Abstract

A clivagem e poliadenilação específica factor 4 (CPSF4), um membro do complexo CPSF, desempenha um papel fundamental no mRNA de poliadenilação e mRNA 3 ‘de maturação. No entanto, seu possível papel na patogênese do câncer de pulmão é desconhecida. Neste estudo, nós investigamos o papel biológico e significado clínico CPSF4 no crescimento do cancro do pulmão e sobrevivência e elucidou os mecanismos moleculares subjacentes. Descobrimos que CPSF4 foi altamente expresso em linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão e tecido tumoral, mas não foi detectada em 8 tecidos humanos normais. Nós também descobrimos que CPSF4 superexpressão foi correlacionada com sobrevida global pobre em pacientes com adenocarcinoma pulmonar (

P Art 0,001). A análise multivariada revelou que a maior expressão CPSF4 foi um fator prognóstico independente para sobrevida global dos pacientes com adenocarcinoma pulmonar. Supressão de CPSF4 por siRNA proliferação das células de câncer de pulmão inibida, a formação de colónias, e a apoptose induzida. Mecanismo de estudos revelaram que estes efeitos foram atingidos através de uma modulação simultânea de múltiplas vias de sinalização. Knockdown de expressão CPSF4 por siARN inibiu marcadamente a fosforilação de PI3K, AKT e ERK1 /2 e proteínas JNK. Em contraste, a expressão ectópica de CPSF4 teve o efeito oposto. Além disso, CPSF4 knockdown também induziu a clivagem de caspase-3 e proteínas caspse-9. Colectivamente, estes resultados demonstram que CPSF4 desempenha um papel crítico na regulação da proliferação de células de cancro do pulmão e da sobrevivência e pode ser um potencial biomarcador prognóstico e alvo terapêutico para o adenocarcinoma do pulmão

citação:. Chen W, W Guo, Li H, shi D, Tian Y, Z Li, et ai. (2013) regulação positiva de clivagem e poliadenilação fator específico 4 em Lung Adenocarcinoma e seu papel crítico para Cancer Cell sobrevivência e proliferação. PLoS ONE 8 (12): e82728. doi: 10.1371 /journal.pone.0082728

editor: Chunhong Yan, Georgia Regents University, Estados Unidos da América

Recebido: 25 Setembro, 2013; Aceito: 05 de novembro de 2013; Publicação: 16 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por fundos do National Natural Science Foundation da China (81272195, 81071687, 81071687, 81372133), o Estado “Programa 863” da China (SS2012AA020403), o Estado “973 Programa” da China (2014CB542005), o Doutorado Programas Foundation do Ministério da Educação da China (20110171110077), eo Laboratório de Estado-chave de Oncologia no sul da China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declaram não haver conflitos de interesse

Introdução

câncer de pulmão primário é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é uma das principais formas de câncer de pulmão e sua incidência tem vindo a aumentar nas últimas décadas. Novel insights sobre a biologia do NSCLC melhoraram resultado para alguns doentes [2], [3], contudo, a taxa de sobrevivência em 5 anos para os doentes com NSCLC não foi marcadamente melhorado [4]. Portanto, há uma necessidade urgente para compreender os mecanismos moleculares em tumorigênese câncer de pulmão e para a identificação de novos alvos terapêuticos para melhorar o prognóstico dos pacientes

A clivagem e poliadenilação fator específico 4 (CPSF4;. Alternativamente conhecido como CPSF30 ou NEB1) foi descoberta originalmente como um componente essencial da máquina de processamento da extremidade 3 ‘de pré-ARNm celulares. A proteína é um membro do complexo CPSF, que foi relatada para participar ARNm extremidades 3 ‘maturação e desempenham um papel fundamental na poliadenilação do mRNA com outros membros do complexo CPSF [5] – [9]. Tem sido proposto que estas ARNm extremidades 3 ‘, incluindo factores de maturação CPSF4 talvez conectar-se a supressão do tumor [10], [11]. Em contraste, outros estudos que identificar um potencial papel oncogénica destes ARNm extremidades 3 ‘factores de transformação em vários cancros humanos [12] – [15]. Em células infectadas por vírus influenza, proteínas CPSF4 interagiu com a proteína NS1 do vírus e inibiram «clivagem final 3 e poliadenilação do hospedeiro pré-ARNm [16]. CPSF4 proteína funcionalmente interagiu com supressor de tumor Cdc73 e regulada a transcrição de INTS6 gene específico em células HeLa [10]. Embora a função de CPSF4 foi analisado em diferentes sistemas modelo, seu papel potencial em tumores não foi totalmente investigado devido a uma falta de dados sobre a expressão CPSF4 e crescimento de células tumorais.

