Abstract

Fundo

Excluídos no câncer de fígado 1 (DLC1) serve como uma importante proteína proteína ativadora RhoGTPase (RhoGAP) que termina RhoA activa sinalização em cancros humanos. Evidências crescentes demonstrou que a actividade supressora do tumor de DLC1 não depende apenas da actividade RhoGAP, mas também depende de localização adequada adesão focal através da sua interacção com proteínas da família da angiotensina. Recentemente, há relatórios mostrando que DLC1 também pode ser encontrado no núcleo; no entanto, a existência ea atividade supressora de tumor relativa de DLC1 nuclear nunca foram claramente abordada.

Metodologia e principais conclusões

Nós aqui apresentar novas provas de que a proteína DLC1, que predominantemente associado com adesões focais e localizada no citosol, Transportado dinamicamente entre citoplasma e núcleo. O tratamento de células com nuclear bloqueador de exportação, Leptomycin B (LMB), DLC1 retidos no núcleo. Para compreender a entrada nuclear DLC1, foram identificados os aminoácidos 600-700 da região DLC1 como um romance que é importante para a sua localização nuclear. A actividade supressora de tumor de DLC1 nuclear foi diretamente avaliada empregando uma variante sinal de localização nuclear (NLS) fusão de DLC1 (NLS-DLC1) com localização nuclear preferencial. Em células de carcinoma hepatocelular SMMC-7721, a expressão de NLS-DLC1 não conseguiu suprimir a formação de colónias e estresse actina formação das fibras

in vitro

. A atividade supressora de tumor revogada de DLC1 nuclear foi demonstrada pela primeira vez

in vivo

por p53 injecção subcutânea

– hepatoblasts RasV12 com expressão NLS-DLC1 estável em camundongos nus – /. Os hepatoblasts injetados com expressão NLS-DLC1 tumores efetivamente formado quando comparado com o DLC1 alvo não-nuclear.

Conclusões /Significado

Nosso estudo identificou uma região nova responsável pela entrada nuclear de DLC1 e demonstrou a diferença funcional de DLC1 em diferentes compartimentos celulares ambos

in vitro

e

in vivo

Citation:. Chan LK, Ko FCF, Sze KM-F, Ng IO -L, Yam JWP (2011) Nuclear segmentadas eliminados no cancro do fígado 1 (DLC1) é menos eficiente em exercer o seu tumor supressora Atividade ambos

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 6 (9): e25547. doi: 10.1371 /journal.pone.0025547

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de junho de 2011; Aceito: 06 de setembro de 2011; Publicação: 26 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Chan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Hong Kong Bolsas de Investigação (HKU7798 /07M), Hong Kong Bolsas de Investigação Fund Research Collaborative Conselho (HKU 1 /06C e HKU 7 /CRG /09) eo Prêmio Jovem Pesquisador Outstanding (a JWP Yam). I.O.L. Ng é Loke Professor Yew em Patologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

eliminados em cancro do fígado 1 (DLC1) foi clonado pela primeira vez por hibridação subtractiva como um fragmento do gene que foi suprimida frequentemente no carcinoma hepatocelular humano (HCC) [1]. Evidências acumuladas na última década tem apoiado que DLC1 é underexpressed em vários tipos de cancros humanos além HCC [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Restauração de DLC1 pela expressão ectópica em células com baixa ou nenhuma expressão endógena de DLC1 retarda a proliferação celular, induz a apoptose, desacelera o movimento celular e se desintegra estrutura de actina do citoesqueleto

in vitro

[8], [9], [10 ]. Por outro lado, DLC1 knockdown promove tumorigênese de um

in vivo

modelo de hepatocarcinogênese do mouse Myc conduzido com um fundo p53 nulo [11]. A natureza da subexpressão patológica freqüente de DLC1 ea atividade supressora de tumor experimental robusto tanto apoiar fortemente funções DLC1 como um

bona fide

supressor de tumor.

