Abstract
Fundo
Para estabelecer, caracterizar e elucidar possíveis mecanismos de resistência a bleomicina adquirida (BLM), utilizando linhas celulares de cancro humano. Sete linhas celulares BLM-resistentes foram estabelecidas por exposição a concentrações crescentes de BLM durante um período de 16-24 meses. IC
50 valores e tempos de duplicação de células foram quantificados utilizando um ensaio de citotoxicidade em tempo real. Cometa e γ-H2AX ensaios, análise do ciclo celular e apoptose avaliação mais investigados os mecanismos de resistência BLM nestas linhas celulares.
Resultados
Em comparação com linhas celulares parentais, ensaios de citotoxicidade em tempo real revelaram 7 a 49 aumentos vezes na IC
50 e uma média de duplicação aumento do tempo de 147% (faixa de 64% -352 %) na sub-clones resistentes BLM (p 0,05 para ambos). Concentrações mais elevadas de manutenção BLM foram associados a uma maior IC
50 e tempos de duplicação aumentou (P 0,05). Significativamente reduzida danos no ADN (ensaios de cometa e γ-H2AX), G2 /M de detenção, e a apoptose (p 0,05 para cada conjunto de comparação) após altas doses de exposição BLM aguda foi observada em sub-clones resistentes, quando comparada com a sua BLM- contrapartes parentais sensíveis. Três semanas de cultura BLM-livre, resultou num retorno parcial para a sensibilidade em 3/7 BLM sub-clones resistentes BLM (p 0,05).
Conclusão
resistência bleomicina pode estar associado a danos reduzida DNA após a exposição bleomicina, resultando na redução da G2 /M detenção, e apoptose reduzida
Citation:. Wang Q, Cui K, Espin Garcia-S, Cheng D, X Qiu, Chen Z, et ai. (2013) Resistência à bleomicina em linhas celulares de cancro é caracterizado por prolongado tempo de duplicação, danos DNA reduzida e Evasão G2 M Detenção /e apoptose. PLoS ONE 8 (12): e82363. doi: 10.1371 /journal.pone.0082363
editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América
Recebido: 07 de julho de 2013; Aceito: 23 de outubro de 2013; Publicação: 04 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fundação Hospital Princess Margaret. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a bleomicina (BLM) é um antibiótico glicopeptídeo isolado do
Streptomyces verticillis
[1,2]. Como um agente quimioterapêutico, que é utilizado no tratamento de vários tumores, incluindo, mas não se limitando a carcinomas testiculares, linfomas e cancros da cabeça e pescoço [3,4]. Embora o caminho completo do mecanismo da droga de ação não foi elucidado, BLM se liga ao ferro e oxigênio para produzir espécies reactivas de oxigénio (ROS) [5] que induz quebras de DNA simples e dupla vertente, com o último sendo o principal responsável para os seus efeitos anti-tumorais [6,7]. Ele também provoca a peroxidação lipídica e danos no ADN mitocondrial [8]. parada estendido-ciclo celular /senescência, a apoptose e a morte das células mitóticas são as respostas celulares mais comuns para o tratamento de BLM [9].
BLM foi encontrada para induzir /M G2 paragem do ciclo celular em linhas celulares de cancro [10,11]. Isto pode ser explicado por um G2 /M checkpoint resposta a danos no ADN. A fase G2 /M do ponto de verificação é importante para a estabilidade genómica, pois assegura que os cromossomas estão intactos e prontos para a separação de células antes de entrar em mitose [12]. Ao contrário da barreira G1, genes barreira G2 /M não são frequentemente mutado em células cancerosas [13]. Resistência
para BLM é uma preocupação clínica, e normalmente ocorre durante a recidiva em tumores de células germinativas, onde BLM é mais comumente usado clinicamente. Embora o mecanismo de BLM-resistência é claro, várias possibilidades foram apresentadas, incluindo: (a) a ingestão de BLM alterado e efluxo [14,15]; (B) elevado nível de antioxidantes [5,11]; (C) capacidade de reparo avançado para o dano ao DNA induzido por BLM [14,16,17]; e (d) aumento do metabolismo (inativação) de BLM [17-19].