Neste estudo, foi investigada a expressão e significado clínico CPSF4 no adenocarcinoma de pulmão e explorado suas funções e mecanismos subjacentes para a sobrevivência de células cancerosas e proliferação. Mostrámos que CPSF4 é sobre-expresso num subconjunto de adenocarcinomas do pulmão, o que se correlaciona com a sobrevivência global fraca. Knockdown de CPSF4 em cancros do pulmão leva à redução do crescimento celular, proliferação e aumento da apoptose em linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão com altos níveis endógenos de CPSF4. Nossos resultados indicam que CPSF4 pode ser um potencial biomarcador prognóstico e alvo terapêutico para adenocarcinoma de pulmão.

Resultados

CPSF4 é altamente expresso em linhas celulares de adenocarcinomas de pulmão e tecidos tumorais

examinado a expressão da proteína no pulmão CPSF4 linhas celulares de adenocarcinoma por Western blotting. As linhas de células de adenocarcinomas do pulmão expressaram os níveis elevados de proteínas CPSF4 em comparação com o HBE (Fig. 1A). Nós também detectada a expressão da proteína no tecido CPSF4 adenocarcinomas do pulmão e 8 tecidos humanos normais (coração, pulmão, fígado, rim, cérebro, baço, ovário, testículo e) por ensaio de imuno-histoquímica. Como mostrado na Figura 1B, foi observada uma coloração positiva de CPSF4 no núcleo de células do cancro do pulmão, ao passo que a coloração CPSF4 não pôde ser detectado em todos os 8 tecidos normais, sugerindo que CPSF4 pode ser um biomarcador potencial para adenocarcinomas do pulmão.

(A) A expressão de CPSF4 na HBE células de pulmão humano normal e várias linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão foi analisada por Western blot. (B) A expressão de CPSF4 em 8 tecidos humanos normais e tecidos de adenocarcinoma pulmonar foi detectada por coloração imuno-histoquímica. (Ampliação, 200x). ADC, adenocarcinoma.

superexpressão CPSF4 está associada com mau prognóstico dos pacientes adenocarcinomas pulmonares

Para investigar o significado clínico-patológico de CPSF4 em adenocarcinomas pulmonares, realizou-se coloração imuno-histoquímica em um tissue microarray . CPSF4 coloração positiva foi observada no núcleo de células de cancro de pulmão, mas coloração foi negativa em tecidos do pulmão de não-malignas adjacentes (Fig. 2A e 2B).

(A) Exemplos representativos de forte, moderada, fraco e expressão CPSF4 negativo em tecidos de adenocarcinoma de pulmão. painéis superiores, × 40; painéis inferiores, × 400, a partir da área da caixa no painel superior, respectivamente. (B) A comparação dos níveis de expressão CPSF4 entre tecidos do pulmão e adenocarcinoma do pulmão não-tecidos malignos adjacentes por meio de imuno-histoquímica no mesmo paciente. Imagens representativas de tecidos adenocarcinoma do pulmão emparelhados e os tecidos do pulmão não-malignas adjacentes foram mostradas (ampliação, × 400). A análise da curva (C) ROC foi utilizada para determinar o ponto de corte para a expressão elevada de proteína nos tecidos CPSF4 de adenocarcinoma de pulmão. A sensibilidade e especificidade para OS foram plotados;

p

= 0,002. análise (D) de Kaplan-Meier de sobrevida global com expressão alta ou baixa CPSF4 (

p Art 0,001, teste de log-rank). análise (E) de Kaplan-Meier de sobrevida global dos pacientes do sexo masculino e feminino, com alta expressão CPSF4 (

p

= 0,56).