A actividade supressora de tumor de DLC1 está fortemente ligada à a sua actividade intrínseca RhoGAP, que regula negativamente a resposta biológica mediada pela Rho-. DLC1 foi encontrado para ser RhoA-, B, C e específica CDC42-[12], [13]. Adesão focal de localização através da interacção com a proteína da família tensina é uma das características de DLC1 e está funcionalmente associado com a sua actividade supressora de tumor. Este foi apoiada pela evidência de que mutante DLC1 com o domínio RhoGAP intacta, mas não conseguiu ser direcionados para as adesões focais exibiram atividade de crescimento supressiva reduzida

in vitro

[10], [14]. Desde a adesão focal alvejando sites em sobreposição DLC1 com o local de ligação da proteína angiotensina, tem sido aceito que os casais DLC1 com angiotensina e funciona como complexo supressor de tumor em que encerra a atividade Rho associada à adesão focal [10], [14], [15 ].

Um estudo recente sugeriu a presença de resíduos básicos motivo rico em DLC1 parecido com o NLS [16]. Além disso, tem sido sugerido que a serina /treonina-quinase específica proteína D fosforila DLC1 para criar um local de ancoragem 14-3-3. A formação do complexo com 14-3-3 sequestra DLC1 no citoplasma e pára a sua entrada nuclear [17]. No entanto, a existência e regulação do DLC1 nuclear não foram totalmente exploradas. Mais importante ainda, a actividade supressora de tumor relativo de DLC1 nuclear nunca foi diretamente dirigida. Neste estudo, nós fornecemos evidências abrangente que a proteína DLC1 shuttles constantemente entre o citoplasma e núcleo. Efetuamos a primeira caracterização funcional de DLC1 alvo nuclear para examinar sua atividade básica e tumor supressora ambos

in vitro

e

in vivo

. Ao estudar a localização subcelular de vários mutantes DLC1, nós identificamos uma região romance dentro do domínio RhoGAP o que é importante e suficiente para esta importação nuclear.

Resultados

DLC1 transportados entre citoplasma e núcleo

a expressão de DLC1 marcada com myc (Myc-DLC1) em células SMMC-7721 revelou sua existência em adesões focais, citoplasma e núcleo (Fig. 1A). análise quantitativa da expressão DLC1 em células mostrou sua localização citoplasmática dominante com pontuada padrão de adesão focal na periferia celular. Para explorar o movimento de DLC1 entre o citoplasma e o núcleo, localização Myc-DLC1 nas células foi estudada em células tratadas com bloqueador exportina, LMB. O tratamento com LMB resultou na retenção nuclear de Myc-DLC1 em células BEL7402 SMMC-7721 e (Fig. 1B,

painel esquerdo

). Notavelmente, adesão focal DLC1 localizada ainda foi observada, implicando apenas o não-adesão focal DLC1 localizada foi transportado e retido no núcleo. fracionamento celular corroborou ainda mais a presença de DLC1 na fração nuclear de lisado celular (Fig. 1B,

painel direito

). observação similar foi obtido com DLC1 GFP (GFP-DLC1) (dados não mostrados). O movimento dinâmico de DLC1 foi observado sob a retirada de LMB em diferentes pontos de tempo (Fig. 1C). Re-padronização de aderência citoplasmática e focal foi ocorreu dentro de 24 horas. Nós alargado a nossa investigação examinando a localização de DLC1 endógena em várias linhas celulares. fraccionamento subcelular de Hep3B, HLE e células SK-HEP1 seguido por imunotransf erência usando anticorpos específicos de DLC1 suporta a presença de DLC1 no núcleo (Fig. 1D). Imunofluorescência para DLC1 endógeno em células SK-HEP1 mostrou localização subcelular semelhante no citoplasma e no núcleo (Fig. 1E). Consistentemente, DLC1 endógeno em Hep3B foi retido no núcleo após tratamento LMB (Fig. 1F). Para apoiar a noção de que shuttles DLC1 entre citoplasma e núcleo sob condição fisiológica, foi realizada imuno-histoquímica contra DLC1 em um fígado não-neoplásica humana (Fig. 1G). DLC1 coloração positiva foi detectada tanto em citoplasma e núcleo, apoiando ainda mais que DLC1 está presente no núcleo

.

