Abstract

Jaeumganghwa-tang (JGT,

Zi-yin-jiang -huo-tang

em chinês e

Jiin-koka-to

em japonês) é uma fórmula de ervas oriental que tem sido muito utilizado como uma medicina tradicional para o tratamento de doenças respiratórias e renais. Estudos recentes revelaram que JGT exibiu efeitos inibidores potentes sobre alergias, inflamação, dor, convulsões, e hiperplasia da próstata. Várias ervas constituintes em JGT induzir a morte de células cancerosas por apoptose. No entanto, não foi examinada a actividade anti-cancro de JGT. Neste estudo, nós investigamos os efeitos anti-câncer de JGT usando células de fibrossarcoma humano HT1080 altamente tumorigénicas e elucidou os mecanismos subjacentes. Além disso, examinamos se o

Lactobacillus

fermentação de JGT reforçada a sua actividade anti-câncer usando um

in vivo

modelo de xenotransplante porque fermentação de extratos de ervas é pensado para reforçar os seus efeitos terapêuticos. Os dados revelaram que JGT suprimiu o crescimento de células cancerosas de forma eficiente, estimulando a paragem do ciclo celular G1 e, em seguida, induzir a morte celular por apoptose, causando dano mitocondrial e activação de caspases. A fosforilação de p38 e ERK também desempenhou um papel na morte celular induzida por JGT.

In vitro

experimentos demonstraram que JGT fermentado com

fJGT162 Lactobacillus acidophilus

, designado, provocou padrões similares de morte celular como fez JGT não-fermentado. Enquanto isso, a administração oral diária de 120 mg /kg fJGT162 para ratinhos BALB /nu portadores de HT1080 C suprimiu o crescimento de tumores significativamente (até 90%) em comparação com o tratamento com solução salina, enquanto que a administração de JGT não fermentada suprimiu o crescimento tumoral por ~ 70 %. Colectivamente, estes resultados sugerem que JGT e fJGT162 são seguras e úteis anti-câncer ervas terapêuticas complementares e alternativas, e que

Lactobacillus

fermentação melhora a

in vivo

eficácia anti-câncer do JGT significativamente.

Citation: Kim a, Im M, Hwang YH, Yang HJ, Ma JY (2015) Jaeumganghwa-Tang induz a apoptose através da mitocondrial Caminho e

Lactobacillus

fermentação aumenta a sua Anti-Cancer Atividade em células de fibrossarcoma humano HT1080. PLoS ONE 10 (5): e0127898. doi: 10.1371 /journal.pone.0127898

Editor do Academic: Aamir Ahmad, Escola de Medicina da Universidade Estadual Wayne, United States |

Recebido: 25 de fevereiro de 2015; Aceito: 21 de abril de 2015; Publicado em: 28 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Grant K15280 atribuído a Coreia do Instituto de Medicina Oriental (kiom) do Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro (MSIP), República da Coreia

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Nos últimos anos, a medicina tradicional chinesa (MTC) ganhou atenção crescente como um recurso para a descoberta de medicamentos. Porque extratos de plantas medicinais à base de TCM são geralmente de baixo custo e exibem pouca toxicidade ou efeitos colaterais na prática clínica, têm sido aplicados como medicamentos alternativos para tratar uma ampla gama de doenças humanas, incluindo câncer, na China, Japão, Coréia e outros países asiáticos [1-4]. Em TCM, ervas são utilizados em combinação como fórmulas, que se crê melhorar a sua eficácia terapêutica e reduzir os efeitos adversos ao mesmo tempo. Por exemplo, Ka-mi-kae-kyuk-tang (KMKKT), uma fórmula de 10 ervas orientais, tem anti-angiogénicos, anti-metastático, e anti-câncer de actividades

in vivo

sem efeitos colaterais óbvios [5]. Além disso, KMKKT estimula a hematopoiese da medula óssea e de células estaminais alivia os efeitos secundários leucopenia induzida por droga anti-cancro em ratinhos [6,7]. Além disso, Bojungbangdocktang (BJBDT), que foi usado para a prevenção ou tratamento de cancros na Coreia, funções, bloqueando a actividade do VEGF /VEGFR para inibir angiogénese em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) [8]. Também previne a toxicidade induzida pela cisplatina e apoptose em células MCF-10A epiteliais normais da mama humano, mas não em células de cancro da mama [9]. Estes resultados sugerem fortemente que os medicamentos à base de plantas têm efeitos potencialmente benéficos na progressão do câncer e melhorar por quimioterapia convencional ou complicações decorrentes da radioterapia.