O desenvolvimento de resistência BLM serve como um importante mecanismo para a evasão de erradicação quimioterapêutico em células cancerosas. No entanto, os mecanismos responsáveis pela resistência adquirida BLM em células de tumores humanos não têm sido bem investigadas. No presente estudo, nós estabelecemos BLM-resistência em sete linhas de células de cancro humano, incluindo linhas de tipos de tumores estão a ser tratados com BLM e outros conhecidos para ser sensível ou resistente à BLM. Além disso, caracterizamos estas linhas celulares em relação ao seu nível de BLM-resistência, dano ao DNA induzido por BLM, tempo de duplicação, distribuição do ciclo celular, e o grau de apoptose (antes e após o tratamento BLM) para aumentar a nossa compreensão dos potenciais mecanismos de resistência.
Materiais e Métodos
células e cultura de células
Sete linhas humanos comercialmente disponíveis células de câncer com grandes diferenças de sensibilidade inata /resistência a BLM (HOP62, ACHN, NT2 /D1, SF-295, NCCIT, NCI-H322M e MBA-MB-231) foram escolhidos a partir National Cancer Institute (NCI) ou American Type Culture Collection (ATCC) [20]. Dois (NT2 /D1, NCCIT) eram linhas de células testiculares (Tabela 1).
linha celular
Abreviatura (Parental /resistente)
Derivado de que tipo de câncer
Parental IC
50 (ng /ml) *
ACHNACHN
célula 0Renal carcinoma0.009ACHN
0.25HOP-62HOP
0Lung adenocarcinoma0.11HOP
0.05SF-295SF
0CNS 0.14SF glioblastoma
0.4NT2 /D1NT2
célula 0Germ carcinomaN /ANT2
0.1NCCITNCCIT
0Germ carcinomaN células /ANCCIT
1.5NCI-H322MH322M
0Lung adenocarcinoma25.8H322M
2.5MDA-MB-231MB231
0Breast adenocarcinoma27.9MB231
3.0Table 1. Descrição das linhas celulares.
Nota: As linhas celulares com índice “0” indicam linhas parentais (controle) (por exemplo, HOP
0). Os sub-clones resistentes tem um subscrito identificando a sua concentração manutenção BLM, em ug /ml (por exemplo, lúpulo
0,05). * Os dados obtidos a partir de NCI-60 painel de triagem de drogas [20]. CSV Transferir CSV
NT2 /D1 foi mantida em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Outras linhas foram cultivadas em meio RPMI 1640. As condições foram de 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO
2. As células foram cultivadas como monocamadas em frascos de cultura de 75 cm
2 célula, a menos que indicado de outra forma. Todas as linhas celulares apresentaram resultados negativos para contaminação por micoplasma por métodos Polímero em cadeia (PCR) [21]. As linhas celulares foram autenticado utilizando Curto repetições em tandem (STR) testando [22]. linhas celulares
Criação de sub-clones resistentes à bleomicina a partir parental (controlo)
Para desenvolver BLM-resistência, as células foram continuamente expostas a aumentos graduais na concentração de BLM ao longo de um período de 16 a 24 meses. Resumidamente, as células foram semeadas a uma densidade de ~ 5 × 10
5 /ml num balão de cultura de células T75 com 10 ml de meio de crescimento completo. Após 4-6 horas de incubação, concentrações relativamente baixas de BLM (variando de 0,01 a 0,1 ug /ml dependendo da sensibilidade inata BLM-), dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca
2+ e Mg
2+, foram adicionados ao meio. As células foram deixadas em BLM durante 2 a 4 semanas, ou até que um re-população de células estável formado. reposição médio regular foi realizado ao longo deste período. A concentração BLM foi então aumentada em 0,5 a 2 vezes. Este aumento da dose gradual continuada durante 16 a 24 meses até que a concentração de BLM atingido, pelo menos, dez vezes a concentração de partida. Depois disso, todas as linhas de células resistentes à BLM ( “sub-clones resistentes BLM”) foram mantidas na sua concentração mais elevada conseguida BLM ( “dose de manutenção”). Ao mesmo tempo, a passagem regular de linhas celulares parentais foram realizados em paralelo com o processo de estabelecimento de BLM-resistência.
análise do tempo de teste de sensibilidade de BLM e dobrando
Antes da avaliação BLM resistência /sensibilidade (ensaio de citotoxicidade), um ensaio de proliferação celular foi realizada no sistema xCELLigence (Roche, EUA) para identificar as condições ideais em que o ensaio de citotoxicidade em tempo real deve estar em execução. Especificamente, o ensaio de proliferação foi realizada: a) identificar a densidade de sementeira óptima para o ensaio de citotoxicidade para cada uma das linhas de células; e b) para determinar a duração do ensaio de citotoxicidade.