Para desenvolver um ponto de corte razoável de CPSF4 para posterior análise de sobrevida, submetido cada pontuação IHC para análise da curva ROC em relação ao resultado do paciente. Como mostrado na (Fig. 2C), os pontos de corte CPSF4 IHC para OS foi de 5,0. Assim, a expressão de CPSF4 em cada amostra foi posteriormente classificado como alto nível (pontuação 5) ou de nível baixo (pontuação ≤ 5). As características clinicopatológicas dos 150 doentes com adenocarcinomas do pulmão são mostrados na Tabela 1A. Descobrimos que a taxa de expressão alta CPSF4 foi maior em pacientes com mais tarde classificação N (P = 0,033, teste de Qui-quadrado) (Tabela 1). Não houve correlação significativa entre a expressão CPSF4 e outros parâmetros clínico-patológicas, como sexo do paciente, idade (≥60 vs. 60 anos), classificação T (P 0,05, Tabela 1). A análise de sobrevivência mostrou que a alta expressão de CPSF4 significativamente correlacionada com menor tempo de sobrevida global em pacientes com adenocarcinoma pulmonar (P 0,001, teste log-rank; A Fig. 2D). Survival análises também mostraram que não houve diferença significativa do tempo de sobrevida global entre masculino e paciente do sexo feminino com altos níveis de CPSF4 (P = 0,56, teste log-rank; Fig 2E.)

Nós também. utilizada uma análise univariada para avaliar a associação entre o prognóstico do paciente e vários fatores clínico-patológicas, incluindo expressão CPSF4 (alta vs. baixa), sexo (masculino versus feminino), idade (≥60 vs. 60 anos), fase pT (tamanho do tumor; T3-T4 vs. T1-T2) e estádio pN (metástases linfonodais; N2-N3 vs. N0-N1). Todos esses parâmetros, exceto sexo e idade foram significativamente associados com o prognóstico inferior (Tabela 2). A análise multivariada indicou ainda que elevado nível CPSF4 e estágio pN foram fatores prognósticos independentes para a sobrevida global de pacientes com adenocarcinoma pulmonar (Tabela 2). Todas estas descobertas sugerem que CPSF4 pode ter um papel importante na promoção de um comportamento mais agressivo de células de câncer de pulmão.

CPSF4 knockdown inibe a proliferação de células de adenocarcinoma de pulmão e sobrevivência

Para avaliar se a células que expressam níveis elevados de CPSF4 contar com ele para a sobrevivência e proliferação, nós transfectadas oligonucleotídeos siRNA segmentação CPSF4 em células H1299 e A549, que expressam níveis significativos de CPSF4. Os resultados mostraram que as nanopartículas CPSF4 siRNA baseados em DC marcadamente regulada negativamente a expressão da proteína CPSF4 (Fig. 3A), e o knockdown de CPSF4 significativamente a viabilidade celular inibido, em comparação com a transfecção com os grupos de ARNip inespecífica pelo Ensaio MTT (Fig. 3B).

(A) Análise de expressão CPSF4 por Western blot 3 dias após a transfecção siRNA. Mock, controle do veículo; ARNsi de controlo, siARN não específica; CPSF4 siRNA-1 e CPSF4 siRNA-2, CPSF4 siRNA específico. viabilidade (B) das células foi medido pelo ensaio de MTT. A média e SD obtidos a partir de três experimentos independentes são plotados (*,

P Art 0,05, **,

P Art 0,01). (C) As células foram tratadas com CPSF4 ou ARNsi de controlo (50 nmol /L) a cada 3 dias e cresceram durante 14 dias; colónias coradas com cristal violeta foram contados. Os resultados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes (***,

P

0,001). (D, E) a 3 dias após a transfecção siRNA, do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo utilizando coloração de PI. Os dados representativos de três experiências independentes são apresentados (D). Percentagem de células em cada fase (E). células H1299 e A549 (F) foram semeadas na câmara de transwells revestidas com matriz Matrigel. A capacidade de invasão de células foi determinada por células contadas que passam através da matriz Matrigel para o lado basal de transwells. * P . 0,05 quando comparado com o grupo controle siRNA não específico

