Abstract

Há uma tendência crescente para os pesquisadores de usar

in vitro

modelos 3D em estudos de câncer, como eles podem recapitular melhor o complexo

in vivo

situação. E o facto de que a progressão e desenvolvimento de tumor estão intimamente associados ao seu microambiente estromal tem sido cada vez mais reconhecidas. O estabelecimento de tal nicho de apoio tumor é vital para o progresso do tumor compreensão e metástase. A origem mesenquimal de muitas células que residem no nicho de câncer fornece a lógica para incluir MSCs em imitar o nicho no neuroblastoma. Aqui nós co-encapsulado e co-cultura NBCs e MSCs em um

in vitro

modelo 3D e investigar a morfologia, cinética de crescimento e remodelação da matriz no ambiente estromal reconstituído. Os resultados mostraram que a incorporação de MSCs no modelo de chumbo à aceleração do crescimento das células cancerosas, bem como recapitulação de, pelo menos, parcialmente o microambiente tumoral

In vivo

. O presente estudo demonstra, portanto, a viabilidade para a microesfera de colágeno para agir como um 3D

in vitro

modelo de câncer de vários tópicos em estudos sobre câncer

Citation:. Yeung P, Sin HS, Chan S, Chan GCF, Chan BP (2015) a microencapsulação de células de neuroblastoma e células estromais mesenquimais em colágeno Microesferas: um modelo 3D para Cancer Cell Niche Study. PLoS ONE 10 (12): e0144139. doi: 10.1371 /journal.pone.0144139

editor: Stan Gronthos, The University of Adelaide, Austrália

Recebido: 21 Agosto, 2015; Aceito: 14 de novembro de 2015; Publicação: 14 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yeung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Usando culturas em monocamada 2D de linhas celulares de cancro como um modelo simples para estudar a investigação do cancro poderia ser rastreada até 1950 [1, 2]. No entanto, semelhante a tecidos saudáveis, tecidos tumorais são entidades 3D com células, matriz extracelular e outras microambiente. Até à data, é geralmente aceite que a cultura linha de células monocamada mal representa o

in vivo

fenômeno [3], em que existem interações célula-célula e célula-matriz, portanto, limitando a sua capacidade de prever a resposta de células cancerígenas em realidade [4].

nos últimos anos, há uma tendência crescente para os pesquisadores de usar

in vitro

modelos 3D em estudos de câncer [3, 5, 6] sobre temas como microambiente do tumor [7], a angiogénese [8] e metástase [9]. Estes modelos incluem esferóides [10] e microesferas [11, 12]. Eles apoiam co-cultura de vários tipos de células, permite-célula e interações célula-matriz e, assim, preservar melhor os

in vivo

características do tecido tumoral. Alguns modelos são capazes de estabelecer a diversidade estrutural dos tecidos tumorais com zonas de proliferação de células, quiescentes ou necróticas [4]. A capacidade desses modelos 3D para incluir vários fatores de nicho permite recapitulação parcial e estreita semelhança do

in vivo

microambiente das células cancerosas [4, 13, 14], contribuindo para modelagem de doença tumoral e personalizado triagem quimioterapia no longo prazo.

Os tumores são órgãos não homogéneas, mas tecidos muito complexas que envolvem vários tipos de células, incluindo mas não limitado às células cancerosas, células progenitoras câncer, células endoteliais, células inflamatórias e fibroblastos associados ao câncer [3, 15-17 ]. Além das células em proliferação neoplásicas do parênquima (células cancerosas), o estroma de suporte composta de células de origem mesenquimal poderia ser responsável por metade da massa do estroma [3]. A progressão do cancro não depende exclusivamente em células cancerosas, mas também nas células do estroma que residem no microambiente tumoral [18, 19]. Tem sido demonstrado que as células estaminais mesenquimais (MSC) multipotentes residem em tecidos adultos [20, 21]. Mesmo que se essas células são originárias da medula óssea continua a ser controversa, mas a semelhança da MSC com pericitos ao longo da parede dos vasos sanguíneos que fornecem outra explicação atraente [22, 23]. evidências crescentes mostram que o câncer do estroma associado particularmente células fibroblásticas acelerou o crescimento do tumor [3] e promoveu um microambiente permissivo para a metástase do câncer [24, 25]. Alguns resultados indicam que as células estaminais mesenquimais (MSCs) faria trânsito a partir de medula óssea para tumor durante o desenvolvimento do tumor [26-29]. No entanto, o papel de MSC na tumorigénese permanece controverso [26, 30-33]. Uma noção bem conhecido é que, a interação heterotípica entre vários tipos de células é necessária para a semelhança exata de

in vivo

respostas. Para atingir este objetivo, os modelos 3D que permitem interações entre os vários tipos de células são atraentes em estudar tais interações complicadas.

