Sumário

Cancro associados fibroblastos (FAC) são responsáveis ​​pelo crescimento tumoral, angiogênese, invasão e metástase. metaloproteinases da matriz (MMP) -9 secretado estroma câncer povoada por FAC é um pré-requisito para a angiogênese e metástase do câncer. Omega-3 ácidos graxos poliinsaturados (ômega-3 PUFAs) foram relatados para ter efeitos anti-tumorais em diversos tipos de tumores malignos. Gordura 1-ratinhos, que pode converter ómega-6 para ómega-3 PUFA independente de dieta, são úteis para investigar as funções de endógena de PUFA ómega-3. Para examinar o efeito de PUFA omega-3 na tumorigénese, as células CT-1, uma linha de células epiteliais imortalizadas murino por papilomavírus humanos (HPV oncogenes), foram injectados subcutaneamente em ratinhos de tipo selvagem ou fat-1. O crescimento tumoral e angiogénese do tumor TC-1 foram significativamente suprimida em gordura-1 em comparação com ratinhos do tipo selvagem. cDNA microarray de tumores derivados de murganhos de tipo fat-1 e selvagem revelou que a MMP-9 é regulada negativamente em ratinhos fat-1. estudo imuno-histoquímico demonstrou imunorreatividade para MMP-9 nos fibroblastos do estroma tumorais foi difusamente positivo no tipo selvagem enquanto focal em fat-1 ratos. MMP-9 foi expressa em cultura de fibroblastos primários isolados a partir de ratinhos de tipo gordura e 1-selvagem mas não foi expressa em células CT-1. Co-cultura de fibroblastos com as células CT-1 aumentou a expressão e a actividade de proteinase da MMP-9, embora a actividade de protease da MMP-9 em fibroblastos fat-1-derivados foi menor do que nos fibroblastos do tipo selvagem. Os nossos dados sugerem que os PUFA omega-3 suprimir a MMP-9 e a indução de angiogénese tumoral. Estes resultados podem fornecer informações sobre os mecanismos pelos quais PUFAs ômega-3 exercem efeitos anti-tumorais através da modulação microambiente do tumor

Citation:. Taguchi A, Kawana K, Tomio K, Yamashita A, Isobe Y, Nagasaka K, et ai. (2014) Matrix Metaloproteinase (MMP) -9 em fibroblastos Cancer-associado (FAC) é suprimida por poliinsaturados ômega 3 ácidos graxos

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 9 (2): e89605. doi: 10.1371 /journal.pone.0089605

editor: Zhongjun Zhou, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 10 de outubro de 2013; Aceito: 22 de janeiro de 2014; Publicação: 27 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Taguchi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Tokyo IGAKUKAI (KK), a Ciência do Japão e Agência de Tecnologia precursora de Investigação para Embryonic Ciência e Tecnologia (PRESTO) (MA), o Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (MA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O microambiente do tumor é constituído por células endoteliais microvasculares, células epiteliais e fibroblastos normais adjacentes associados ao cancro (FAC), e é relatado como sendo um regulador importante da tumorigénese [1], [2]. À medida que a população celular mais comum encontrada no microambiente tumoral, FAC são responsáveis ​​pela síntese de proteínas envolvidas na remodelação da matriz extracelular (ECM), e para a secreção de factores de crescimento e citocinas que regulam a proliferação de células tumorais e invasão [3 ], [4]. Em modelos de xenoenxerto de cancro do ovário murino, a p53 /via de NF-kB em FAC aumentou significativamente no crescimento do tumor in vivo [5]. No cancro do cólon, Zhu Y et al. relatório que a IL-1β aumento da proliferação de células de cancro do cólon e invasão por cima de regulação de COX-2 de sinalização em FAC [6].

metaloproteinases de matriz (MMPs) são sintetizadas como pró-enzimas e tipicamente activada por remoção proteolítica de um propéptido [7]. As MMPs são relatados para influenciar a progressão do tumor, facilitando eventos cruciais para a neovascularização e estabelecimento de metástases distantes, incluindo a proliferação, a sobrevivência e a migração das células endoteliais, tumores e células estromais [8], [9]. MMP-2 e MMP-9 estão implicadas como pré-requisitos para a angiogénese e metástases no processo carcinogenesic. MMP-2 é expresso em várias linhas celulares de cancro [10]. Em contraste, a MMP-9 tem muito pouca ou nenhuma expressão nestas células cancerígenas. Em vez disso, a MMP-9 é conhecido para ser segregada a partir de fibroblastos estromais cancro e células endoteliais [11], [12]. MMP-9 é um membro de uma família de endoproteinases de zinco que contém que está envolvido na degradação da matriz extracelular (ECM) e na remodelação vascular [13].