A fermentação de ervas medicinais, um processo de decomposição mediado por micróbios ou fungos, é pensado para exercer efeitos favoráveis ​​sobre a absorção, biodisponibilidade, e a actividade farmacológica dos extractos à base de plantas por meio da aceleração da produção ou conversão de componentes activos nos seus metabolitos ou através da criação de substâncias de baixo peso molecular, tais como a aglicona de glicósido [10,11]. Além disso, vários estudos têm demonstrado que a fermentação de extractos medicinais melhora os seus efeitos terapêuticos. Por exemplo, a fermentação de

anoectochilus formosanus

usando

Lactobacillus acidophilus

melhorou a sua actividade anti-oxidante, aumentando a quantidade de fenóis totais [12]. Recentemente, nosso grupo relatou efeitos benéficos da

Lactobacillus

fermentação, em que hwangryunhaedoktang (HR) e oyaksungisan (OY) exibiram reforçada efeitos anti-inflamatórios em 264,7 células RAW estimulados com LPS após a fermentação [13,14]. Além disso, a administração de RH fermentada tinha um efeito inibidor maior sobre a perda óssea em ratos ovariectomizados (OVA), aumentando a densidade mineral óssea e microestrutura do osso em comparação com o RH não fermentada [15].

Jaeumgangwha-Tang ( JGT,

Zi-yin-jiang-huo-tang

em chinês,

Jiin-koka-to

em japonês) é uma fórmula de ervas tradicional oriental, e tem sido muito utilizado na China, Japão e Coréia para nutrir yin e fogo direto para baixo causado pela falta de água nos rins. JGT foi descrito no Dongui Bogam, um livro coreana cumprido por Heo junho (1539-1615), para ter efeitos farmacológicos para o tratamento de doenças respiratórias e renais, suores nocturnos, tosse, febre na parte da tarde, catarro profusa, hemoptise, perda de apetite, cuspindo sangue, constipação e rubor facial. Estudos recentes demonstraram que JGT inibida reacções alérgicas, inflamação, dor e convulsões, e potenciada a resposta imune [16]. Além disso, JGT inibiu o desenvolvimento de propionato de testosterona (TP) induzida por hiperplasia benigna da próstata (HBP) dramaticamente num modelo de rato [17]. JGT composto de 12 ervas medicinais, incluindo

Paeoniae Radix

,

Angelicae Gigantis Radix

,

Rehmanniae Radix Preparata

,

Atractylodis Rhizoma Alba

,

Liriopis Tuber

,

Rehmanniae Radix Crudus

,

Citri Unshius Pericarpium

,

Anemarrhenae Rhizoma

,

Phellodendri Cortex

,

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

,

Zingiberis Rhizoma Crudus

, e

Zizyphi Fructus

. Várias ervas individuais em JGT, incluindo

Angelicae Gigantis Radix

,

Asparagi Tuber

,

Anemarrhenae Rhizoma

, e

Paeoniae Radix

, provocar efeitos anti-câncer por indução de apoptose [18]. No entanto, nenhum estudo ainda relataram efeitos anti-câncer de JGT.

Neste estudo, nós examinamos o efeito anti-câncer do JGT em termos de induzir a morte celular e inibir o crescimento do tumor

in vivo

usando células de fibrossarcoma humano HT1080 altamente tumorigénicas e elucidou o mecanismo de acção detalhado atrás sua actividade quimioterapêutica. Além disso, investigamos se

Lactobacillus

fermentação melhora os efeitos anti-câncer de JGT usando um

in vivo

modelo de xenotransplante tumoral.