Nós já estabeleceu uma plataforma de colágeno microencapsulação, que aprisiona as células vivas dentro de uma malha de colágeno nanofibrous reconstituído [34 ]. A malha é colagénio biocompatível, proporcionando um microambiente fisiologicamente relevante permissiva para a ligação de células, a proliferação, a migração e a diferenciação numa ampla variedade de células incluindo as MSCs [34-37], células HEK293 [38], as células estaminais embrionárias [39], [condrócitos ,,,0],40], as células núcleo pulposo [41] e osteoblastos [42]. Uma grande vantagem do modelo de colagénio microencapsulação é o facto de a malha de colagénio molde suporta remodelação da matriz, que se refere à degradação e deposição de matriz extracelular, em simultâneo, quando a cultura de células maduras e diferenciação de células estaminais em 3D. Isto justifica fortemente a sua utilidade em agir como um modelo recapitulando a

in vivo

microambiente celular durante a formação do tecido estrutural e funcional. Uma segunda grande vantagem da microencapsulação colagénio é controlável e seus miniaturizados (centenas de microns de diâmetro) de tamanho [34] que um micro-tecido composto por várias centenas de células permite que a capacidade de throughput screening económica, personalizado e alta.

Neuroblastoma (NB) é um câncer pediátrico responsável por 6% de todos os tumores malignos encontrados em crianças [43]. NB microambiente consiste de matriz extracelular, os fibroblastos estromais, células vasculares e células do sistema imune [3]. Especificamente, os fibroblastos estromais foram mostrados para aumentar o crescimento do tumor, angiogénese e metástase [44, 45]. Relatórios também mostram que a co-cultura das células de neuroblastoma (NBCS) com outros tipos de células levaria a significativamente diferentes comportamentos. Por exemplo, sem contato co-cultura de NBCs com hepatócitos conduzir a uma menor atividade de apoptose e maior expressão de VEGF [46, 47]. Num outro exemplo, a co-cultura de HUVEC com NBCs reduzida a detecção das células cancerosas a neutrófilos [48]. Além disso, fala cruzadas entre as células de Schwann e NBCS ter sido mostrado que estimula a diferenciação NB, reduzir a agressividade do tumor [49, 50] derramamento luzes acesas novas estratégias terapêuticas. Por outro lado, alguns relatórios têm mostrado que a presença de MSC iria aumentar a capacidade de invasão de neuroblastoma [27, 51, 52]. Embora o papel de MSC em neuroblastoma não é completamente conhecido, a presença de MSC não conduzir a uma mudança comportamental em NBCs. No entanto, apesar de todos estes estudos têm mostrado que NBCs interagir de forma activa com outros tipos de células, estas experiências são todos conduzidos em modelos 2D. Um modelo 3D permissivo para o crescimento e proliferação NBCs, bem como a interacção com as células do estroma não foi ainda relatado. Neste estudo, os autores sugerem que a co-microencapsulação de NBCs com MSCs em microesferas de colágeno vai recapitular, pelo menos parcialmente, o microambiente do tumor

in vivo

. Especificamente, pretendemos investigar a morfologia, cinética de crescimento e remodelação da matriz no ambiente de co-microencapsulação.