O ensaio de proliferação foi realizada por inoculação de vários números de células numa placa de 96 poços (placa de 96-E, Roche, EUA) em quadruplicado, seguida de monitorização em tempo real de crescimento celular por até 7 dias . Vinte e quatro horas após a sementeira, metade dos poços na placa foram tratadas com BLM para determinar a resposta celular. O ensaio de proliferação foi repetida duas vezes em cada linha celular. densidades de semeadura ideal para cada linha foram selecionados com base em mudanças dramáticas na proliferação em 72-96 horas após o tratamento BLM e pequenas variações entre os poços em duplicado.
Para os ensaios de citotoxicidade, a contagem de células foi executada em primeiro lugar, e, em seguida, as células foram semeadas em poços em triplicado com 180μl de meio de cultura celular BLM-livre em uma placa de 96 poços. Vinte e quatro horas após o plaqueamento inicial, 20 ul de meio de cultura celular contendo BLM diluídos em série variando de 0 a 800 ug /ml foram adicionadas a cada poço. O número de células viáveis ao vivo foi monitorado a cada 15 minutos, durante um total de, pelo menos, 120 horas. IC
50 (software integrado, sistema de xCELLigence) e dobre as diferenças de IC
50 entre (controle) linhas de células resistentes à BLM e parentais (IC
resistente BLM 50 /IC
50 controlo) foram subsequentemente calculadas. O período de crescimento mais rápida observados para cada uma das linhas de células no ensaio de proliferação foi isolado por duplicação da determinação do tempo e a sua variação percentual foi calculado utilizando o software do sistema xCELLigence.
Comet avaliação do ensaio de induzida por BLM danos no DNA
BLM é conhecido por causar danos no DNA em células [6,7]. Para determinar iniciais quebras (linha de base) e ADN de cadeia após altas doses de BLM expõem, ensaios de cometa alcalino (electroforese em gel de célula única) foram realizadas [23] para cada um dos sub-clones parentais e resistentes. Momento da cauda Olive (OTM) valores de cem células foram marcados de forma aleatória por slide usando microscópio de fluorescência com 5,0 software KOMET (Kinetic imaginar).
induzida BLM formação de focos γ-H2AX
DNA quebras de cadeia dupla (LAP) desencadeia a formação celular da γ-H2AX focos (proteína H2AX fosforilada) [24]. Para confirmar a resposta a danos no ADN celular a BLM através do ensaio do cometa, a análise quantitativa da formação de focos γ-H2AX seguinte alta dose de exposição BLM foi realizada num subconjunto de quatro pares parentais /resistente (lúpulo, ACHN, NCCIT, e H322M) [25 ] usando fosfo-histona H2AX pSer139 Anticorpo monoclonal e Alexa Flour 488-conjugado anti-fosfo-H2AX (BioLegend, San Diego, CA, EUA). Um mínimo de 10000 eventos foram contadas no citómetro de fluxo para cada medição; a intensidade de γ-H2AX, que se correlaciona directamente com contagens de citometria, foi analisado utilizando o software celular Quest (BD, EUA).
distribuições ciclo celular análise de distribuição
ciclo celular de cada um dos pares de sete sub-clones parentais e resistentes foram testadas pré e pós 24 horas de alta dose de exposição BLM em dez vezes a concentração de manutenção dos resistentes ‘sub-clones. Em seguida, as células em suspensão de mono-dispersa foram fixadas com etanol, seguido por iodeto de propídio (PI) a coloração (PI, Sigma, EUA) e analisadas utilizando o citómetro de fluxo FACSCalibur (BD, EUA). Percentagens de células em repouso no G1, S e G2 /M foi determinada fase (software CellQuest, BD, EUA e software ModFit LT, Verity Software House). a distribuição do ciclo celular foi medido em cada par dos pais /resistente a BLM na linha de base e em diferentes pontos de tempo até 24 horas de tratamento BLM. As correlações entre a distribuição do ciclo celular, IC
50 valores, e a linha celular tempos de duplicação foram analisados.
