uM de bicalutamida, ou de veículo (0 uM). As células foram contadas e passadas a cada 4 dias para monitorizar o crescimento em resposta ao veículo e bicalutamida. Os resultados são apresentados como o número médio de células viáveis ​​(painéis superiores) ou como a percentagem de células tratadas com bicalutamida viáveis ​​em comparação com células tratadas com veículo (painéis inferiores) em cada ponto de tempo durante o curso de tempo de 21 dias cada tratamento medicamentoso ± padrão de erro de 3 experiências duplicadas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034414.s001

(TIF)

Figura S2. sondas

shRNA empobrecido em células LNCaP. Boxplots da abundância relativa de sondas nas células LNCaP bicalutamide- (drogas) tratados veículo e. Dados a partir de t = 2 e t = 3 foram combinadas para o veículo ou tratados com boxplots bicalutamida. Ambas as doses de bicalutamida (0,4 uM e 1,0 UM) também foram combinadas para os boxplots drogas.