Neuroblastoma (NB) é um câncer pediátrico responsável por 6% de todos os tumores malignos encontrados em crianças [43]. NB microambiente consiste de matriz extracelular, os fibroblastos estromais, células vasculares e células do sistema imune [3]. Especificamente, os fibroblastos estromais foram mostrados para aumentar o crescimento do tumor, angiogénese e metástase [44, 45]. Relatórios também mostram que a co-cultura das células de neuroblastoma (NBCS) com outros tipos de células levaria a significativamente diferentes comportamentos. Por exemplo, sem contato co-cultura de NBCs com hepatócitos conduzir a uma menor atividade de apoptose e maior expressão de VEGF [46, 47]. Num outro exemplo, a co-cultura de HUVEC com NBCs reduzida a detecção das células cancerosas a neutrófilos [48]. Além disso, fala cruzadas entre as células de Schwann e NBCS ter sido mostrado que estimula a diferenciação NB, reduzir a agressividade do tumor [49, 50] derramamento luzes acesas novas estratégias terapêuticas. Por outro lado, alguns relatórios têm mostrado que a presença de MSC iria aumentar a capacidade de invasão de neuroblastoma [27, 51, 52]. Embora o papel de MSC em neuroblastoma não é completamente conhecido, a presença de MSC não conduzir a uma mudança comportamental em NBCs. No entanto, apesar de todos estes estudos têm mostrado que NBCs interagir de forma activa com outros tipos de células, estas experiências são todos conduzidos em modelos 2D. Um modelo 3D permissivo para o crescimento e proliferação NBCs, bem como a interacção com as células do estroma não foi ainda relatado. Neste estudo, os autores sugerem que a co-microencapsulação de NBCs com MSCs em microesferas de colagénio recapitulará, pelo menos parcialmente, o microambiente do tumor in vivo. Especificamente, pretendemos investigar a morfologia, cinética de crescimento e remodelação da matriz no ambiente de co-microencapsulação.

Métodos

cultura de células de neuroblastoma

A linha de células de neuroblastoma foi um presente amável do Dr. NKV Cheung do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, nos EUA. As células foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) com elevado teor de glucose (Gibco), com suplementos de 10% de Soro fetal bovino (Gibco), 1% de penicilina estreptomicina (Gibco), 1% glutar-max (Gibco).

estaminais mesenquimais /célula do estroma (MSCs) cultura

MSCs Humanos da medula óssea [53] foram gentilmente cedidos pelo Prof. GCF Chan, do Departamento de Pediatria e do Adolescente medicina, Universidade de Hong Kong e cultivadas como monocamadas, como previamente descrito [53]. O protocolo actual foi aprovado pelo Comitê de Ética Clínica Combinada da Universidade de Hong Kong e de Hong Kong Oeste Cluster Hospitais da Autoridade Hospital. Em resumo, as MSC foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 incubadora em DMEM com baixo teor de glucose (Gibco), com suplemento de 10% de Soro fetal bovino (Gibco), 1% de penicilina estreptomicina (Gibco) e 1 % glutar-max (Gibco). O meio de crescimento foi substituído a cada 3-4 dias. Em cerca de 80% de confluência, as hMSCs foram isolados por tripsinização com tripsina-EDTA (1X) (Gibco) brevemente 0,05% antes de voltar a suspender em meio completo para experiências subsequentes. Células a P6 foram utilizados para experiências posteriores.

Collagen microencapsulação

As células foram microencapsulado conforme relatado anteriormente [34]. Em breve, hMSC e NBCs foram cultivadas até sub- confluência e foram, em seguida, isolada por tratamento NBCs e MSC com 0,25% e 0,05% de EDTA tripsina (1X) (Gibco), durante 5 minutos. NBCs e MSC foram misturados em diferentes proporções predeterminadas (NBCs: 100, 80, 50, 20 e 0%) antes de microencapsulação. tipo I da cauda de rato colagénio (Becton Dickenson Biosciences, Bedford, MA) foi neutralizada por NaOH 0,1 N e diluiu-se em diferentes concentrações finais (0,5, 1 e 2 mg /ml). misturas de células foram suspensos em solução de colagénio neutralizado para formar misturas de células-matriz com diferentes densidades celulares finais (2.5x10e5, 5x10e5 células /ml e 1x10e6 células /ml, equivalente a 1250, 2500 e 5000 células /gotícula 5 ul, respectivamente). gotículas líquidas de misturas de células-matriz foram distribuídos sobre uma superfície não adesiva, que é parafilme irradiado por UV em um 90-mm de diâmetro numa caixa de Petri (Sterilin, Londres, Reino Unido), e, em seguida, incubadas a 37 ° C com 5% de CO

2 para 45 minutos para induzir a gelificação. microesferas de colágeno gelificada contendo tanto NBCs e MSCs em proporções predeterminadas foram cuidadosamente lavado com um meio de co-cultura em uma placa de Petri para culturas em suspensão flutuantes para diferentes durações (7, 14 e 21 dias). Um total de 100 microsferas foram cultivados em cada caixa de Petri. O meio de co-cultura foi misturado por meio de cultura NBC e MSC de acordo com a relação de encapsulamento de células, reabastecido a cada 2-3 dias.