(A) células SMMC-7721 foram transientemente transfectadas com DLC1 marcada com myc. DLC1 foi visualizado com um anticorpo anti-Myc seguidos por anticorpo secundário conjugado com FITC. Núcleo foi contrastadas com DAPI. padrão de localização subcelular de DLC1 de 241 células transf ectadas foi DLC1 contados e classificados em grupos A a E, como indicado. (B) SMMC-7721 e BEL7402 células foram transfectadas transientemente com DLC1 marcada com myc e submetido a tratamento LMB seguido por coloração por imunofluorescência com anticorpo anti-Myc (

esquerdo do painel

). As células transfectadas foram fracionados em porções citoplasmáticos e nucleares seguido por immunoblotting contra Myc para DLC1 exógena, tubulina (marcador citoplasmático), LaminB e c-jun (marcador nuclear) (

painel direito

). células (C) SMMC-7721 foram transientemente transfectadas com DLC1 marcada com myc, seguido por tratamento LMB durante 6 horas. Após o tratamento LMB (que foi designado como t = 0), as células foram cultivadas com meio fresco e foram fixadas no ponto de tempo indicado. DLC1 exógeno foi visualizado pelo anticorpo anti-myc. (D) Hep3B, células HLE e células SK-HEP1 foram fraccionados em porções citoplasmática e nuclear seguido por imunotransf erência utilizando anticorpos contra DLC1 endógena, tubulina, LaminB e C-junho (E) DLC1 endógena em células SK-HEP1 foi visualizado por anticorpo anti-DLC1 policlonal, seguido pelo anticorpo secundário conjugado com FITC. Para servir como controle negativo, as células SMMC-7721 sem expressão DLC1 foi corado com o anticorpo anti-DLC1 polycloncal. O anticorpo DLC1 só poderia detectar o sinal em células SMMC-7721 com superexpressão DLC1 exógeno, mas não as células não transf ectadas. células (F) Hep3B foram tratados com LMB durante 6 horas. DLC1 endógena foi então visualizadas por anticorpo anti-DLC1 policlonal, seguido pelo anticorpo secundário conjugado com FITC. (G) Uma seção de fígado não-neoplásica humana foi histoquímica para DLC1 (Brown). Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina (azul). As células que apresentam coloração DLC1 nuclear positiva foram indicadas pelas setas sólidas cabeças. núcleo celular, mostrando coloração DLC1 negativa foi indicado pelas setas de cabeça vazia. Barra de escala:. 10 um

DLC1 600-700 resíduos cooperado com NLS na regulação da DLC1 entrada nuclear

As proteínas de grande tamanho molecular possuem sinais de transportes nucleares para o transporte activo através da envelope nuclear com o auxílio do complexo transporte nuclear. Tem sido proposto que um NLS monopartite (423-431) [17] e NLS bipartida (415-431) [16] estão presentes em DLC1 que facilitam a entrada nuclear DLC1. Para abordar especificamente a localização de DLC1 sem as NLS propostas sobre o tratamento LMB, construímos DLC1Δ415-431 mutante que falta precisamente o NLS proposta (Fig. S1A e S1B). Expressão de DLC1Δ415-431 em células SMMC-7721 mostrou a mesma localização subcelular como DLC1 tipo selvagem. Surpreendentemente, foi ainda DLC1Δ415-431 sensíveis ao tratamento LMB e foi retido no núcleo de forma tão eficaz como o tipo selvagem DLC1 (Fig. S1C). Também tem sido relatado que a fosforilação em serina-431 (S431) de DLC1 pela proteína cinase D (PKD) [17] facilita a ligação entre DLC1 e 14-3-3 proteínas, evitando assim a entrada nuclear de DLC1. No entanto, descobrimos que DLC1 S431 mutante fosfo-defeituoso, S431A mostrou grau semelhante de retenção nuclear após o tratamento LMB (Fig. S1D). Tomados em conjunto, não poderíamos fornecer provas suficientes para apoiar a funcionalidade do NLS proposto, bem como o papel do S431 fosforilação na regulação do transporte nuclear de DLC1.