Para confirmar a inibição CPSF4 siRNA mediada do crescimento celular, nós próxima realizados experimentos de formação de colónia e descobriu que CPSF4 knockdown diminuiu significativamente a formação de colónias em células H1299 e A549 (Fig. 3C). Uma vez que foi observado um efeito inibidor do crescimento em células siCPSF4-transfectadas, foram analisados ​​os transfectantes para os parâmetros do ciclo celular por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 3D e 3E, a acumulação de células G1 marcadamente aumentada no grupo tratado com ARNsi CPSF4, em comparação com os controlos não-específicos de siRNA (75% vs 55% em H1299 e 73% vs. 46% em A549). Além disso, também mostraram que knockdown de CPSF4 por siARN consideravelmente inibiu a invasão de células H1299 e em ambas as células A549 (Fig. 3F). Estes resultados indicam que o knockdown de CPSF4 em células de cancro do pulmão resultou numa inibição significativa da proliferação celular e a invasão de células.

CPSF4 knockdown inactiva PI3K /AKT e MAPK sinalização

Para identificar os mecanismos moleculares potenciais pelo qual CPSF4 knockdown sobrevivência das células do cancro do pulmão e inibiu a proliferação, analisaram-se as actividades de várias proteínas pró-sobrevivência por análise de Western blot. Os resultados mostraram que CPSF4 knockdown em ambas as células H1299 e A549 suprimiu significativamente a fosforilação de PI3K, AKT, ERK1 /2 e proteínas de JNK, mas aumenta consideravelmente a fosforilação da proteína p38 (Fig. 4A), conduzindo assim a uma inactivação da via PI3K /AKT e vias de sinalização MAPK.

(a), 72 horas após o tratamento de siRNA, a expressão da proteína CPSF4 e a Akt total e fosforilada, PI3K, ERK1 /2, as proteínas de JNK e p38 em H1299 e A549 foi detectado pela western blot. GAPDH serviu como controlo de carregamento. (B) A apoptose em H1299 e A549 foi determinada por citometria de fluxo 72 h após a transfecção usando um siRNA FITC V-kit /PI-coloração com anexina. Os dados representativos de três experiências independentes são apresentados. (C) A apoptose foi calculada em termos de FITC-positivos em células. Os resultados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes (*,

P

0,05). (D) Em 72 horas após o tratamento com siRNA, a expressão de Bcl-2, caspase-3 clivada ou 9 proteínas em H1299 e A549 foi detectado por Western blot. GAPDH foi utilizado como controlo de carga.

CPSF4 knockdown induz a apoptose em células de câncer de pulmão

A seguir, investigou o efeito da CPSF4 knockdown em apoptose por anexina V-FITC /staining- PI A análise FACS com base (Fig. 4B). Knockdown de CPSF4 por siRNA resultou numa indução significativa da apoptose de células em ambas as células H1299 e A549 (Fig. 4C). A activação das caspases é um acontecimento importante na via de sinalização da apoptose. A seguir detectado o efeito de CPSF4 knockdown sobre a expressão e a activação de duas proteínas pró-apoptóticas principais: a caspase-3 e caspase-9, em H1299 e células A549 através de Western blot. Como mostrado na Fig. 4D, CPSF4 knockdown induziu a activação de caspase-3 e -9, resultando num aumento significativo nos níveis de caspase-9 proteínas caspase-3 clivada e clivada. Knockdown de CPSF4 também regulada negativamente a expressão de Bcl-2, uma importante proteína anti-apoptótica, em ambas as células H1299 e A549 (Fig. 4D) .Assim, estes resultados indicaram que CPSF4 pode controlar vários aspectos de sinalização de apoptose.