Medição da dimensão das microesferas de matriz celular

O temporais alterações morfológicas das microesferas NBC-MSC-colagénio foi gravado sob um microscópio de contraste de fase até 21 dias. Os diâmetros de cerca de 10% das populações de microsferas foram seleccionados aleatoriamente e medida utilizando um micrómetro ocular peça.

cinética de crescimento de células

A cada 200 microesferas foram encapsulados com 2.5e5 células com diferentes NBC : rácios MSC no dia 0, e eles foram cultivados por 7, 14 e 21 dias. Em cada ponto de tempo, 200 microesferas de cada grupo foram digeridos enzimaticamente por colagenase de Clostridium histolyticum (Sigma) a 200 unidades /ml para 45-60 min. suspensões de células individuais foram obtidos por tratamento dos agregados digeridos com 0,25% de tripsina-EDTA (1X) (Gibco) antes de numeração pelo ensaio de azul de tripano. O crescimento de células em microesferas poderia então ser calculado.

análise de citometria de fluxo na proporção de NBCS

suspensões de células individuais (1x10e6 células) obtidos a partir de digestão com colagenase-tripsina do NBC-MSC- microesferas de colagénio foram re-suspensas em 500 ul de meio de co-cultura, incubada à temperatura ambiente durante uma hora para permitir a recuperação da expressão da proteína da superfície celular, e foram então fixadas por 0,01% PFA durante 15 minutos. As células foram em seguida bloqueadas por 2% de soro de cabra (Vector Laboratories) em PBS durante 30 minutos antes da coloração indirecta de anticorpos. Para cada amostra, 1 uL de anticorpo monoclonal de ratinho contra Neuroblastoma (NB84a, Abcam) em 2% de soro de cabra (diluição 1: 100) foi adicionado. controlos de isotipo (anticorpo IgG de rato normal, Millipore) foram realizados em cada ponto de tempo. Após a coloração, à temperatura ambiente durante 30 minutos, 1 mL de PBS foram adicionados a cada tubo para lavar o excesso de anticorpos. Após centrifugação a 2000 rpm durante 5 min, o sobrenadante foi removido e 0,5 � de cabra Alexa Fluor 647 anticorpo secundário anti-ratinho (Invitrogen) em soro de cabra a 2% (diluição 1: 200) foi adicionada a cada amostra. Após a coloração na obscuridade à temperatura ambiente durante 30 minutos, 1 mL de PBS foram adicionados a cada tubo para lavar o excesso de anticorpos. Após centrifugação a 2000 rpm durante 5 min, o sobrenadante foi removido e os sedimentos celulares foram ressuspensos e preservados em 500 ul de 1% de PFA, a uma densidade celular não menos de 4x10e5 células /ml para citometria de fluxo de análise em FACSCanto II Citómetro de fluxo (BD Biosciences, Bedford , MA). Foram analisados ​​10000 eventos de cada amostra. Os resultados foram analisados ​​com fluxo Software 2.5.1.

Histologia e imunohistoquímica de microesferas NBC-MSC-colágeno

microesferas NBC-MSC-colágeno foram fixados em 4% PFA à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos e foram desidratados usando um tratamento de etanol gradiente de série antes do tratamento para cortes de parafina de espessura 5m. Rotina hematoxilina-eosina (Sigma) foi realizado para revelar a morfologia das células nas microesferas. Para avaliar a presença de NBCs, um anticorpo primário (ab49501, Abcam) foi usado. Anti-ratinho de anticorpo secundário (BA-1000, Vector Laboratories) foi usado em imuno-histoquímica, seguido por coloração com ABC, rotulagem diaminobenzidina, e contracoloração utilizando hematoxilina. Para avaliar a presença de colagénio do tipo I, um anticorpo primário (C2456, Sigma), foi utilizado. Anti-ratinho de anticorpo secundário (BA-1000, Vector Laboratories) foi usado em imuno-histoquímica, seguido por coloração com ABC, rotulagem diaminobenzidina, e contracoloração utilizando hematoxilina. Para avaliar a presença de matriz-metaloproteinase 9, um anticorpo primário (ab38898, Abcam) foi usado. anticorpo anti-coelho secundário (BA-2000, Vector Laboratories) foi usado em imuno-histoquímica, seguido de coloração ABC, rotulagem diaminobenzidina, e contracoloração com hematoxilina.