Materiais e Métodos

as linhas celulares

as células humanas fibrossarcoma HT1080 (KCLB no. 10121), adenocarcinoma da próstata PC-3 células humanas (KCLB no. 21435), e células AGS de carcinoma gástrico humano (KCLB no. 21739) foram obtidos a partir da Korean Linha Cell Bank (Seoul, Coreia) e cultivadas em meio RPMI 1640 (Cellgro, Manassas, VA, EUA) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (Cellgro) e penicilina (100 U /mL) /estreptomicina (100 ug /mL) (Cellgro) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora. hepatócitos de murino foram isolados utilizando um sistema de perfusão com algumas modificações e incubadas como descrito previamente [19].

Animais

Cinco semanas de idade, do sexo feminino BALB /c ratinhos nus foram adquiridos a partir de Nara Biotech ( Seul, Coreia) e alojados em instalações livres de patógenos específicos sob condições constantes (12 h ciclo claro-escuro a 22 ± 1 ° C e 55 ± 5% de umidade). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso do animal do Korea Institute of Oriental Medicine (kiom, Daejeon, Coreia do Sul) com o número de referência # 14-040 e executada de acordo com as diretrizes da Comissão Cuidado e Uso do animal em kiom.

de produtos químicos e anticorpos

Rodamina 123, iodeto de propídio (PI), 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), e 3- (4,5-Dimetil-2-tiazolilo ) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) foram adquiridos a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). SP600125, SB203580, PD98059 e foram obtidos de Calbiochem (San Diego, CA). Os anticorpos contra p21, p27, ciclina B, ciclina D, ciclina E, quinase dependente de ciclina (CDK) 2, CDK4, CDK6, Bcl-2, XIAP, Bad, p-Bad, Bax, Bim, Bok, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, poli ADP ribose polimerase (PARP), p38, p-p38 (Thr180 /Tyr182), quinase regulada extracelular (ERK) 1/2, P-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), c-Jun N-terminal kinase (JNK), e p-JNK (Thr183 /Tyr185) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Anti-α-tubulina foi obtida a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, EUA). Para a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), em acetonitrilo de grau HPLC foi obtido a partir de J. T. Baker (Philipsburg, NJ, EUA) e ácido trifluoroacético (TFA) e 5-hidroximetil furfural (5-HMF) foram obtidos a partir de Sigma. Paeoniflorin glicirrizina e foram adquiridos a partir de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tóquio, Japão). Nodakenin, nodakenetin, berberina e palmatina foram obtidos a partir Faces Biochemical Co. (Wuhan, China), e hesperidina foi obtido a partir de Coreia do Food and Drug Administration (KFDA, Osong, Coreia).

Preparação de JGT, aJGT e fJGT162

Ervas para uma decocção de JGT foram adquiridos de Yeongcheon Oriental Herbal Mercado (Yeongcheon, Coreia) ea quantidade de cada erva foi listada na Tabela 1. a autenticidade das espécies de plantas foi validado pelo Prof. Ki Hwan Bae (Universidade Nacional de Chungnam, Daejeon, Coreia do Sul), e todas as amostras de comprovação foram depositados no banco de ervas em kiom. Um total de 1.874,5 g picada fórmula JGT foi embebido em 18,745 L de água destilada, fervida durante 3 h utilizando Herb Extractor (Cosmos-600 Extractor, Gyungseo Co., Coreia), e em seguida filtrada através de peneiras de teste padrão (150 mm, Retsch, Haan , Alemanha). Antes da fermentação, JGT decocção foi ajustado a pH 7,0 usando NaOH 1 M e depois esterilizado em autoclave durante 15 min a 121 ° C. Uma cultura pura de

Lactobacillus acidophilus

(KFRI162) foi obtido a partir de Food Research Institute Coreia (KFRI) e incubadas em meio MRS durante 24 h a 37 ° C como descrito anteriormente [20]. Para preparar fJGT162, autoclavado JGT (aJGT) foi adicionado com 1 × 10

8 UFC /ml

G

.

acidophilus

, e fermentada a 37 ° C durante 48 h. O pH final de tipo selvagem JGT, aJGT, e fJGT162 foi 7,00 ± 0,00, 5,45 ± 0,01, e 3,80 ± 0,01, respectivamente. JGT, aJGT, e fJGT162 foram passados ​​através de um filtro de líquido 60 mícrons de nylon (Millipore, Bedford, MA, EUA), liofilizado, e armazenado num excicador a 4 ° C. Para

