Abstract

O objetivo deste estudo é determinar a frequência genética de GNAS mutações ativadoras em câncer colorretal e do correspondente patologia de tumores mutantes Gnas. mutações oncogénicas em GNAS foram descritos num certo número de neoplasias incluindo as da pituitária, rim, pâncreas, e, mais recentemente, no cancro do cólon. Para verificar a freqüência no câncer de cólon nós empregamos uma plataforma pyrosequencing sensível para a detecção de mutações do R201C e hotspots R201H GNAS em amostras de tumor que representam todos os estágios clínicos. Nós, adicionalmente testadas para mutações KRAS e BRAF como relatórios anteriores mostraram que estes muitas vezes co-ocorrer com mutações ativadoras Gnas. Dos 428 ensaiados tumores do cólon, mutações em GNAS estavam presentes em 10 das amostras (2,3%), indicando que este é uma mutação significativa, embora pouco frequente, em tumores colo-rectais. Nove tumores mutantes gnas (90%), continham mutações de activação concomitantes em qualquer oncogene KRAS ou BRAF, que foi significativamente maior do que a frequência de mutação destes genes na população de tumor (56%, p 0,0305). Todos os dez dos tumores mutantes GNAS surgiu no cólon direito (proximal) (p 0,007), e 7 de 8 casos analisados ​​apresentaram uma morfologia das vilosidades marcada. Tomados em conjunto, estes dados indicam que GNAS tumores de cólon mutante geralmente têm mutações síncronos em KRAS ou BRAF, estão do lado direito, em local, e estão associados com uma morfologia das vilosidades

Citation:. Fecteau RE, Lutterbaugh J, Markowitz SD, Willis J, K Guda (2014) GNAS Mutações identificar um conjunto de do lado direito, RAS mutante, vilosidades cancros do cólon. PLoS ONE 9 (1): e87966. doi: 10.1371 /journal.pone.0087966

editor: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de outubro de 2013; Aceite: 31 de dezembro de 2013; Publicação: 30 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Fecteau et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo é suportado pelo PHS bolsas 1P50CA150964 (SDM, JW, KG), CA148980 (KG), P30CA43703, T32GM007250 (REF) e CA059366 (REF) e por presentes do Wilson Fundação Marguerite (SDM), o Leonard e Joan Horvitz Foundation (SDM ). o Horvitz e Erica Foundation Richard Hartman-Horvitz (SDM), ea Research Alliance Nacional do Câncer Colorretal (SDM) Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

tumorigênese colorretal é caracterizada por uma sucessão de aberrações genéticas que transformam o epitélio do cólon normal em um câncer invasivo [ ,,,0],1]. Temos anteriormente definido um conjunto de 140 genes que sofrem mutação somática recorrente em cancro colorrectal (CRC), sugerindo que estes são susceptíveis condutores de progressão tumoral [2], [3]. Um destes genes foi GNAS, em que foram observadas mutações recorrentes no codão 201, que alterou a Arg altamente conservada

201 a qualquer cisteína (R201C) ou histidina (R201H) [2], [3]. GNAS é um oncogene conhecido que foi descrito pela primeira vez no crescimento de hormonas pituitárias adenomas secretores e desde que foi encontrado para ser mutado em uma série de neoplasias, predominantemente, no ponto de acesso codão 201 [4] – [7]. GNAS códon 201 mutações são particularmente frequentes em neoplasias mucinoso intrapapilar (IPMN) do pâncreas, onde 67% dos casos são mutante [8]. O produto principal do locus GNAS, a subunidade Gsα das proteínas G heterotriméricas, actua de modo a transdução de sinais a partir de G-proteína recptors acoplada (GPCRs) para a enzima adenilato ciclase efectora na (GS) via L-estimuladoras, que conduz à produção do AMP cíclico (AMPc). Ambos os R201C e R201H mutações resultar em ativação constitutiva de Gsα e produção cAMP autónoma [9], [10].