Nós questionou se, além do motivo alvo nuclear sugeriram pelos outros, a região adicional na DLC1 está envolvida na localização nuclear de DLC1. Para resolver esta questão, que clonados e expressos mutantes de deleção GFP-DLC1 e analisou a sua localização após o tratamento LMB em células HeLa (Fig. 2A). Descobrimos que DLC1 Δ292-646 mutante de deleção interna mostrou uma redução significativa da localização nuclear após o tratamento LMB (Fig. 2B e 2C). Por outro lado, a retenção nuclear de DLC1 1-807 mutante de deleção C-terminal não foi afectada quando comparada com o tipo selvagem após tratamento DLC1 LMB. Curiosamente, 1-807 mutante que continha a adesão focal proposta região de direccionamento (região 200-500) [18] não podia ser eficientemente direcionados para adesões focais e difusamente expressa no citoplasma

.

(A) Diagrama esquemático mostrando a estrutura de DLC1 de tipo selvagem (WT DLC1) e seus mutantes de deleção (Δ292-646 e 1-807). (B) As células HeLa foram transitoriamente transfectadas com a expressão DLC1 GFP constrói como listado em (A), seguido por tratamento LMB. adesões focais foram contra-coradas com anticorpo anti-vinculina. A localização subcelular de DLC1 foi gravado por contagem de pelo menos 100 células transfectadas por amostra. (C) Gráfico de barras que resume a localização subcelular de DLC1 e seus mutantes, em (B), com ou sem o tratamento LMB. Os resultados representam uma duplicata de dois experimentos independentes. As percentagens de DLC1 positiva de adesão focal em grupo individual também foram destacados.

Foi proposto que a região N-terminal de DLC1 regula negativamente a sua entrada nuclear [16]. Uma série de potencial sinal de exportação nuclear (NES) foi mapeado no 62-71, 764-773 e 792-801 resíduos de DLC1 pelo

in silico

pesquisa (Fig. S2A). A importância destas sequências de sinal na regulação da localização citoplasmática foi então avaliado por imunofluorescência. A funcionalidade do NES em 764-773 e 792-801 resíduos foram excluídos pela expressão citoplasmática de 1-291 e 1-400 mutantes (Fig. S2B). Desde 609-paragem e 648-839 mutantes apresentaram melhorado de localização nuclear, o papel de NES em 62-71 resíduos foi ainda analisado através da criação de um DLC1 Δ62-71 mutante. Este mutante DLC1 mostraram característica de localização de adesão focal semelhante ao do tipo selvagem, sem mostrar qualquer aumento na retenção nuclear (Fig. S2B). Para clarificar a ausência de retenção nuclear não foi devido à forte associação de adesão focal, DLC1 1-807Δ62-71, um mutante não se localize nos adesões focais foi expressa. No entanto, este mutante também foi encontrada para ser localizada predominantemente no citoplasma. Tomados em conjunto, descobrimos que a remoção dos NES previstos no N-terminal de DLC1 não afetou sua distribuição nucleocitoplasmático.

Depois de destacar a região de direccionamento nuclear para a região do centro de DLC1, foi realizada a primeira localização detalhada a análise de um painel de mutantes de GFP-DLC1 (Fig. 3A). Curiosamente, verificou-se que a expressão do mutante 350-807 mostraram uma localização nuclear predominante. Semelhante localização nuclear proeminente foi observado em Myc-DLC1 291-807 (dados não mostrados). Exame de 600-807 mutante revelaram a localização nuclear semelhante, enquanto 700-807 mutante localizada em ambos citoplasma e núcleo das células HeLa (Fig. 3B e 3C). O aumento de localização nuclear de 600-807 mutante também foi apoiado pela expressão DLC1 mais forte na fracção nuclear, obtido no ensaio de fraccionamento bioquímico quando comparado com os outros mutantes DLC1 (Fig. 3D). Tomados em conjunto, descobrimos que a região DLC1 600-700 no domínio RhoGAP também estava envolvido na entrada nuclear de DLC1.