A análise dos dados e estatísticas

Os resultados quantitativos, incluindo dimensão de microsferas, o número de células e as proporções NBC foram apresentados como média ± desvio padrão, se não indicado de outra forma. Two-way ANOVA com testes post hoc apropriada foram usadas para revelar diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes grupos. O nível de significância foi fixado em 0,05 e SPSS 19.0 (IBM, NY, EUA) foi usado para executar a análise estatística.

Resultados

Caracterização morfológica de microesferas NBC-MSC-colágeno

Fig 1A1-1E6 mostra a aparência bruta de microesferas NBC-MSC-colágeno em grupos diferentes. As aparências esféricas foram semelhantes no início da cultura, mas tornou-se diversificada em fase posterior, como microesferas em grupos com maior proporção inicial NBC gradualmente perde a sua forma esférica e tornou-se irregular na conformação, sugerindo crescimento excessivo. Durante a cultura, pequenos micro-suspensão em massas foram observados em NBC 100%, 80% e 50% de grupos após a primeira semana. Enquanto no grupo NBC 20%, massas observáveis ​​apareceu após a segunda semana. O grupo NBC 80% tinha relativamente maior quantidade de micro-massas que nos outros grupos. Não houve crescimento excessivo micro-massas na NBC grupo 0% (100% do grupo MSC). A Fig 1F mostra a alteração na dimensão das microesferas durante a cultura. Houve contracção significativa das microesferas na primeira semana para todos os grupos, seguida por aumentos de diâmetro em todos os grupos de células de cancro contendo, sugerindo o crescimento tumorigénico. No entanto, a fusão e a agregação de microesferas são observados. O gráfico também mostra que o grau de contracção e o alargamento é dependente do teor de NBCs. Todos os grupos, excepto o% um NBC 100 drasticamente diminuído em tamanho, no primeiro dia após o encapsulamento. Microesferas contendo MSCs saudáveis ​​única (NBC 0%) cair continuamente em tamanho ao longo do tempo. O grupo NBC 20% mostrou uma dimensão constante após a queda inicial em tamanho, enquanto os grupos com 50% ou mais NBCs começou a aumentar de tamanho ao fim de 7 dias, sugerindo que o crescimento rápido das células de tumor. ANOVA two-way mostrou que tanto o factor de tempo (p 0,001) e a NBC: MSC proporção (p 0,001) afectou significativamente a dimensão das microesferas. Bonferroni testes post hoc mostrou que, além da day1-dia14 (p = 0,518) eo day3-day7 (p = 1,000) pares, todas as outras comparações foram estatisticamente significativamente diferente dos outros (p 0,001), enquanto todos os NBC: grupos relação MSC foram estatisticamente significativamente diferente dos outros (p 0,001)

As microesferas com diferentes percentuais de NBCs e, portanto, NBC:. rácios MSC: (A): 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (20% MSC) e (E): 100% NBC (0% MSC) foram cultivados durante diferentes períodos de tempo: 0 (A1, B1, C1, D1, E1); 1 (A2, B2, C2, D2, E2); 3 (A3, B3, C3, D3, E3), 7 (A4, B4, C4, D4, E4), 14 (A5, B5, C5, D5, E5) e 21 (A6, B6, C6, D6, E6 ) dias (barras de escala: 100? M: A2, A3, A4, A5, A6, B2, B3, B4, B5, B6, C2, C3, C4, C5, D2, D3, D4; 500 uM: A1, D5, E3, E4, E6; 1,000 uM: B1, C1, C6, D1, D6, E1, E2, E5); (F): gráfico de linhas que mostra a mudança temporal na dimensão (média ± 1DP) das populações de microesferas NBC-MSC-colágeno durante culturas