CPSF4 superexpressão promove o crescimento de células de cancro do pulmão e activa a via PI3K /AKT e MAPK sinalização

Para confirmar adicionalmente o papel de CPSF4 na regulação do crescimento de células de cancro de pulmão através da via PI3K /AKT e MAPK vias de sinalização, células H1299 foram transfectadas com um CPSF4 vector de expressão de codificação (pcDNA3.1-CPSF4) ou um vector de controlo sem CPSF4 (pcDNA3.1). Os resultados mostraram que a superexpressão CPSF4 acentuadamente promovida a viabilidade celular (Fig. 5A) e a formação de colónias (Fig. 5B), em comparação com a transfecção com o vector de controlo grupos. Para identificar os mecanismos moleculares subjacentes pelos quais CPSF4 ovexexpression aumento do crescimento de células de cancro do pulmão, analisamos o efeito de CPSF4 na activação de AKT e MAPK a sinalização através de Western blot. Como mostrado na Fig. 5C, CPSF4 ovexexpression marcadamente regulada positivamente a fosforilação de PI3K, AKT, ERK1 /2 e proteínas JNK. Estes resultados, portanto, mostrou que a expressão ectópica de CPSF4 promoveu o crescimento celular parcialmente através da activação da via PI3K /AKT e MAPK de sinalização em células de cancro de pulmão.

H1299 células (A) foram transfectadas com vector de expressão CPSF, em três ou 4 dias a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes (*,

P

0,05). (B) H1299 células foram transf ectadas com vectores que expressam CPSF4 ou vector de controlo a cada 3 dias e cresceram durante 8 dias, as colónias foram coradas com violeta de cristal e contadas. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes (*,

P

0,05). (C) H1299 células foram transfectadas com o vector de expressão CPSF, às 72 horas após a transfecção, a expressão de CPSF4 bem como Akt total e fosforilada, PI3K, ERK1 /2 e proteínas JNK foi detectado por Western blot. GAPDH foi utilizado como controlo de carga.

Discussão

Neste estudo, mostramos que CPSF4 foi altamente expresso em linhas celulares de adenocarcinomas de pulmão e tecidos tumorais em comparação com células de pulmão normal e tecidos pulmonares não cancerosas, respectivamente. A expressão de CPSF4 em 8 tecidos humanos normais era deficiente. Além disso, os dados clínico-patológicas do nosso tissue microarray mostrou que adenocarcinomas do pulmão pacientes com CPSF4 altamente expresso têm menor tempo de sobrevida do que aqueles com CPSF4 baixa expressão. A análise multivariada mostrou que CPSF4 expressão elevada é um fator prognóstico independente para sobrevida global dos pacientes adenocarcinomas de pulmão. Os resultados do nosso

In vitro

experimentos sugerem que CPSF4 exerceu sua função oncogénica, regulando a proliferação e apoptose de células de adenocarcinoma de pulmão.

CPSF4 pertence o fator de clivagem e poliadenilação especificidade complexa (CPSF), cujos outros membros são CPSF160, CPSF100, CPSF73 e Fip1 [17]. Recentemente, alguns estudos têm incidido sobre o papel dos fatores de processamento de final alguns mRNA 3 ‘em câncer, incluindo FIP1L1, CSTF50, CSTF2 e Neo-PAP [11] – [15]. Por exemplo, Aragaki e seus colegas descobriram que a CSTF2 foi altamente expressa em câncer de pulmão, enquanto que a sua expressão era dificilmente detectável em qualquer um dos 29 tecidos humanos normais, exceto testículo. Além disso, o knockdown de CSTF2 por siARN inibiu o crescimento de células de cancro do pulmão. Mais importante, CSTF2 superexpressão foi associada com mau prognóstico para pacientes com câncer de pulmão. Neste relatório, nós fornecemos evidência clínica de que CPSF4 superexpressão prediz mau prognóstico em pacientes de adenocarcinoma de pulmão. A supressão da expressão CPSF4 inibiu o crescimento de células de câncer de pulmão

in vitro.

O valor prognóstico significativo de CPSF4 poderia ser explicada pela sua função de pró-sobrevivência em células de câncer de pulmão. Ainda não se sabe por que CPSF4 foi sobre-expressos em células de câncer de pulmão; no entanto, com base nos resultados do presente estudo, acreditamos que CPSF4 pode ser um potencial alvo de diagnóstico e /ou terapêutico em adenocarcinomas pulmonares.