Em IPMNs, mutações GNAS são frequentemente acompanhadas por mutações do KRAS, com 51% de Gnas casos mutantes também mutações tendo em KRAS [8]. As mutações de activação KRAS, e, em menor medida, a sua efetoras jusante BRAF, são eventos frequentes em câncer de cólon. Além disso, a sequenciação exome cheio de amostras de cancro colorectal por nosso grupo e colaboradores revelou coincidentes mutações Gnas e KRAS em um pequeno grupo de tumores de cólon, indicando mutações GNAS em cancros do cólon também pode muitas vezes ser acompanhado por mutações no KRAS e /ou BRAF [2] .

frequências notificados de mutações ativadoras GNAS em CRC têm divergido entre os vários grupos, que vão desde tão pouco como 0,5% a 9% [2], [11] – [13]. No presente estudo, utilizamos uma plataforma pyrosequencing sensível para sequenciar o mutacional hotspot códon R201 em uma coorte de 428 tumores de cólon esporádicos para determinar uma frequência mais precisa no CRC. Nós também ensaiado para mutações no KRAS e BRAF para determinar a prevalência de coincidente GNAS /KRAS ou mutações GNAS /BRAF em nossa coorte tumor. dados clínicos e patológicos foi revisto para determinar se os tumores mutantes GNAS estão associados a fenótipos clínicos ou morfológicas únicas. Aqui nós mostramos que GNAS tumores de cólon mutante abrigar KRAS recorrentes ou mutações BRAF, o alvo do proximal anatômica “do lado direito” cólon, e exibem uma morfologia das vilosidades.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

o tumor protocolo amostra de competência, intitulado “CWRU 7296: epiteliais do cólon Banco de Tecidos”, foi aprovado pela Universidade Hospitais processo Medical Center Institutional Review Board para a investigação humana com o número atribuído UH IRB 03-94-105. Sob este protocolo, o tecido descartado foi obtida através de consentimento informado por escrito dos pacientes para fins de pesquisa.

Tumor amostras

amostras de tumor foram obtidos a partir de um arquivo congelada que consistia em 428 cânceres colorretais não selecionados, sem família relatou história (doravante referida adenocarcinomas colorretais esporádicos como) acumulados sob o protocolo acima. Os dados clínicos foram obtidos e montados através de relatos de casos de patologia individuais para cada tumor. avaliação microscópica da morfologia do tumor para amostras selecionadas foi realizada por um patologista anatômica (J.W). Todas as amostras foram analisadas para mutações em GNAS códon 201, KRAS códons 12, 13, 61 e 146, e BRAF códon 600 usando tanto sequenciamento Sanger e pyrosequencing.

extracção de ADN e MSI testes

a extracção do ADN genómico a partir de amostras de tumores foi realizada utilizando um protocolo padrão de tiocianato de guanidina [14] ou o DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen). Teste para o status MSI no BAT26 loci genômica e BAT40 foi realizada como descrito anteriormente [15].

pirossequencia�o

análise pyrosequencing de GNAS códon 201 foi realizada em todas as amostras. pyrosequencing ensaios foram concebidos utilizando o software PSQ Ensaio de desenho (Qiagen, Chatsworth, CA), que incluiu GNAS codão 201, KRAS codões 12 e 13, KRAS codão 61, codão 146 KRAS e BRAF codão 600. Para cada ensaio, uma das PCR iniciadores foi biotinilado na extremidade 5 ‘e purificou-se usando cromatografia líquida de alta eficiência. As sequências dos iniciadores são como se segue. GNAS: Para: 5’-biotina-TTGGCTTTGGTGAGATCCATTG-3 ‘, 5′-Rev CACCTGGAACTTGGTCTCAAAGAT-3′, 5’-Seq TTCCAGAAGTCAGGACA-3 ‘; KRAS codões 12 e 13: Para o 5’-TCGATGGAGGAGTTTGTAAATGA-3 ‘, 5′-biotina-Rev TTCGTCCACAAAATGATTCTGA-3′, 5’-Seq CTTGTGGTAGTTGGAGC-3 ‘; KRAS codão 61: Para CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCA 5’-3 ‘, 5′-biotina-Rev TCCTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3′, 5’-Seq ATATTCTCGACACAGCAG-3 ‘; KRAS codão 146: Para 5’-AGGCTCAGGACTTAGCAAGAAGTT-3 ‘, 5′-biotina Rev-GCCCTCTCAAGAGACAAAAACAT-3′, 5’-Seq AATTCCTTTTATTGAAACAT-3 ‘. BRAF codão 600: Para TTCATGAAGACCTCACAGTAAAAA 5’-3 ‘, 5′-biotina-Rev CCACAAAATGGATCCAGACA-3′, 5’-Seq TGATTTTGGTCTAGCTACA-3 ‘. Todas as reacções de PCR foram realizadas usando FastStart Taq (Roche) e as concentrações de iniciador de 0,2 uM. As condições de amplificação incluíram uma etapa inicial de desnaturação a 95 ° C durante 4 min, e 49 ciclos de 95 durante 15 s, 54 C durante 30 s, e 72 C durante 20 s. Após PCR, os produtos de amplificação foram sequenciados em um instrumento pyrosequencing PyroMark MD (QIAGEN) e análise da mutação foi realizada como previamente descrito [16].