As alterações morfológicas de microesferas NBC-MSC-colágeno no diferente. NBC: rácios MSC, pontos de tempo, a densidade celular inicial e da concentração de colagénio

Figura 2 mostra a H e coloração das microesferas NBC-MSC com colagénio com diferentes rácios de encapsulamento e em diferentes pontos de tempo durante a cultura. O grupo 0% NBC (pura MSC) mostrou estruturas cada vez mais compactos com MSCs distribuídos aleatoriamente por até 2 semanas (Fig 2A1 e 2A2), enquanto a maioria das microesferas mostrou atrito completa aos 21 dias de cultura. Grupos com o aumento da NBC: rácios de MSC (20, 50 e 80%) (Fig 2B1-2D3) apresentou uma tendência semelhante que eles segregadas em duas camadas diferentes de tecidos. Em breve, aos 7 dias de cultura, uma camada de células embalados nos arredores de microesferas de colágeno no qual as células com densidade mais baixa estavam presentes (Fig 2B1, 2C1 e 2D1). No grupo NBC 20%, parece haver uma maior proporção de células com morfologia alongada em 7 dias (Fig 3B1) enquanto que as células relativamente arredondadas com uma densidade celular elevada e baixa densidade matriz eram dominantes nos pontos de tempo posteriores (Fig 2B2 e 2B3) . Além disso, as massas de micro-tecidos eram ainda em grande parte de forma esférica. No grupo NBC 50%, as formas das micro-massas foram populações de células irregulares e densidade elevadas parece superar a microesfera de colagénio e mais células invadidas nas microesferas de colagénio no momento da crescente (Fig 2C1-2C3). No grupo NBC 80%, uma fina camada de células de alta densidade era de encapsulação das microsferas, que contém muitos aglomerados celulares e “vazios” Aos 7 dias de cultura (Fig 2D1). Aos 14 e 21 dias, as estruturas foram altamente irregulares na forma e altamente poroso com células compactadas a uma densidade elevada em toda a estrutura, enquanto as microesferas de colagénio parece ser desintegrado (Fig 2D2 e 2D3). Uma visão ampliada da Fig 2D3 mostrou claramente a camada de células de alta densidade e na região menos densa (Fig 2F). No grupo NBC 100%, a estrutura foi ainda esférica mas altamente compactada a 7 dias (Figura 2E1), enquanto as microesferas de colagénio foram completamente dilacerada em pontos de tempo posteriores com estruturas altamente porosas e irregulares com baixa densidade celular (Fig 2E2 e 2E3) .

(A): 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (30% MSC); (E): 100% NBC (0% MSC). A1, B1, C1, D1, E1: dia 7; A2, B2, C3, D2, E2: dia 14; B3, C3, D3, D3a, E3: 21 dias após a cultura (Barras de escala: 100 mm)

(A1-A3):. 1250 células /microesfera; (B1-B3): 2500 células /microesfera; (C1-C3): 5000 células /microesfera; 1: 7 dias; 2: 14 dias; 3: 21 dias (barras de escala: 100 mm)

Figura 3 mostra a H E coloração das microesferas NBC-MSC-colágeno em diferentes densidades celulares de encapsulamento quando a NBC foi fixada em 80%.. A 1250 células por microesfera, células parece ser encapsulado dentro da microesfera de colagénio, enquanto uma camada fina de células coberto a periferia da microesfera no ponto de tempo precoce (7 dias) (Fig 3A1) mas em pontos de tempo posteriores, excrescências celulares irregulares foram encontrados deixando apenas muito poucas células no interior da microesfera (Fig 3A2 e 3A3). A densidades celulares mais elevadas (2500 e 5000 células por microesfera), vazios óbvias foram encontrados nas microesferas de colagénio com células densamente compactadas em excrescências de forma irregular em torno da microesfera aos 7 dias (Fig 3B1 e 3C1). . Em pontos de tempo posteriores, as excrescências tornou-se maior e mais poroso (Fig 3B2, 3B3, 3C2 e 3C3)

Figura 4 mostra a H E coloração das microesferas NBC-MSC-colágeno com diferentes concentrações de colágeno. Uma concentração mais elevada de colagénio parece encapsular as células melhor dentro da microesfera, enquanto uma camada fina de células estavam a crescer na periferia da microesfera (Fig 4B1). Aos 14 dias, crescimento irregular maciça e foi encontrado no grupo de menor concentração de colagénio (Fig 4A2) mas colónias densas de células e vazios foram encontrados dentro das microesferas na concentração mais elevada de colagénio (Fig 4B2).