anexina V Ensaio /PI para a apoptose induzida por BLM
Para determinar pré apoptose celular e pós-tratamento BLM, um subconjunto representativo de quatro pares de pais /resistentes (HOP, ACHN, NCCIT, e H322M) foi tratada com 24 horas de BLM altas doses. As células foram então coradas com anexina V-FITC e PI, e avaliadas quanto a apoptose por citometria de fluxo de acordo com o protocolo do fabricante (BD PharMingen, San Diego, CA, EUA). Ambos cedo (anexina V-positivo, PI-negativo) células tarde apoptóticos e (anexina V-positivo, PI-positivo) foram contadas como células em apoptose.
Análise Estatística
Para avaliar a significância tratamento ou a diferença, t-pareado ou t-testes desemparelhados (dependendo das especificações experimentais) foram realizadas com um nível de significância de dois lados de 0,05. suposições de normalidade foram avaliados através de testes de Shapiro-Wilks. Quando a suposição de normalidade não pôde ser realizada, emparelhado ou testes de soma classificação desemparelhados Wilcoxon foram realizadas em seu lugar. Para a avaliação ensaio Cometa entre sub-clones parentais e resistentes após o tratamento BLM em altas doses, p-valores foram calculados utilizando uma estatística t para variâncias não iguais, testando a hipótese nula de igualdade nos rácios de log. A regressão logística foi realizada para avaliar /diferenças de distribuição de base G2 M entre sub-clones parentais e resistentes. Para investigar se existe correlação entre diversas medidas (IC
50 de controlo, IC
50 mudanças após o tratamento BLM-dose elevada, tempo de duplicação, e a distribuição do ciclo celular), foram realizadas análises de regressão linear. Todas as análises foram realizadas utilizando o software SAS versão 9.2 ou SPSS versão 13.0.
Resultados
linhas de células resistentes à BLM mantidos em BLM exibido de forma estável maiores IC
50 valores e tempos prolongados de duplicação
Todos os sete sub-clones resistentes a BLM demonstraram maior IC
50 do que as suas contrapartes parentais (Figura 1). ensaios de citotoxicidade mostrou entre 7-49 aumentos vezes de IC
50 em sub-clones resistentes a BLM. Observou-se uma correlação positiva entre a concentração de manutenção BLM e IC
50 valores (p 0,001, R
2 = 0,58). Após a exposição BLM prolongado, as linhas celulares com maior sensibilidade parental para BLM (média de IC
50, 0,1 ug /ml) apresentaram um maior aumento da resistência (média de 48 vezes) em comparação com linhagens parentais que eram menos sensíveis (média de IC
50, 9μg /mL, de 15 vezes; p 0,05 comparando sensível parental para linhas menos sensíveis).
Modelos de regressão linear determinou que os maiores valores de IC
50 foram associados com menores valores de mudança vezes (logaritmo inclinação escala de: -0,11 (desvio padrão: 0,02), P 0,0001, R
2 = 0,58). Cada CI
50 valor é a média de experiências realizadas em triplicado.
Observou-se que a sub-clones resistentes-BLM cresceu mais lentamente do que as suas linhas de células parentais. Duas linhas de células, quando mantidos em concentrações mais elevadas de BLM, como MB231
3.0 e H322M
2.5 (subscritos denotam concentração BLM manutenção), também exibiu alargada e achatada morfologia celular semelhante a de senescência celular em comparação com suas linhagens parentais , mas só depois de muitas gerações. Em contraste, a exposição aguda a doses elevadas de BLM não resultou em alterações morfológicas. O crescimento celular foi confirmada por mais lento tempo de duplicação celular calculado com o sistema xCELLigence. Todos os sub-clones resistentes BLM exibida estatisticamente significativo prolongamento do tempo de duplicação com um significativo aumento de duplicação do tempo de 147% (intervalo: 64% -352%), quando comparados com as suas linhas celulares parentais (Figura 2, P 0,05). Não houve correlação entre o tempo de duplicação celular e IC
50 valores, e nenhum entre o aumento percentual no tempo de duplicação e dobre aumento no IC
50.
A média de tempo de duplicação médio ± erro padrão da média (SEM, n = 3) foi relatada. O tempo de duplicação médio (medido em horas) das linhas parentais foi menor do que a do sub-clones resistentes BLM em todas as sete linhas celulares. * P 0,05 comparado com parental.