(A) Diagrama esquemático mostrando a estrutura de um painel de fragmentos DLC1 encerrado no aminoácido 807 e uma série de DLC1 mutantes de deleção interna para mapear o local chave de segmentação nuclear. As estruturas de tipo selvagem e DLC1 Δ292-646 também foram listados para comparação. (B) As células HeLa foram transfectadas transitoriamente com as construções de expressão DLC1 GFP indicados. adesões focais foram contra-coradas com anticorpo anti-vinculina. A localização subcelular de DLC1 foi gravado por contagem de pelo menos 100 células transfectadas por amostra. gráfico (C) Barra resume a percentagem de células com localização citoplasmática e nuclear de DLC1 e seus mutantes, em (B). Os resultados representam uma duplicata de dois experimentos independentes. (D) As células HeLa foram transfectadas transitoriamente com as construções de expressão indicados GFP DLC1 seguido de fraccionamento subcelular. Os lisados ​​nucleares e citoplasmáticos foram fraccionados submetida a imunotransf erência com anticorpos contra GFP, tubulina (marcador citoplasmático) e c-jun (marcador nuclear). células (E) HeLa foram transfectadas transitoriamente com as construções de expressão DLC1 GFP indicados, seguido por tratamento LMB. gráfico (E) Barra resume a percentagem de células com localização citoplasmática e nuclear de DLC1 e seus mutantes em (D). Os resultados representam uma duplicata de dois experimentos independentes. Barra de escala:. 10 um

Para confirmar ainda mais a importância desta região novela, que foi excluído região 601-689 em DLC1 e avaliou a sua localização. Curiosamente, encontramos uma redução acentuada na localização nuclear de DLC1Δ601-689 mutante após tratamento LMB (Fig. 3E e 3F). Como demonstrado pelo mutante Δ415-431Δ601-689 em que o relatado anteriormente NLS e nosso site mapeados foram excluídos, a exclusão de 415-431 não reduziu ainda mais a retenção nuclear muito após o tratamento LMB. Os nossos resultados sugerem que o novo sítio mapeado desempenha um papel importante no direccionamento para o núcleo DLC1.

DLC1 Nuclear perdeu a sua actividade inibidora na supressão da formação de colónias e de fibras de stress de actina formação

In vitro

Até o momento, não há nenhum estudo avaliando a associação funcional direta entre localização nuclear e a função biológica do DLC1. Para medir a capacidade funcional de DLC1 nuclear

in vitro

, criamos e confirmou a expressão de um DLC1 alvo nuclear (NLS-DLC1) (Fig. 4A e 4B). Por imunofluorescência, confirmamos que NLS-DLC1 foi predominantemente localizada no núcleo das células SMMC-7721. Um NLS-driven mutante DLC1 RhoGAP, NLS-K714E também pode ser encaminhada para o núcleo de forma tão eficiente como a DLC1 de tipo selvagem (Fig. 4C). Em seguida, examinou a integridade das fibras de stress de actina em células SMMC-7721 transientemente transfectadas por estes mutantes. Ao contrário da desmontagem das fibras de stress de actina nas células transfectadas DLC1, NLS-DLC1 só poderia suprimir parcialmente a formação de fibras de stress de actina (Fig. 4D). Como controlo negativo, as células transfectadas com K714E DLC1 exibida fibras de stress de actina intactas. padrão similar foi observado em células que expressam NLS-K714E apoiando ainda mais que o nosso sistema de encaminhamento nuclear não exerceu efeito não específica na formação de fibras de stress de actina. RhoGAP actividade de DLC1 tem sido mostrado para ser estreitamente associada com a sua actividade supressora do crescimento. Em seguida, realizada ensaio de formação de colónias para avaliar o

In vitro

actividade supressora do crescimento de NLS-DLC1 em ambas as células HeLa SMMC-7721 e (dados não mostrados). De acordo com o efeito sobre a formação de fibras de stress, NLS-DLC1 mostrou atividade de crescimento supressiva largamente reduzido quando comparado com DLC1 (Fig. 4E) Tomando em conjunto, descobrimos que DLC1 nuclear capacidade de suprimir o crescimento celular perdido.