(A ): /1 mg ml; (B): 2 mg /ml; 1: 7 dias; 2: 14 dias (barras de escala: 100 m).

A cinética do crescimento em microesferas NBC-MSC-colágeno

Figura 5A mostra o gráfico de linha em o número de células na NBC-MSC -collagen microesferas com diferentes NBC: rácios MSC em diferentes pontos de tempo durante a co-cultura. Microesferas com 0% NBC, ou seja, 100% MSCs mostraram uma queda contínua no número de células. Por outro lado, todos os grupos que contêm células cancerosas mostrou um crescimento positivo ao longo do tempo. O grupo 20% mostraram aumento gradual nas primeiras 2 semanas e todos em um súbito dramaticamente o número aumentado exponencialmente no dia 21. O grupo NBC 100% (0% MSC) apresentaram aumento significativo em culturas iniciais no dia 7 do que outros grupos, mas que não forneceu esse grupo qualquer outra vantagem de crescimento em dias posteriores. Tendências semelhantes foram encontradas nas NBC 50% e 80%: grupos MSC. ANOVA two-way mostrou que tanto o factor de tempo (p 0,001) e a NBC: factor de proporção MSC (p 0,001) afectou significativamente o número de células. Bonferroni testes post hoc mostraram que 0% NBC (100% MSC) significativamente diferente de todos os outros grupos (p = 0,003). O grupo NBC 20% mostrou diferenças significativas de 0% (P = 0,003), 80% (p = 0,033) e 100% (p = 0,008), respectivamente. O grupo 50% NBC, e a 80% e depois 100% não foram significativamente diferentes entre si (p = 0,342). A NBC 100% só mostrou diferença significativa a partir do 0% e 20% NBC: rácios MSC (p = 0,008). Curiosamente, começando com o mesmo número de células, o grupo NBC 20% mostrou uma muito menor (~ 2 dias) o tempo de duplicação, o qual mede o tempo necessário para que a população de células a dobrar-se, em comparação com maior NBC: rácio MSC (Figura 5B ). O grupo 0% NBC (100% MSC) não houve crescimento, enquanto a NBC 100% (0%) mostrou muito menor tempo de duplicação ( 6 dias).

No dia 7, dia 14 e dia 21, 200 microesferas foram digeridos para contar o número de células. (A): Crescimento curvas cinéticas mostrando as alterações no número de células ao longo do tempo em diferentes razões de encapsulação (média ± 1SD); (B):. População tempo de duplicação para diferentes grupos

mudança temporal no percentual de NBC nas microesferas

Figura 6A mostra as percentagens de NBCs entre grupos diferentes ao longo do tempo. No grupo NBC 20%, a percentagem de NBCs foram mantidas a cerca de 20% no dia 7 e 14, mas aumentou dramaticamente para 33% no dia 21 (Figura 6A). Por outro lado, 50% e 80% de grupos NBC mostrou nível semelhante de NBCs ao longo do tempo. Figura 6C mostra o histograma representativo do fluxo de enumeração citometria-base do NBCs em diferentes grupos. Figura 6B mostra a percentagem de NBCs calculados a partir de dados obtidos por citometria de fluxo. Two-Way ANOVA mostrou que a NBC: fator de relação MSC (p 0,001) afetou significativamente a percentagem de NBC horas extras, mas não o fator tempo (p = 0,85). Bonferroni post hoc testes mostraram que o grupo NBC 20% significativamente diferente de 50% (p 0,001) e 80% (p 0,001), respectivamente. O grupo NBC 50% e os 80% não foram significativamente diferentes entre si (p = 0,366)

(A):. Erro gráficos de barras que mostram a percentagem de NBCs determinado através de citometria de fluxo (média ± 1DP); (B): quadro com a percentagem média de NBCs em grupos diferentes e em momentos diferentes; (C): células histograma mostrando representativos coradas com anticorpo de controlo de isotipo e as células foram coradas com anticorpo NB84a em diferentes grupos em diferentes momentos