Neste estudo, observou-se que CPSF4 siRNA mediada knockdown crescimento celular inibido e induziu apoptose em células de câncer de pulmão expressando altos níveis de CPSF4. Para investigar os mecanismos moleculares de sublinhado, examinamos PI3K /AKT, MAPK e apoptose vias de sinalização alteração. Inactivação de PI3K /AKT, as vias de sinalização MAPK por CPSF4 knockdown, como indicado por suprimiu a fosforilação de PI3K, AKT, ERK1 /2 e JNK, foi observada em linhas celulares de cancro de pulmão. As vias de PI3K /AKT e MAPK estão envolvidas numa ampla variedade de processos celulares, tais como o crescimento, proliferação, diferenciação, regulação da transcrição e desenvolvimento [18], [19]. Estas duas vias de sinalização são activados em cancro do pulmão e foram identificadas como um novo alvo para a terapia de [20] – [22]. Assim, CPSF4 pode exercer o seu efeito de regulação do crescimento, pelo menos em parte, através da modulação da via PI3K /AKT e MAPK vias de sinalização em células de cancro de pulmão. Embora outras análises detalhadas são necessárias para determinar os alvos diretos de CPSF4, os achados deste estudo implica a importância biológica da CPSF4 na regulação do crescimento de células de câncer de pulmão e de sobrevivência. Assim, nossos resultados fornecem uma base racional para a investigação farmacológica do CPSF4 como um potencial novo alvo terapêutico no cancro do pulmão.

Em resumo, CPSF4 foi altamente expressa em linhas celulares de cancro do pulmão e tecidos tumorais e positivamente correlacionada com mau prognóstico de pacientes com adenocarcinoma pulmonar. Knockdown de expressão CPSF4 por siARN crescimento celular e inibiu significativamente a apoptose induzida em linhas de células de adenocarcinoma de pulmão através da inactivação simultânea da via PI3K /AKT e MAPK sinalização e activação das vias de apoptose dependente de caspases. Em contraste, a expressão ectópica de CPSF4 teve o efeito oposto. Esses resultados, portanto, indicam que CPSF4 desempenha um papel importante na regulação do crescimento e sobrevivência das células de adenocarcinoma de pulmão e pode ser um potencial alvo terapêutico para o câncer de pulmão.

declaração de Ética Materiais e Métodos

o estudo foi aprovado pelo Comitê de Sun Yatsen University Cancer Center de Ética. Todas as amostras utilizadas neste estudo foram anônimas e coletadas de pacientes para o uso patologia de rotina. Sem o consentimento informado (escrito ou verbal) foi obtido para o uso de amostras de tecido retrospectivos dos pacientes neste estudo, uma vez que a maioria dos pacientes foram mortos e o consentimento informado não foi considerado necessário e dispensada pela Comissão de Ética.

as linhas de células e cultura de células

linhas celulares de NSCLC humano (H1299, A549, H1975, H1437) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad , CA), suplementado com soro fetal bovino a 10%. Normal epitelial bronquial humano (HBE) foi mantida em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro bovino fetal a 10%. As células foram mantidas numa atmosfera humidi ficada e 5% de CO

2 a 37 ° C.

análise Western blot

Os lisados ​​celulares foram separados por electroforese em dodecilsulfato de sódio 8-12% sulphate- mini-gel de gradiente de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) e transferidas electroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). As transferências de Western foram sondadas com anticorpos contra CPSF4 (Grupo Proteintech, Inc., Chicago, EUA), fosfo-p85 de PI3K (Tyr458) /p55 (Tyr199), PI3K, fósforo-Akt (Ser473), Akt, pTyr202 /Y204-ERK1 /2, ERK1 /2, pThr183 /Tyr185-SAPK /JNK, SAPK /JNK, caspase-3 clivada, caspase-9 e GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) .Os bandas proteicas foram detectadas por quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ):