( a) diagrama esquemático que mostra a estrutura do DLC1 alvo nuclear (NLS-DLC1) utilizado para a experiência de expressão transitória. A sequência de ADN que codifica o NLS monopartite que consiste em cinco aminoácidos básicos KKKRK foram inseridos em frente da grelha de leitura aberta de DLC1 marcada com myc. A tradução da construção de expressão manipulada codificados marcada com myc-NLS DLC1. (B) Os lisados ​​HEK293T com sobre-expresso DLC1 marcada com myc ou NLS-DLC1 foram coradas imunologicamente com o anticorpo anti-myc. células (C) SMMC-7721 foram transientemente transfectadas com o tipo selvagem DLC1 indicado ou construções do mutante RhoGAP (K714E). A proteína marcada com myc foi visualizado por anticorpo anti-Myc seguidos por anticorpo secundário conjugado com FITC. A localização subcelular de DLC1 foi gravado por contagem de pelo menos 100 células transfectadas por cada amostra. gráfico de barras que indica a percentagem de células com coloração nuclear DLC1. Os resultados representam uma duplicata de dois experimentos independentes. (D) As células SMMC-7721 foram transfectadas transitoriamente com as construções DLC1 marcada com myc indicados e as fibras de stress de actina foram coradas com faloidina-TRITC conjugado de 1 hora após a indução do soro. O asterisco (*) assinala as células transfectadas com DLC1. (E) Gráfico de barras mostrando a eficiência da formação de colónias de células em relação SMMC-7721 ser transfectadas com as construções indicadas DLC1 e pEGFP-C1 vector que transporta o gene de resistência à neomicina em relação 10:01. As células transfectadas foram seleccionadas com G418 durante 2 semanas. As colónias formadas foram visualizadas por coloração com violeta de cristal e quantificado. foi encontrada a diferença média entre o grupo indicado como sendo estatisticamente significativa (***

P Art 0,005; não pareado

t

-teste). Barra de escala: 10 mm

DLC1 Nuclear não suprimiu

in vivo

tumorigenicidade

Para avaliar a actividade supressora de tumor de DLC1 nuclear

In vivo

, foi realizada expressão retroviral estável de alvo DLC1 rato marcada com myc nuclear em uma p53 nulos hepatoblasts rato com activação RasV12 constitutiva [11]. DLC1 foi encaminhada para o núcleo através da inserção de uma repetição em tandem de três NLSs monopartite (NLS3) em frente do codão de iniciação de DLC1 rato na construção de expressão retroviral (Fig. 5A). Após selecção com puromicina, os clones resistentes foram expandidos e os clones resistentes a mais de 95% foram consideradas positivas GFP, confirmando a elevada eficácia de transdução retroviral (Fig. 5B). Nós também confirmou a segmentação nuclear bem sucedida de DLC1 rato pela técnica de imunofluorescência para a proteína de fusão NLS3-DLC1. Descobrimos que mais de 90% das células NLS3-DLC1 transduzidas mostraram coloração nuclear quando comparada com a coloração citoplasmática em células DLC1 transduzidas. a coloração de fundo com anticorpo anti-myc era dificilmente detectável nas células vector (Fig. 5B). Nós confirmou ainda as proteínas nível DLC1 expressão por immunoblotting (Fig. 5C). Para confirmar ainda mais que a propriedade de vaivém nucleocitoplasmático foi conservada em nossa DLC1 superexpressão modelo hepatoblast, que trataram células DLC1 expressar com LMB, seguido por imunofluorescência. Nós descobrimos que o tratamento com LMB poderia consistentemente manter DLC1 no núcleo (Fig. 5D). Essa observação ainda apoiada que a propriedade vaivém nucleocitoplasmático foi conservada nas orthologs DLC1 humano e do rato. O

in vivo

tumorigenicidade destes clones estáveis ​​foi examinado por injecção subcutânea nos ratos nus. Consistentemente, DLC1 exibiu efeito de supressão na formação de tumores, enquanto que DLC1 nuclear mostrou uma redução significativa na supressão da tumorigenicidade

in vivo

(Fig. 5E e 5F).