In vitro

experiências, o pó liofilizado foi dissolvido em 10% (v /v) de DMSO em água destilada (DW) a uma concentração final de 50 mg /mL e centrifugou-se a 14000 rpm durante 10 min ; O sobrenadante foi então filtrada (0,22 um, tamanho de poro).

ensaio de proliferação celular e coloração com DAPI

As células plaqueadas em placas de cultura de 96 poços (5 x 10

3 /poço) foram tratadas com as concentrações indicadas, durante 48 h, e os ensaios MTT foram realizados como descrito anteriormente [21]. Para a coloração DAPI, as células cultivadas e tratadas com JGT em 35 mm de vidro pratos de fundo foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 min, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 durante 10 minutos, coradas com DAPI (0,5 ug /mL) durante 10 min, e observado sob um microscópio confocal de varrimento laser (FV10i-W; Olympus Optical Co. Ltd, Tóquio, Japão).

ciclo celular análise

as células na fase de crescimento exponencial foram tratadas com 1000 ug /mL JGT para 12, 24, e 48 h. Após a colheita, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado e fixada em gelo-etanol a 70% frio a -20 ° C durante pelo menos 24 h. As células fixadas foram lavadas duas vezes com PBS gelado, e o ADN intracelular foi corado utilizando uma solução de PI (0,1% de Triton X-100, 0,1 mM de EDTA, 50 ug /ml de RNase A, 50 ug /mL de PI em PBS) a 4 ° C durante 30 min no escuro. A distribuição do ciclo celular foi analisada utilizando citometria de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e software WinMDI 2,8 (J. Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, EUA).

Medição mitocondrial potencial de membrana (MMP, ΔΨ

m)

Após o tratamento com JGT (500 e 1000 ug /mL), durante 24 e 48 h, as células foram lavadas duas vezes com PBS e depois incubadas com rodamina 123 no corante de fluorescência uma concentração final de 5 uM a 37 ° C durante 30 min. A fluorescência da rodamina 123 foi analisado utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur e observados sob um microscópio de fluorescência (Olympus TH4-200; Olympus Optical Co. Ltd). Para JC-1 coloração, as células cultivadas e tratadas com JGT em 35 mm de vidro pratos de fundo foram coradas com JC-1 (5 ug /ml) no escuro durante 10 min a 37 ° C, lavou-se com meio de cultura, e observado sob um microscópio confocal de varrimento laser.

análise Western blot

as células foram lavadas duas vezes com PBS e lisados ​​celulares inteiros foram obtidos usando a proteína de mamífero M-PER reagente de extracção (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). As concentrações de proteína foram determinadas usando o kit de ácido bicinconínico (Sigma). Uma quantidade igual de proteína foi submetido a electroforese, imunologicamente, e detectado como relatado anteriormente [21].

In vivo

tumor modelo de xenotransplante

Fêmea camundongos BALB /c nu às 6 -week-idade (n = 15) foram injectados por via subcutânea na região abdominal com células HT1080 (2 × 10

6 /ratinho). No dia 7 após a inoculação do tumor, quando os tumores atingiram um volume de ~ 100 mm

3, os ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 5 por grupo), e diariamente administrado com soro fisiológico (controle), aJGT (120 mg /kg), ou fJGT162 (120 mg /kg) num volume de 100 uL, durante 14 dias. A dose administrada por rato foi calculada a partir da quantidade utilizada em adultos humanos (37,49 g /60 kg de peso corporal /dia) e o rendimento de extracto em pó (39,74% em aJGT e 39,53% em fJGT162). Os ratinhos foram observados durante o aspecto macroscópico e o comportamento, e os seus pesos corporais foram medidos diariamente. No dia 21, os ratinhos foram sacrificados por injecção intraperitoneal de uma mistura de Zoletil (Virbac, Magny-en-Vexin, França) e Rompun (Bayer, Seul, Coreia do Sul) (2: 1, 200 mL), e em seguida, os tumores foram excisados ​​para medição do seu peso.