A sequenciação Sanger

sequenciação de Sanger foi utilizado para confirmar todas as mutações detectado por análise pirossequenciao. ADN genómico isolado a partir de amostras tumorais foi utilizado para amplificação por PCR de regiões englobando codão 201 de GNAS, codões 12, 13, 61, e 146 de KRAS, e o codão 600 do gene BRAF. Directo e inverso iniciadores utilizados para amplificação por PCR foi marcada com um 5 ‘para a frente M13 (5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3’) e 5 ‘M13 reverso (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′) sequência de iniciador universal, respectivamente. As sequências dos iniciadores eram as seguintes. GNAS: Para GTTGGCAAATTGATGTGAGC 5’-3 ‘, 5′-Rev CCCTGATCCCTAACAACACAG-3′; KRAS codões 12 e 13: Para 5’-TGGTGGAGTATTTGATAGTGTA-3 ‘, 5′-Rev CATGAAAATGGTCAGAGAA-3′; KRAS codão 61: Para TCCAGACTGTGTTTCTCCCT 5’-3 ‘, 5′-Rev AACCCACCTATAATGGTGAATATCT-3′; KRAS codão 146: Para 5’-AGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3 ‘, 5′-Rev GGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC-3′ BRAF codão 600: Para TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA 5’-3 ‘, 5′-Rev GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3’. Todas as reacções foram levadas a cabo usando 0,4 uM de concentração de cada iniciador e FastStart polimerase Taq (Roche, Indianapolis, IN). As condições de amplificação para todos os pares de iniciadores consistiu de uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 4 minutos seguido de 39 ciclos de 95 C durante 30 s, 58 C durante 30 s, 72 C durante 30 s, e um alongamento final a 72 C durante 3 min .

Análise estatística

o teste exato de Fisher foi usado para avaliar diferenças na proporção de tumores mutantes GNAS entre as classes de gênero, etnia, estado KRAS /BRAF, estado de instabilidade de microssatélites, estadiamento clínico e localização do tumor. Um valor P bicaudal inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Frequência de Gnas Hotspot mutações no câncer colorretal

pyrosequencing detectadas mutações ativadoras de GNAS códon 201 em dez dos adenocarcinomas colorrectais 428 (2,3%) (Tabela 1). Cada uma destas mutações também foi validado usando a sequenciação de Sanger (Fig. 1). Dos dez GNAS codão 201 mutações detectadas, identificamos sete p.R201H e três substituições de aminoácidos p.R201C, todos os quais foram mutuamente exclusivos (Tabela 2). Sete destas mutações detectadas surgiu entre os tumores estáveis ​​377 microssatélites testados (1,9%), e três surgiu entre os 41 tumores com instabilidade de microssatélites (7,7%). O aumento da frequência de mutações em tumores GNAS instáveis ​​microssatélites foi de significância estatística limítrofe (P = 0,065). A frequência de mutação no códon 201, de 0,0063 por par de base diplóide é significativamente maior do que a taxa de mutação de fundo de 1,2 × 10

-6 mutações por pares de bases que tipifica cancros microssatélites estável cólon (P = 3E (-36)) [3 ].

cromatogramas representativos (esquerda) e pirogramas (direita) de GNAS do tipo selvagem, GNAS R201C, e mutações GNAS R201H detectado no câncer de cólon. Setas em cromatogramas mostram mutantes, picos heterozigotos. picos encaixotados em pirogramas destacar alelos mutantes. Percentagens indicam freqüências alélicas calculados a partir intensidades pyrogram de pico.

Gnas mutações estão associadas com uma morfologia das vilosidades

avaliação Patologia de tumores mutantes GNAS revelou uma morfologia das vilosidades proeminente em sete de oito (88%) casos disponíveis para revisão. Em cinco desses casos, os cancros mutantes GNAS surgiu em um adenoma villous contíguo. Em dois destes casos, os cancros-se demonstrou uma arquitectura das vilosidades altamente incomum (Figura 2). vilosidades adenomas são um subtipo de pólipos adenomatosos, representando cerca de 5-15% dos adenomas [17]. cancros vilosidades, no entanto, não são actualmente reconhecida como uma sub-classificação específica da CRC, embora estudos sugerem que adenocarcinomas vilosidades pode ser responsável por cerca de 9% dos casos de CRC [18], [19]. Nossos resultados indicam que os tumores mutantes GNAS surgem perto exclusivamente em associação com morfologia das vilosidades presentes nem no câncer ou o adenoma antecedente

H . E Fotomicrografia de uma mutante GNAS, adenocarcinoma das vilosidades. O tumor tem morfologia das vilosidades típico com salientes papilas contendo um núcleo fibrovascular e forrado com epitélio adenomatosa.