Para testar a estabilidade da resistência BLM em BLM-resistentes sub-clones, comparações em IC
50 valores e tempos de duplicação foram feitas entre sub-clones resistentes a BLM normalmente mantida e o mesmo resistente sub-clones que foram subsequentemente cultivadas em meio isento de BLM durante três semanas. Depois de três semanas de BLM-livre de cultura, três dos sub-clones resistentes originalmente (incluindo linhas de células testiculares NT2
0,1, NCCIT
1,5 e HOP linha celular de cancro do pulmão
0,05) exibiram um CI significativa
50 redução (Figura 3) e a redução do tempo de duplicação (Figura 4), quando comparado com a manutenção periódica sub-clones resistentes-BLM. Não houve alterações estatisticamente significativas na IC
50 e tempo de duplicação nas quatro linhas restantes.
As experiências foram realizadas em triplicado. Log IC foram realizadas
50 comparações. Três (HOP
0,05, NT2
0,1, e NCCIT
1,5) das sete linhas celulares tiveram reduções significativas no IC
50 valores após três semanas de manutenção BLM-free. * P 0,05 para comparações entre os sub-clones resistentes BLM e os seus homólogos correspondentes com três semanas de intervalo tratamento.
O experimento foi realizado em triplicado. Três (HOP
0,05, NT2
0,1, NCCIT
1,5) das linhas resistentes a BLM sete células apresentaram diminuição significativa no tempo de duplicação após três semanas de tratamento BLM-free. * P . 0,05 em relação ao após BLM remoção para linhas de células 3 semanas
resistência BLM pode ser dependente da dose
Tendo em conta que existe uma correlação geral entre IC
50 valores e as concentrações BLM manutenção por 7 linhas de células (Figura 1), a possibilidade de resistência BLM dependente da dose foi testada. Para a linha de célula única ACHN, IC
50 valores foram obtidos a partir de ACHN
0 (linha parental), e os seus dois sub-clones resistentes, ACHN
0,1 e ACHN
0,25. Uma correlação positiva foi encontrada entre as concentrações de manutenção BLM (0, 0,1 e 0.25μg /ml) e seus IC
50 valores (0,01, 0,29, e 0.74μg /ml, respectivamente, p 0,05). Além disso, também foi observada uma correlação positiva entre as concentrações de manutenção BLM e tempos de duplicação (0μg /ml-12hrs, 0,1 ug /ml-16.5hrs, 0.25μg /ml-23.5hrs, P 0,05). Este achado não foi testado ou confirmada em nenhuma das outras linhas celulares.
sub-clones BLM-resistant tinha menos BLM-induzida danos no DNA em ensaios Comet
A quantificação de danos no DNA em todos os sete pares parentais /resistentes utilizando o ensaio de cometa (medido em OTM) mostrou que antes do tratamento BLM, seis das sete linhas de células resistentes apresentaram maiores danos no ADN basal em comparação com o controlo (a excepção foi HOP
0,05, p 0,05). Isto geralmente correlacionada com o tempo de duplicação das células basais prolongada observada nestes sub-clones resistentes. Seguindo alta dose de tratamento BLM, cinco das sete sub-clones resistentes (SF
0,4, HOP
0,1, NT2
0,1, NCCIT
1,5, e H322M
2,5) tiveram danos no DNA menor do que suas linhagens parentais. Nenhum aumento de danos no ADN após a exposição BLM foi observada em cinco de sete linhas resistentes (SF
0,4, NT2
0,1, NCCIT
1,5, H322M
2,5, e MB231
3,0). Em contraste, todas as linhas celulares parentais tinham maior BLM pós-dano no DNA de pré-BLM (p 0,05 para cada comparação, a Figura 5). Além disso, todas as sete linhas parentais exibido significativamente maior de ADN aumento danos pós-tratamento BLM quando comparados com os seus homólogos resistentes (p 0,05).