(A) Diagrama esquemático ilustrando a retroviral vetores utilizados para conduzir a expressão estável de DLC1 rato marcada com myc eo DLC1 rato nuclear-alvo (NLS3-DLC1). (B) Hepatoblasts infectadas com o vector, ou DLC1 NLS3-DLC1 retrovírus foram fixadas e a expressão da proteína marcada com myc foi visualizado por anticorpo anti-Myc seguidos por anticorpo secundário conjugado com Vermelho-Texas. (C) Os lisados ​​de hepatoblasts infectadas com vector, DLC1 ou retrovírus NLS3-DLC1 foram submetidas a immunoblotting utilizando anticorpos contra Myc, DLC1 e GFP. β-actina foi serviu como controlo de carregamento. (D) Hepatoblasts infectadas com retrovírus DLC1 foram submetidos a um tratamento LMB. As células foram então fixadas e a localização da DLC1 marcada com myc foi visualizado por anticorpo anti-Myc seguidos por anticorpo secundário conjugado com Vermelho-Texas. gráfico de barras que indica a percentagem de células com coloração nuclear DLC1. Os resultados representam uma duplicata de dois experimentos independentes. (E) A tumorigenicidade das hepatoblasts retroviral indicada transduzidas foi avaliada por injecção subcutânea ratinhos nus. 1 × 10

5 hepatoblasts foram injectados por via subcutânea no dia 0 e o volume do tamanho do tumor foi monitorizado diariamente desde o dia 4. Todos os ratinhos foram sacrificados no dia 14. No dia 14, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram dissecados. (F) Os tumores dissecados foram pesados ​​e as suas massas foram registados. Barra de escala:. 10 um

Tem sido relatado que a expressão ectópica de DLC1 em células negativas DLC1 poderia induzir a apoptose [19]. Para testar se NLS3-DLC1 exibiu actividade biológica diferencial na indução de apoptose, foi estabelecida e analisada células HEK293T que expressam estavelmente DLC1 nuclear por citometria de fluxo para a população de células subG1 (Fig. S3B). Para evitar qualquer efeito clonal possível, dois clones de cada grupo foram escolhidos para análise. Descobrimos que as células DLC1 expressar mostrou um aumento de pico subG1 quando comparado com o vector e as células que expressam NLS3-DLC1. células DLC1 expressando também mostrou uma G1 reduzido, mas aumentou S população (Fig. S3B). explicação plausível para isso poderia ser que as células que expressam DLC1 pode passar mais tempo na fase S, uma vez que entram no ciclo celular. Estas observações vez demonstrou que NLS3-DLC1 foi menos robusta na indução de apoptose e atenuando a progressão do ciclo celular, quando comparado com o DLC1 tipo selvagem.

Discussão

In silico

análise da sequência tem revelou uma série de potencial aminoácido básico rica NLSs bipartido em DLC1 [16]. A presença destes motivos levaram-nos a questionar se DLC1 existe como uma proteína nuclear. Neste estudo, foi demonstrado que uma proteína DLC1 foi continuamente empurrados entre citoplasma e núcleo em diferentes linhas celulares. Esta observação fornece uma explicação para a presença equilibrada de DLC1 nuclear e apoia a sua localização citoplasmática intrínseca como demonstrado por diversos estudos [10], [18], [20], [21], [22]. É digno de nota que, após o tratamento com LMB, adesão focal DLC1 localizada era ainda detectável. Esta observação sugeriu que apenas o não-específica, DLC1 citoplasmática foi retido no núcleo após o tratamento. Adesão focal DLC1 localizada era relativamente estática na natureza. Esta observação está de acordo com a coloração nuclear parcial observada para a adesão focal DLC1 localização mutante defeituoso, Y442F em um modelo de pulmão de células [10]. Embora a coloração nuclear positiva poderia ser encontrada no fígado, não neoplásico normal na coloração imuno-histoquímica, seria interessante observar se existe uma diferença distinguível de coloração DLC1 nuclear entre os HCC fígado e tecido DLC1-positiva normais (ou outros tipos de cancro).

Embora a presença de DLC1 nuclear foi discutido anteriormente, a sua actividade supressora de tumor no núcleo não tem sido claramente resolvidas. Para investigar directamente a actividade supressora de tumor do DLC1 nuclear, que expressa transientemente ou estavelmente NLS-DLC1 em linhas celulares de carcinoma hepatocelular, seguido por uma série de caracterização funcional. Incluímos esta abordagem, ao invés de estudar o mutante DLC1 falta o sinal de direccionamento nuclear mapeada (600-700 resíduos estavam em compromisso com o domínio RhoGAP) como previmos que a remoção deste sinal iria perturbar a sua actividade RhoGAP intrínseca e fazer a comparação com o tipo selvagem DLC1 impossível . Além disso, o tratamento LMB longo prazo para produzir DLC1 nuclear também é desfavorável e bloqueia globais de exportação de proteína nuclear e coloca estresse para as células [23]. Enquanto a nova função de DLC1 nuclear continua a ser explorado, que confirmou que NLS-DLC1 foi menos eficaz na supressão do crescimento de células, desintegrando-se a formação de fibras de stress de actina RhoA-mediada, e induzir a morte celular