ácido docosahexaenóico (DHA, 22:6n-3) e ácido eicosapentaenóico (EPA, 20:5n-3) são mediadores representativos de ômega-3 ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs ómega-3) e exercem efeitos anti-inflamatórios em reações inflamatórias patológicas agudas e crônicas por contrariar inflamação [14]. Omega-3 PUFAs também são relatados para ter efeitos anti-câncer com base em estudos in vitro e in vivo [15] – [17]. Vários mecanismos têm sido propostos para explicar os efeitos anti-câncer de ômega-3 PUFAs. PUFAs ómega-3 alterar o crescimento de células tumorais através da modulação da replicação celular, interferindo com os componentes do ciclo celular ou através do aumento da morte celular através de necrose ou apoptose [18], [19]. PUFAs ómega-3 também são conhecidos por exercer efeitos anti-angiogénicos, inibindo a produção de diversos mediadores angiogénicos incluindo: factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), e prostaglandina E2 (PGE2) [20] – [24].

a suplementação da dieta é uma abordagem tradicional para modificar a composição de nutrientes nos tecidos em estudos com animais de nutrição. Animais de alimentação dietas que alteram componentes nutricionais e não nutricionais específicos podem ajudar a diferenciar os grupos experimentais; No entanto, pode ser extremamente difícil para fornecer dietas que são idênticos em todos, mas um único ou uma pequena, mas controlada número de componentes. Kang et ai. Recentemente projetado um camundongo transgênico que transporta o gene fat-1 a partir da lombriga

Caenorhabditis elegans

[25]. Este gene codifica uma omega-3 dessaturase de ácido gordo que catalisa a conversão de omega-6 para omega-3 PUFAs e que está ausente na maioria dos animais, incluindo mamíferos. Há uma diferença notável no omega-6 /omega-3 PUFA relação de tecido entre o tipo selvagem e de gordura 1-ratinhos transgénicos [26]. Gordura 1-ratos, que normalmente apresentam uma proporção equilibrada de ômega-6 e ômega-3 PUFAs em seus tecidos e órgãos independentes da dieta, permitem cuidadosamente controlada estudos a serem realizados na ausência de possíveis fatores de confusão de dieta. Isso faz deles um modelo útil para estudar as propriedades biológicas da endógenos PUFAs ómega-3 [25]. Vários relatórios que utilizam ratinhos fat-1 demonstraram efeitos anti-cancro de PUFAs ómega-3 [27] – [30]. Nessas investigações, ômega-3 PUFAs exerceu efeitos anti-câncer por suprimir reações inflamatórias e secreção de PGE2 a partir de células cancerosas. Até o momento, existem poucos estudos que investigam o envolvimento de ômega-3 PUFAs na biologia da FAC.

Neste estudo, a hipótese de que omega-3 PUFAs podem alterar microambientes tumorais, influenciando a atividade CAF. Para examinar esta hipótese, fibroblastos derivados de ratinhos de tipo fat-1 e selvagens foram avaliadas in vitro e in vivo, sob condições que permitem a interacção com as células CT-1 de cancro. as células CT-1 foram derivados a partir do epitélio de C56BL /6 ratos e imortalizadas por papilomavírus humano (HPV) tipo 16 E6 e E7 oncoproteins. Eles são vulgarmente utilizados in vitro e in vivo em modelos murinos de cancros relacionados com HPV [31]. Aqui, nós investigamos o envolvimento de PUFAs ómega-3 de CT-1 a tumorigénese através da comparação ratinhos de tipo fat-1 e selvagens. O foco específico envolvido no estudo de fibroblastos associados a tumores. Estes modelos são úteis no estudo da FAC porque as células cancerosas são originários de tipo selvagem epitélio murino, enquanto os componentes do estroma cancro, incluindo o FAC, provenientes de gordura-1 (PUFAs ómega-3-rico) ou ratinhos de tipo selvagem (PUFAs normais).

Materiais e Métodos

Animais e

ratinhos dieta

Fat-1 foram criados em um fundo C57BL /6, como descrito [26] e, posteriormente, retrocruzado (pelo menos quatro vezes) para um C57BL /6 de fundo. Os animais foram alimentados com uma dieta especial (AIN-76A + 10% de óleo de cártamo; CLEA Japan, Inc.) que continha 10,3% de gordura total, com composição de ácidos gordos de C16:0 (7,6%), C18:0 (2,7%), C18 :1n-9 (14,1%), C18:2n-6 (73,2%), C18: 3n-3 (0,3%), C20:4n-6 ( 0,1%), C20:5n-3 ( 0,1 %), C22: 6n-3 ( 0,1%), elevada em n-6 e de baixo em ácidos gordos n-3, até que a idade desejada (6-8 semanas) para as experiências. Para evitar a oxidação dos lípidos na dieta, todos os alimentos foram armazenados no frigorífico com antioxidantes (SEM IDADE; Mitsubishi Gas Chemical Inc.), e recentemente preparada a cada dois dias. Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Animal da Universidade de Tóquio.