a avaliação da segurança de aJGT e fJGT162

Para avaliar a segurança dos aJGT e fJGT162, /camundongos BALB fêmea de 6 semanas de idade c nu (n = 3 por grupo) foram alimentados com veículo (solução salina), aJGT (120 mg /kg), ou fJGT162 (120 mg /kg) por dia, durante 14 dias do período experimental. aspecto macroscópico e o comportamento de ratinhos foram diariamente verificada e os seus pesos corporais foram medidos a cada dois dias. No dia 14, os ratinhos foram sacrificados e os pesos de órgãos principais foram medidos. amostras de sangue e soro total coletados foram analisados ​​em parâmetros hematológicos e sorológicos utilizando o sistema ADVIA 2120i hematologia (Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY) e XL 200 (Erba Diagnostics Mannheim, Alemanha), respectivamente.

A análise cromatográfica de JGT , aJGT e fJGT162

Para comparar os perfis fitoquímicos de JGT, aJGT e fJGT162, HPLC foi realizada utilizando uma máquina-DAD HPLC (LaChrom Elite, Hitach alta Technologies Co., Tóquio, Japão), como descrito anteriormente com algumas modificações [22]. A separação cromatográfica foi obtida utilizando uma coluna Phenomenex C Luca

18 coluna (4,6 mm × 250 mm, 5 um). Um gradiente de eluição usando TFA a 0,1% em água desionizada (A) e acetonitrilo (B) foi executado da seguinte forma: 0-5 min com 5% de B, 5-15 min, com 5-12% de B, 15-25 min, com 12% B, 25-65 min, com 12-50% de B, 65-70 min e com 50-50% de B. O caudal e o volume de injecção foi de 1 mL /min e 10 mL, respectivamente, e cromatogramas de HPLC foram obtidos utilizando UV a 190-400 nm. Padrão (5-125 ug /mL) e soluções de amostra (20 mg /mL) foram dissolvidos e diluídos em metanol.

A análise estatística

Os dados são apresentados como médias ± desvio padrão (SD) . As diferenças entre grupos foram analisadas por meio de Student

t

-test com o software SigmaPlot 8.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). A

p

-valor 0,05 foi considerado para indicar uma diferença significativa.

Resultados

JGT diminui a viabilidade e induz G

1 célula parada do ciclo em células HT1080

Para examinar o anti-câncer efeito da JGT e elucidar os mecanismos detalhados da sua actividade quimioterápico, usamos linha de células de fibrossarcoma humano altamente tumorigênico HT1080. Em primeiro lugar, examinou os efeitos de JGT no crescimento celular utilizando ensaios MTT após o tratamento com 25-1000 ug /ml JGT durante 48 h. Como mostrado na Fig 1A, o tratamento com 500 e 1000 ug /mL JGT diminuiu a viabilidade celular marcadamente HT1080 e induzida a maioria das células para encolher e arredondar para cima, o que é uma característica típica da apoptose. Além disso, JGT reduziram a viabilidade de AGS de carcinoma gástrico humano e carcinoma da próstata humano PC-3 em células de um modo dependente da dose, enquanto que uma concentração comparável de DMSO até 0,2% teve pouca influência sobre a proliferação celular (Fig S1). Em contraste, os hepatócitos normais não foram afectados pelo tratamento JGT, mesmo após 48 h, com 1,000 ug /mL, em termos de proliferação celular ou aparência morfológica, sugerindo que não é hepatotóxico JGT (Fig 1B). Análise da progressão do ciclo celular utilizando a coloração de PI mostrou que o tratamento JGT durante 12 e 24 horas aumentou a proporção de células em G

uma fase de 38,49 e 44,71%, respectivamente, em comparação com células de controlo não tratadas (33,22%). O número de células apoptóticas no subg

0 /L

1 fase foi consideravelmente aumentada pelo JGT a 4,99 e 9,49% após o tratamento durante 24 e 48 h, respectivamente, em comparação com células de controlo não tratadas (1,13%), sugerindo que a proliferação mediada por JGT G

1 célula parada do ciclo celular retardado e morte celular induzida, consequentemente, (Fig 2A) como período de incubação foi prolongada. Consistente com isto, transferência de Western demonstrou que JGT aumentou os níveis de p21 inibidores de CDK e p27 e diminuição dos níveis de ciclina B, ciclina D, ciclina E, CDK2, CDK4 e CDK6, em células HT1080 significativamente em comparação com células de controlo não tratadas (Fig 2B ).

células humanas fibrossarcoma HT1080 (a) e hepatócitos de murino (B) foram tratadas com as doses indicadas de JGT durante 48 h, e a viabilidade celular foi determinada utilizando ensaios de MTT. células tratadas com JGT foram observados sob um microscópio invertido (ampliação de 40 ×). Os dados são representativos de três experiências independentes realizadas em triplicado e são expressos como médias ± DP. *

p Art 0,05 vs. controlo não tratado.