As experiências foram feitas em triplicado. As células foram sujeitas a alta dose de exposição BLM (correspondente a dez vezes as suas respectivas concentrações de manutenção) durante 24 horas. OTM foi utilizado para a fragmentação de ADN (dano) de quantificação, e foi calculado como: = OTM (Tail.mean – Head.mean) x (% de ADN da cauda) /100. ensaio do cometa revelou maior aumento da fragmentação do ADN (expressa em níveis OTM) após o tratamento BLM em todas as linhas parentais * P . 0,05 para comparação entre as linhas de células antes e após o tratamento BLM dose elevada. Todas as linhas parentais apresentaram aumento significativo de danos ao DNA. # P 0,05 para comparação entre as linhas celulares parentais resistentes e na linha de base (pré-tratamento). Todas as linhas resistentes a BLM, exceto para HOP
0,05 exibiu aumento de danos ao DNA no início do estudo em comparação com suas linhagens parentais. P 0,05 para comparação entre as linhas de células resistentes e a linha celular parental tratamento pós BLM. Menos danos no DNA (em comparação com as suas linhagens parentais) pós-tratamento BLM foi encontrada em cinco das sete linhas de células resistentes a BLM (SF
0,4, HOP
0,1, NT2
0,1, NCCIT
1,5, e H322M
2,5).
sub-clones resistentes a BLM tinha reduzido os níveis de γ-H2AX em comparação com suas linhagens parentais após o tratamento BLM dose elevada
Como uma segunda medida da resposta celular ao dano ao DNA, γ- H2AX também foi avaliada num subgrupo de quatro linhas de células (lúpulo, ACHN, NCCIT e H322M). Após 24 horas de tratamento BLM dose elevada, as intensidades γ-H2AX aumentou em todas as linhas celulares parentais. Nos sub-clones resistentes, o aumento da γ-H2AX intensidades foram observados somente em duas das quatro linhas (ACHN
0,25 e HOP
0,05, Figura 6). Isto está de acordo com os ensaios de cometa. Três (lúpulo
0,05, NCCIT
1,5, e H322M
2,5) das quatro sub-clones resistentes exibiram significativamente menos alteração na intensidade γ-H2AX (γ-H2AX intensidade de pós-tratamento menos pré-tratamento) em comparação com os seus parentais sub-clones de pós-tratamento BLM (p 0,05). Esta tendência foi marginalmente significante na quarta linha (H322M
2,5, p = 0,054).
As experiências foram realizadas em triplicado. As células foram sujeitas a alta dose de exposição BLM (correspondente a dez vezes as suas respectivas concentrações de manutenção) durante 24 horas. Fluxo de detecção por citometria de formação de focos γ-H2AX induzida BLM foram obtidas em um subconjunto de quatro linhas celulares (ACHN, lúpulo, NCCIT e H322M). * P 0,05 para comparação entre as linhas de células antes e após o tratamento BLM dose elevada. Todas as linhas parentais apresentaram aumento significativo na formação de γ-H2AX. # P 0,05 para comparação entre as linhas celulares parentais resistentes e na linha de base (pré-tratamento). Uma das quatro linhas de células resistentes a BLM (NCCIT
1,5) apresentaram maior formação de γ-H2AX que o seu homólogo dos pais no início do estudo. P 0,05 para comparação entre as linhas de células resistentes e parentais após o tratamento BLM. Duas das quatro linhas de células resistentes a BLM (HOP
0,1 e NCCIT1.
5.) Revelou significativamente menor formação de γ-H2AX que os seus homólogos dos pais após o tratamento BLM, com uma terceira linha (H322M
2,5), sendo significativa limítrofe (p = 0,054).
linhas de células resistentes a BLM tinha uma menor percentagem de G2 M prisão /seguindo alta dose de exposição BLM
Desde a parada do ciclo celular em G2 /M fase era uma resposta celular característica geral para exposição BLM, foi avaliada a capacidade da sub-clones BLM-resistente para suprimir G2 induzida por BLM /M prisão. Como mostrado na Figura 7, três das sete sub-clones resistentes-BLM (lúpulo
0,05, NCCIT
1,5, e H322M
2,5) exibiram uma maior distribuição de fase G2 /M no início do estudo, em comparação com as suas linhas parentais (p 0,05). Do mesmo modo, para as outras quatro linhas de células, os sub-clones resistentes também exibiu uma maior distribuição de fase G2 /M a linha de base, embora não significativamente. Depois de 24 horas de doses elevadas de exposição BLM, cinco (SF
0,4, NT2
0,1, NCCIT
1,5, H322M
2,5, e MB231
3,0) de sete sub-clones resistentes-BLM exibiram uma distribuição inferior G2 /M do que as suas linhas parentais correspondentes (p 0,05). Comparando a distribuição% G2 /M, antes e depois de 24 horas de tratamento BLM dose elevada, todas as linhas celulares parentais exibiram aumentos na distribuição G2 /M a seguir a tratamento (p 0,05) .A mesma tendência foi observada em todos os sub-clones resistentes, embora dois (NT2
0,1 e MB231
3,0) não foi significativo. A extensão da% G2 /aumento de distribuição M (calculado como% de G2 /M
pós-tratamento menos% G2 /M
pré-tratamento) foi menor para todos os sub-clones resistentes do que as suas linhagens parentais correspondentes (p 0,05).