Um estudo recente da Yamada e colegas detectaram GNAS códon 201 mutações de ponto de acesso em 83% vilosidades adenomas do cólon e do recto em pacientes japoneses [13]. Nós alargado segundo nossa análise de mutação para um pequeno painel de vilosidades, tubuloviloso e adenomas tubulares para determinar a frequência de mutações GNAS em uma coorte adenoma ocidental (Tabela 3). No geral, encontramos GNAS códon 201 mutações em 46% (6/13) das vilosidades adenomas e em 15% (3/20) de adenoma tubuloviloso, e em nenhum adenomas tubulares. Assim gnas mutações em adenomas surgem exclusivamente no contexto da morfologia das vilosidades. No entanto, na população ocidental que caracterizado descobrimos que os adenomas vilosos dividir molecularmente em dois grupos de tamanhos aproximadamente iguais, um grupo composto de adenomas vilosos que surgem através da via de mutação GNAS, e o outro conjunto de adenomas vilosos que surgem através de uma via alternativa.

Gnas CRCs mutantes são predominantemente KRAS /mutante BRAF e localizado no cólon proximal

Entre IPMNs, mutações GNAS são muitas vezes co-acompanhado por mutações do KRAS. Entre GNAS cancros do cólon mutantes, foram identificadas mutações em oncogenes KRAS e BRAF em nove de dez (90%) casos, uma fracção que é significativamente mais elevada do que a frequência global de mutações KRAS e BRAF na coorte do tumor (P 0,0305, o teste exato de Fisher). A frequência global de mutações KRAS e BRAF em nossa população tumor era de aproximadamente 56% (44% KRAS, 12% BRAF), que está de acordo com estudos anteriores [20]. Quando examinados para localização anatômica dentro do cólon, todas as dez amostras mutantes GNAS foram encontrados para ser derivado de cânceres primários originados no cólon proximal, entre o ceco e flexão do baço, lesões comumente referido como do lado direito (P 0,007, Fisher teste exato). Incluído no nosso coorte tumor eram ambos estáveis ​​microssatélite (MSS) e microssatélites instáveis ​​(MSI) tumores de cólon, com casos MSI resultantes predominantemente no lado direito. Porque três tumores mutantes GNAS também foram tumores MSI, é possível que incluindo cancros MSI distorce a associação de mutações Gnas com o cólon proximal. No entanto, quando todos os cancros da MSI são excluídos da análise, a associação dos cancros positivos Gnas com o cólon proximal permanece significativa (P 0,044)

É interessante notar que, enquanto todos os cânceres mutantes GNAS eram do lado direito , gnas adenomas mutantes foram encontrados em todo o cólon (Tabela 4). Não foram observadas diferenças significativas em tumores mutantes GNAS quando analisados ​​por gênero, etnia, estágio clínico, ou o estado de microssatélites.

Discussão

Neste estudo, descobrimos que mutações GNAS associar com um subclasse distinta dos cancros do cólon que é tipificado por localização no cólon proximal, por ter KRAS coincidente ou mutação BRAF, e pela associação com morfologia das vilosidades. Embora a frequência de Gnas cancros do cólon mutante é de 2,3%, encontramos estes tumores constituem uma subclasse molecular-patológica distinta de câncer de cólon. Para o nosso conhecimento, esta análise de 428 tuomrs cólon é a análise mais extensa dessas mutações que tem sido feito. A frequência de 2,3% de mutações GNAS nesta coorte, é maior do que a relatada recentemente por Idziaszczyk e seus colegas em 2010, embora menos do que o inicialmente observado em um estudo menor anterior por nós e colaboradores [2]. Curiosamente, gnas cancros mutantes não são encontrados no cólon distai, ao passo que gnas adenomas vilosos mutantes surgem ao longo do cólon, aumentando a possibilidade de que gnas adenomas mutantes progredir mais rapidamente para o cancro no cólon proximal ou são mais susceptíveis de se tornar sintomático e detectada quando localizado no cólon distai. Estas questões devem ser tratadas mais experimentalmente para distinguir entre estas duas possibilidades.