O tecido pulmonar adenocarcinomas microarray

Tissue microarrays (diâmetro, 1,5 mm;. profundidade, 4 mm) utilizado para a imunocoloração análise da expressão da proteína CPSF4 foi adquirido a partir de Xangai Outdo Biotech (Xangai, China, https://www.superchip.com.cn/). O micro-arranjo foi de 150, adenocarcinomas do pulmão embebidos em parafina e fixados em formalina e correspondentes tecidos pulmonares malignas não adjacentes. Estas amostras de tecido foram obtidas a partir de pacientes que têm nenhum tratamento anti-cancro de tumores antes da ressecção. As amostras de tecido foram histologicamente examinados e classificados usando o sistema de classificação da Organização Mundial da Saúde de 2004 [23]. informações clínicas e patológicas detalhadas, incluindo tumor-nódulo-metástase clínico e patológico (TNM) estágio e duração sobrevida global (OS) estava disponível para todos os casos. O estado TNM patológica de todos os adenocarcinomas de pulmão foi avaliada de acordo com os critérios dos sete edição do American Joint Committee on Cancer (2010).

imuno-histoquímica (IHQ) e histológica avaliação

A imuno-histoquímica foi realizada utilizando o kit Envisionþ /HRP (DakoCytomation). Resumidamente, as lâminas foram imersas em Alvo Retrieval Solution (pH 9; DakoCytomation) e ferve-se a 108 ° C durante 15 minutos numa autoclave para a recuperação de antigénio. CPSF4 anticorpo (diluição 1:50) foram adicionados a cada diapositivo após o bloqueio da peroxidase endógena e proteínas, e as secções foram incubadas com HRP-anticorpo anti-IgG de coelho [Histofine simples mancha MAX PO (L); Nichirei] como o anticorpo secundário. Chromogenwas substrato adicionado, e as amostras foram contrastadas com hematoxilina. Um controle negativo foi obtido através da substituição do anticorpo primário com uma IgG de coelho normal.

As reacções imunológicas foram avaliadas de forma independente por dois patologistas cegos à informação clínico-patológica. a intensidade da coloração nuclear foi categorizado: coloração ausente como 0, fraco como 1, moderada como 2, e forte como 3. A percentagem de células coradas foi acedido utilizando um sistema de cinco escala de pontuação: 0 (sem células positivas), 1 ( 25% de células positivas), 2 (25% de células positivas -50%), 3 (50% -75% de células positivas), e 4 ( 75% de células positivas). A pontuação para cada tecido foi calculado multiplicando a intensidade e o valor percentual (a faixa de este cálculo foi, portanto, 0-12). O receptor análise característica (ROC) a operar foi empregado para determinar a pontuação de corte para tumor “alta expressão” usando a 0, 1-critério. Resumidamente, a sensibilidade e especificidade para o resultado do paciente a ser estudada em cada pontuação foi traçada para gerar uma curva ROC. A pontuação foi selecionado como o valor de corte, o que era o mais próximo ao ponto com a sensibilidade máxima e especificidade. Tumores designados como “expressão de baixo” para CPSF4 foi aqueles com pontuações abaixo ou igual ao valor de corte, enquanto os tumores “alta expressão” eram aqueles com pontuações acima do valor. Para facilitar a análise da curva ROC, as características clínico-patológicas foram dicotomizados:. Status de sobrevivência (morte devido a adenocarcinomas do pulmão contra censurado)

Preparação de nanopartículas DC e encapsulamento siRNA

DOTAP-colesterol (DC) foi adquiridos a Avanti Polar-Lipids Inc. (Birmingham, AL, EUA). clorofórmio de grau HPLC foram obtidos a partir de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA) .Os nanopartículas foram preparados por um homogeneizador de alta pressão EmulsiFlex B3-(HPH) (Avestin Inc., Otava, Canadá) [24], [25]. Os nanossomas foram mantidos à temperatura ambiente durante 1 h antes da armazenagem durante a noite a 4 ° C.