ensaio de crescimento tumoral em

células ratos

TC-1 são derivados de uma célula epitelial de pulmão primário de C56BL6 /camundongos e imortalizadas utilizando HPV 16 E6 /E7 além de c-Ter-ras (tipo presente do Dr. TC Wu, da Universidade Johns-Hopkins, Baltimore MD EUA) [32]. as células CT-1 foram cultivadas em DMEM (Gibco, NY, EUA) contendo 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina, 0,1 mg /ml de estreptomicina, e 0,25 g /ml de anfotericina B. ratinhos fêmea com oito semanas de idade foram injectados com células TC-1 5 × 10

6 murino suspenso em 100 ul de DMEM. O volume do tumor, com base em medições de calibre, foi calculada aos 7 e 14 dias após a injecção de acordo com a fórmula seguinte: (volume do tumor) = 1/2 × (o diâmetro mais curto)

2 × (o maior diâmetro). Os ratinhos foram sacrificados 14 dias após a inoculação, os tumores foram excisados ​​e armazenado a -80 ° C para futuras análises.

cDNA microarray

O ARN total a partir de tumores TC-1 (acima) foi extraído utilizando um minikit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha). Para a análise de cDNA microarray, 0,5 ug de ARN total reunido foi amplificado e marcado utilizando um kit de amino Alil MessageAmpTM II ARNm de amplificação (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra de ARNm marcado com Cy3 e ARNm de referência marcado com Cy5 foi cohybridized ao GeneTM rato Oligo chip de 24 K (Toray Industries Inc., Tóquio, Japão) a 37 ° C durante 16 h. Após a hibridação, cada chip de ADN foi lavado e seco. sinais de hibridação derivados de Cy3 e Cy5 foram escaneados usando digitalização matriz Express (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). A imagem digitalizada foi analisada utilizando GenePix Pro (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA, EUA). Todos os dados analisados ​​foram escalados pela normalização global. número de acesso GEO é GSE54079.

Imunohistoquímica

As secções de parafina (4 mm) de TC-1 tumores foram desparafinados em xileno e reidratadas através etanol graduado à água. Os antigénios foram recuperados por ebulição em 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) durante 30 min. As secções foram incubadas em arrefecidos DAKO solução real Peroxidase-bloqueio (DAKO, Carpinteria, CA, EUA) durante 10 minutos para extinguir a peroxidase endógena. Para bloquear a ligação não específica, as secções foram incubadas em solução de bloqueio Proteína DAKO (DAKO) durante 10 min à temperatura ambiente. As secções foram então incubadas com um anticorpo policlonal de coelho contra rato MMP-9 (PAB12714, Abnova, 1:100 diluição) em DAKO REAIS Diluente de Anticorpo (DAKO) durante a noite a 4 ° C. As lâminas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpos secundários conjugados com peroxidase, lavadas, incubadas com DAB, contrastadas com hematoxilina, desidratadas através de uma série de etanol e xileno, e montadas. Para avaliar a formação de microvasos de tumor, foram coradas secções de tumor para CD-31, utilizando um anticorpo monoclonal de rato contra rato CD-31 (ab56299, Abcam, Tóquio, Japão, 1:100 diluição).

RT-PCR quantitativo ( RT-qPCR)

o ARN total foi extraído a partir de TC-1 tumores e fibroblastos cultivadas utilizando um minikit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha), seguido por transcrição inversa. O ADNc foi amplificado durante 40 ciclos num ciclizador de luz 480 (Roche, Basileia, Suiça), utilizando uma mistura de sondas universais mestre e os seguintes iniciadores e sondas Universal Sonda biblioteca (UPL) (Roche). Os pares de iniciadores e as sondas universais correspondentes à cada iniciador que foram usadas em amplificações foram como se segue: rato β-actina, 5′- ATTGAAACATCAGCCAAGACC-3 ‘e 5′-CCGAATCTCACGGACTAGTGT-3′ probe88; rato de MMP-9, 5’-ACGACATAGACGGCATCCA-3 ‘e 5′-GCTGTGGTTCAGTTGTGGTG-3’ probe19. A expressão de MMP-9 foi normalizada utilizando ARNm β-actina como padrão interno. Os níveis de expressão foram calculados pelo método comparativo utilizando Ct β-actina como um gene de referência endógena.

cultura de fibroblastos primários e co-cultura com as células CT-1