alta dose de tratamento BLM corresponde a dez vezes a concentração de manutenção correspondente para cada linha celular. Média ± SEM (n = 3) Os valores são reportados. * P 0,05 para a comparação entre as linhas de células antes e após o tratamento BLM dose elevada. Todas as linhas parentais exibiram aumentos significativos na distribuição do ciclo celular G2 /M. # P 0,05 para comparação entre as linhas celulares parentais resistentes e na linha de base (pré-tratamento). Três das sete linhas de células resistentes a BLM (HOP
0,05, NCCIT
1,5, e H322M
2,5) apresentaram aumento% G2 distribuição /M no início do estudo em comparação com suas linhas celulares parentais. P 0,05 para a comparação da% de G2 /M de distribuição entre linhas celulares parentais resistentes e após o tratamento BLM. Menos% G2 distribuição /M de linhagens parentais foi encontrada em cinco das sete linhas de células resistentes a BLM (SF
0,4, NT2
0,1, NCCIT
1,5, H322M
2,5, e MB231
3.0) após o tratamento BLM.
G2 /M detenção torna-se proeminente depois de 8 horas de tratamento BLM dose elevada
Para avaliar o tempo de G2 /M prisão após alta dose de exposição BLM, quatro linhas celulares (a innately BLM HOP sensível e linhas ACHN, a linha testicular NCCIT eo H322M resistentes innately BLM, as mesmas linhas avaliadas para o experimento γ-H2AX) foram submetidos a uma análise de curso de tempo. Embora tenha havido aumento G2 /M de detenção em ambos os sub-clones parentais e resistentes-BLM (Figura 8), esta foi parada mais proeminente visto entre 8 e 12 horas após o tratamento BLM em células parentais.
experiências foram realizadas em triplicado. distribuição G2 /M foi encontrada para ser mais elevada em linhas parentais (em relação ao sub-clones resistentes) 8 horas após o tratamento BLM.
apoptose reduzida foi encontrada em sub-clones resistentes à BLM
Usando os mesmos quatro sub-clones emparelhados, examinamos se as células sofreram apoptose após o tratamento BLM alta dose. Após 24 horas de tratamento BLM, a percentagem de células apoptóticas aumentou em todas as quatro linhas parentais testados (Figura 9). Em contraste, não há sub-clones resistentes exibiram aumentos estatisticamente significativos da apoptose a seguir ao tratamento BLM. Isso estava de acordo com a análise Ensaio Cometa (danos no DNA). Além disso, três dos quatro sub-clones resistentes (lúpulo
0,05, NCCIT
1,5, e H322M
2,5) exibiram significativamente menos aumento na apoptose (% apoptose após menos% apoptose antes do tratamento BLM) em comparação com a sua parental linhas seguintes BLM tratamento (p 0,05). Isso geralmente correlacionado com o dano reduzido DNA e G2 /M paragem do ciclo celular em sub-clones resistentes à BLM (em comparação com linhagens parentais, pós-tratamento), como observado anteriormente.