A imuno-histoquímica do colágeno tipo I

Figura 7. mostra a análise imuno-histoquímica do colágeno tipo I nas microesferas NBC-MSC-colágeno. No grupo 0% NBC (100% MSC), o colagénio do tipo I de microsferas permaneceram positivos esférica, embora ele se torna mais porosa aos 14 dias (Figura 7A e 7B). Nos grupos NBC 20%, a microesfera estava intacto no dia 7, mas começou a ser decomposto no dia 14 e foi quase completamente decomposto no dia 21 (Figura 7B2 e 7B3). Para o grupo NBC 50%, das microesferas estavam ainda intactos ao dia 7 (Fig 7C1) mas mais porosa em pontos de tempo posteriores (Fig 7C2 e 7C3). Esta tendência foi semelhante no grupo NBC 80% (figura 5B). Colagénio do tipo I, as células que expressam e que sejam susceptíveis de ser MSCs, foram principalmente confinados dentro das microesferas embora algumas foram identificadas ocasionalmente na excrescência fora das microesferas (Figura 7F e 7G)

(A):. 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (30% MSC); (E): 100% NBC (0% MSC). A1, B1, C1, D1, E1: dia 7; A2, B2, C3, D2, E2: dia 14; B3, C3, D3, D3a, E3: 21 dias após a cultura (Barras de escala: 100 mm).

A imuno-histoquímica de MMP9

Figura 8 mostra a coloração imuno-histoquímica de MMP9 do microesferas NBC-MSC-colágeno com fixo de 80% NBCs e com diferentes densidades celulares e concentrações de colágeno. As regiões de colagénio mostraram coloração positiva enquanto que as células que expressam MMP9 foram encontrados tanto no crescimento fora e as camadas periféricas de massas celulares (Fig 8A1, 8B1, 8C1 e 8b2)

(A):. 5000 células /ml; (B): 2500 células /ml; (C): 1250 células /ml; 1: 0,5 mg /ml; 2: 1 mg /ml; 3: 2 mg /ml (barras de escala: 100 m).

Discussão

Em modelos de cancro in vitro

A fim de acelerar o rastreio de drogas pré-clínicos e para alcançar personalizado medicina, no futuro, o desenvolvimento da doença ou em modelo in vitro específico do paciente são de grande importância [54]. Como discutido acima, os modelos monocamada 2D convencionais estão sendo criticado por seu ambiente de cultura não-fisiológica e eles não são capazes de recapitular a condição in vivo, portanto, a produção de dados não confiáveis. Com o avanço no campo da engenharia de tecidos, a utilização de um modelo tridimensional in vitro em tumores que imitam é cada vez mais populares. [55-57]. Uma questão importante no fabrico de um modelo in vitro seria a escolha de biomateriais, que pode ser de origem natural ou sintetizado artificialmente. Numerosos estudos têm mostrado resultados promissores utilizando biomateriais naturais, como colágeno, fibrina, Matrigel [58] e ácido hialurônico. Com a sua pronta disponibilidade, facilidade de uso e alta bioatividade, são escolhas populares e atraentes para os investigadores. O colagénio tem uma excelente biocompatibilidade e imunogenicidade negligenciável. Estas propriedades permitem aos cientistas usar colágeno como um material adequado para in vitro modelo de câncer. No entanto, a facilidade de degradação, a composição da matriz indefinido e propriedades mecânicas fracas são os seus problemas. Além disso, a grande heterogeneidade do lote para lote da composição torna a comparação entre os diferentes estudos muito difíceis. Por outro lado, os materiais sintéticos, tais como PA, poliéster, o PEG possui parâmetros ajustáveis ​​e permitem um controlo mais preciso de propriedades do material [59], que conduz a uma menor complexidade, elevada reprodutibilidade e comparabilidade entre diferentes estudos. No entanto, alguns deles são tóxicos e que requerem passos de processamento mais sofisticados, antes de poderem ser utilizados para a modelação. hidrogel à base de PEG, por exemplo, tem uma estrutura não fibrilar e requer ou processos de reticulação químicos ou físicos [60-62]. Estes iria afectar o comportamento celular e a facilidade de utilização quando comparados com os polímeros naturais tais como colagénio. Na verdade, um biomaterial universal adequado para todos os modelos de doenças não existe.