CPSF4 siRNA e siRNA inespecíficos foram adquiridos a partir de Xangai GenePharma Co. (Xangai, China). As sequências dos siRNA específico CPSF4-humanos foram 5′-CAC CAU GCA AUU UCG UGA ATT-3 ‘(siARN-1) e 5′-CAC GGU CUG GUG CAA UUA UTT -3′ (siARN-2); inespecífica siRNA, 5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ‘. A vetores CPSF4 superexpressão pcDNA3.1-CPSF4 e os pcDNA3.1 vetor de controle foram concebidos e sintetizados por Cyagen (Cyagen Biosciences Inc., Estados Unidos). Para a entrega de CPSF4 siRNA ou CPSF4 expressar vector em células de câncer de pulmão, o siRNA ou vector plasmídeo foi encapsulada em nanosomes DC que tinha anteriormente validado [26] – [28].

Ensaio

A proliferação celular e formação de colónias

a proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTT (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. A viabilidade das células foi determinado após transfecção com CPSF4 siRNA ou CPSF4 vectores que expressam. Às 48 horas após o tratamento, as células H1299 e (A549) foram colhidas, contadas, e semeadas células individuais (400 células /poço) em triplicado em placas de 6 poços. As células foram tratadas com CPSF4 vectores que expressam ARNsi ou CPSF4 cada 3 dias e crescidas durante 8-14 dias [29]; as colónias foram coradas com violeta de cristal durante 10 minutos à temperatura ambiente. Colónias que continham mais de 50 células foram contadas.

In vitro invasão ensaio

O

in vitro ensaio de câmara de invasão

foi realizado com Millicell celular Cultura Insert (24 poços PCF 8,0 ul, Millipore). Resumidamente, as inserções de pé em 24 poços da placa de cultura de células foram revestidas com 100 uL de 1 mg /ml de Matrigel Matrix (BD Falcon, EUA) em soro isento de meio RPMI-1640 e secou-se ao ar. 48 horas após o tratamento CPSF4 siRNA, células (H1299 e A549) foram colhidas, contadas, e de meio isento de soro contendo 100 ul de 5 × 10

4 células foram adicionados ao inserto. O compartimento inferior continha 0,5 mL de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS. Isto decorre de incubação em 5% de CO

2 a 37% durante 24 horas. Em seguida, fixa as células que penetram na membrana para o lado inferior com formalina e estas células foram coradas com violeta de cristal. A capacidade de invasão das células foi determinada por contagem das células que penetram no lado inferior do filtro através dos poros ao microscópio a uma ampliação de x100. Nós ensaiadas 3 vezes e selecionados aleatoriamente 3 campos foram contados para cada ensaio.

A apoptose e análise do ciclo celular

Para a detecção de apoptose e ciclo celular, as células (H1299 e A549) transfectadas com siRNA foram analisadas por citometria de fluxo. Às 72 horas após a transfecção, as células (1 x 10

5 células /ml) foram coradas com 5 ul AnnexinV-FITC e 5 ul de PI (iodeto de propidio), utilizando um Anexina V-FITC kit /PI-coloração (Becton Dickinson, CA, EUA), colocada em temperatura ambiente durante 15 min no escuro e então analisadas por citometria de fluxo (EPICS XL, Beckman Coulter). A apoptose foi calculada em termos de FITC-positivos em células. análise do ciclo celular foi realizada por meio da coloração de PI. As células transfectadas foram colhidas com tripsinização, fixadas em etanol frio a 70% durante 30 minutos. Após o tratamento com 100 mg /ml de RNase (Sigma-Aldrich), as células foram coradas com 50 mg /mL de PI (Sigma Aldrich) em PBS. Citometria de fluxo (EPICS XL; Beckman Coulter) foi realizada imediatamente. Os dados brutos foram analisados ​​utilizando Multicycle para Windows (Beckman Coulter).

t-teste de análise estatística

Student foi utilizado para comparar dois grupos independentes de dados. A coloração imuno-histoquímica pontuação média foi utilizada como o valor de corte para separar os pacientes nos grupos de expressão baixa e alta CPSF4. Qui-quadrado foram aplicados para analisar a relação entre a expressão CPSF4 e estado clínico-patológico. sobrevivências de Kaplan-Meier foram tabulados e foram realizados testes de log-rank. Análises univariada e multivariada foram realizadas com o modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox para determinar a associação entre variáveis ​​clínico-patológicas e mortalidade relacionada ao câncer. A

P

valor. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todos os casos