in vitro

. NLS-DLC1 também foi menos eficaz na supressão do crescimento do tumor em um modelo de murganho de xenoenxerto. Nós especulamos mislocalization nuclear pode ser um mecanismo potencial que revoga a atividade DLC1 no cancro humano com expressão DLC1 intacta.

Funcionalmente, nossos achados são inconsistentes com a conclusão feita por relatórios anteriores. Yuan et al. translocação nuclear demonstrada de DLC1 pode induzir a apoptose e facilitar a sua função supressora de tumor num modelo de expresso transitoriamente DLC1 negativo cancro do pulmão de células não pequenas humano (NSCLC) linha de células [16]. No entanto, o nosso modelo de expressão DLC1 nuclear estável com hepatoblasts rato e células HEK293T humana nem falhou no reforço nem induzir apoptose sub-população, como indicado por citometria de fluxo análise. explicação plausível inclui a expressão transitória produz um nível muito elevado de DLC1 que pode causar toxicidade para as células; enquanto o nosso sistema de células estáveis ​​podem ter sofrido algum tipo de adaptação, durante a selecção de células estável, o que permite que as células a serem propagadas com a expressão de DLC1 nuclear. Além disso, o tipo de célula e da linha de células dependentes de efeitos contribuem para a diferença na actividade DLC1 de induzir apoptose e paragem de crescimento têm que ser considerados [11], [16], [24]. Por outro lado, Scholz et ai mostrou que DLC1 S327AS431A mutante não é capaz de complexar com 14-3-3 no citoplasma e é biologicamente mais activa do que DLC1 tipo selvagem. Infelizmente, os autores descobriram que a introdução de resíduos carregados negativamente nos locais acima referidos não podem imitar a conformação 14-3-3 ligação constitutivamente ativo. A falta de um mutante favorável dificulta a avaliação de como estes resíduos de ligação 14-3-3 afectar a sensibilidade de LMB DLC1 [17]. Ao assumir o DLC1 S327AS431A é menos provável de ser sequestrado no citoplasma, pode-se prever que este mutante pode ser transportado para o núcleo, com mais frequência. No entanto, é actualmente desconhecido se a hiperactividade deste mutante é um resultado da entrada nuclear aumentada no curto prazo ou é devido à alteração conformacional que favorece função DLC1 RhoGAP. É possível que a entrada nuclear aumentada de um DLC1 hiperactivo biológica pode servir como um mecanismo regulador negativo para regular negativamente a DLC1 hiperactivo em um longo prazo.

Dois estudos independentes têm tentado mapear o NLS em DLC1 [16] , [17]. Yuan et al sugeriu a DLC1 415-431 é o NLS suposto, embora Scholz et al sugeriu que o transporte nuclear DLC1 requer apenas na segunda metade do mesmo local envolvendo os resíduos 428 e 429. No entanto, descobrimos que mutante DLC1 falta toda proposta NLS poderia ainda ser efectivamente retidos no núcleo, indicando sequência estrutural extra no DLC1 pode estar envolvida neste transporte nuclear. Para resolver isso, realizamos exame localização subcelular detalhada dos mutantes de deleção GFP DLC1. Descobrimos que DLC1 Δ292-646 mutante foi menos LMB sensível. Consistentemente, encontramos que a expressão de fragmentos que representam apenas a região centro de DLC1 mostrou localização nuclear. A observação implica que a alteração em ambas as extremidades de DLC1 pode expor os elementos que estão a conduzir a localização nuclear de DLC1. A partir destes dados, mais a propor e confirmam que a região 600-700 do domínio RhoGAP é importante no direccionamento de localização nuclear de DLC1.