* P 0,05 para comparação entre as linhas de células antes e após o tratamento BLM dose elevada. Todas as linhas parentais, mas não linhagens resistentes apresentaram aumentos significativos na apoptose pós-tratamento BLM. P 0,05 para a comparação entre a linha de células resistentes e parental tratamento BLM. Menos apoptose celular foi encontrado em três (HOP
0,05, NCCIT
1,5, e H322M
2,5) de quatro linhas resistentes a BLM, quando comparados aos seus genitores.
discussão
neste estudo, foi estabelecida com sucesso sete linhas de células de cancro humano resistentes-BLM de linhas celulares de cancro comercialmente disponíveis de várias origens de órgãos (pulmão, testículo, mama, renal, bem como o sistema nervoso central). Após súbita aguda, a exposição a curto prazo para BLM, estes sub-clones resistentes a BLM apresentaram menos danos no DNA, teve mais tempo de duplicação, tiveram uma menor proporção de células em G2 /prisão M, e tinha reduzido a apoptose, quando comparado com os seus mais linhas celulares parentais BLM-sensíveis. As linhas celulares resistentes a BLM foram desenvolvidos, aumentando progressivamente a concentração BLM incubando durante um período prolongado de 16-24 meses. Estudos anteriores pode ter utilizado métodos semelhantes em cultivar sub-clones resistentes BLM. No entanto, alguns deles atingiu o nível elevado de resistência BLM-observada neste estudo (que era 7-49 vezes de aumento na IC
50 entre os sub-clones resistentes e parentais, quando comparado com um aumento de 3-20 vezes na outra estudo [15]). Além disso, por meio da análise de lesão induzida por BLM ADN, a distribuição do ciclo celular, e as percentagens de apoptose, vários mecanismos putativos de resistência BLM /sensibilidade foram avaliados.
BLM é conhecido por causar G2 estendida /M prisão e /ou apoptose das células [9], em células sensíveis BLM. Isto pode ser mediada por ATM /ATR [26,27], as proteínas a montante de uma reparação de ADN e via de sinalização que desencadeia G2 /M de captura ou a apoptose de células através de uma variedade de produtos de genes a jusante, tais como o Chk1 /2, cdc 25 [28 ], p53, e p21
WAF1 /CIP1, onde os dois últimos são essenciais para a manutenção da G2 /M de paragem do ciclo [29]. Por outro lado, H2AX histona verificou-se ser necessária para a activação do ponto de controlo G2 /M [30].
cometa e resultados y-H2AX revelou menos danos no ADN induzida por BLM nas linhas resistentes, o que sugere que os sub-clones resistentes podem ter uma maior capacidade para prevenir e /ou reduzir os danos de ADN causados por BLM. Isto pode ser devido a uma redução da absorção celular de BLM, e /ou reforçada BLM eliminação /desintoxicação, mediada por receptores da superfície celular ou transportadores [31], moléculas antioxidantes /enzimas que reduzem BLM-gerado ROS [11,32]; ou enzimas que inactivam BLM [33,34]. Estudos futuros precisa estudar mais estes mecanismos.
Neste estudo, a resistência BLM também resultou em menos G2 M prisão /e apoptose celular, consistente com os resultados de um estudo anterior sobre uma linha resistente BLM único [11] . O ligeiro aumento em G2 /M prisão na linha de base (antes da dose elevada tratamento BLM) para estes sub-clones resistentes BLM poderia ser explicado pela exposição crónica à BLM. O facto de que as células resistentes a BLM foram capazes de proliferar a uma concentração BLM que não era viável para as suas linhas parentais sugere que a evasão do bloqueio do ciclo celular pode ser um outro mecanismo de resistência. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que as células resistentes BLM pode ter adquirido capacidade aumentada para evitar /reduzir o dano ao DNA causado pela BLM. Este, por sua vez, pode ter conduzido ao G2M prisão reduzida /e apoptose.
A gradual da dose método de escalada pelo desenvolvimento de resistência BLM pode resultar em uma relação dose-resposta entre concentrações de manutenção BLM, IC
50 valores e tempos de duplicação maiores observados em ACHN
0, AHCN
0,1 e AHCN
0,25 células. No entanto, até que estas conclusões são confirmadas em outros conjuntos de sub-clones, este continuará a ser um achado interessante na necessidade de validação.
Depois de retirar concentrações manutenção BLM de todos os sete sub-clones resistentes, houve reversão parcial da IC
50 valores e tempo de duplicação em três das sete linhas celulares. A ausência de reversibilidade nas outras quatro linhas de células poderia ser o resultado de diferenças de linha de células individuais, ou talvez Estas linhas celulares necessários intervalos mais longos da exposição BLM para desenvolver sensibilidade BLM novamente. Para o nosso conhecimento, a literatura sobre revertendo BLM-resistência em linhas celulares de cancro tem sido extremamente limitado.