(A), células HT1080 foram incubadas com 1000 ng /mL para JGT 12, 24, e 48 h, e a distribuição do ciclo celular foi analisada após coloração com PI. (B) Os níveis de proteínas relacionadas com o ciclo celular em células tratadas com JGT foram determinados por Western blotting. As intensidades de banda relativas aos de células não tratadas foram calculados utilizando o software ImageJ após a normalização para expressão da tubulina. Os dados são representativos de três experiências independentes.

JGT provoca a morte celular por apoptose dependente da caspase em células HT1080 através da indução de dano mitocondrial

Para clarificar a morte celular por apoptose causada por JGT, primeiro níveis avaliados de proteínas relacionadas com a apoptose, utilizando transferência de Western. Como mostrado na Fig 3A, JGT reduziu a expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e XIAP significativamente, aumentou os níveis de pró-apoptótica Bad, Bax, Bim, e Bok, e induziu a clivagem de caspase-3, -7, -8, -9, e PARP. Semelhante ao observado em células HT1080, relacionadas com o ciclo celular regulado-JGT, anti-apoptótica, e proteínas pró-apoptóticas e aumento da clivagem de PARP em células PC-3 (Fig S2). Coloração DAPI JGT confirmou que aumentou o número de núcleos apoptóticos mostrando condensação de cromatina e fragmentação de ADN (Fig 3B). Na via intrínseca apoptose, perturbação do potencial de membrana mitocondrial (MMP,

m) é um ponto irreversível na cascata da morte, e é regulado pelos membros pró-apoptóticos e anti da família Bcl-2. Especificamente, pró-apoptótica Bax favorece o vazamento de factores apoptóticos da mitocôndria, enquanto que anti-apoptótica de Bcl-2 inibe a esta fuga de [23-25]. Medindo MMP (ΔΨ

m) usando rodamina 123 corante de fluorescência revelou que o tratamento JGT induzida a perda de MMP (ΔΨ

m) significativamente na dose e modos dependentes do tempo. O tratamento com 500 e 1000 ug /mL JGT durante 48 h diminuiu a percentagem de células com um elevado MMP (ΔΨ

m) de 82,15% e 58,20%, respectivamente, em comparação com células de controlo não tratadas (94,38%) (Fig 4A) . microscopia de fluorescência confirmou esta diminuição da MMP (ΔΨ

m; Fig 4B). Além disso, a perda de MMP (ΔΨ

m) induzida por JGT foi confirmada utilizando o corante fluorescente de JC-1, que apresenta uma acumulação potencial-dependente na mitocôndria. Em um alto MMP (ΔΨ

m), JC-1 permanece de forma agregada e é observado como coloração pontuar vermelho, que se afigura como coloração monomérica difusa verde a um baixo MMP. Como mostrado na Fig 4C, JGT induziu uma perda dependente da dose notável de MMP (ΔΨ

M) 48 h pós-tratamento.

células HT1080 (A) foram tratados com 500 e 1000 ug /mL JGT durante 24 e 48 h, e os níveis de proteínas relacionadas com a morte de células foram analisados ​​por transferência de Western. As intensidades das bandas em relação a células não tratadas foram calculados utilizando o software ImageJ após a normalização para expressão da tubulina. (B) para a detecção de células apoptóticas, as células tratadas com 500 e 1000 ug /ml durante 48 h JGT foram corados com DAPI e observados sob um microscópio confocal. Os dados são representativos de três experiências independentes, e expressos como médias ± SD de 5 campos aleatórios por amostra. *

p Art 0,05 vs. controlo não tratado.

(A) A despolarização do potencial de membrana mitocondrial (MMP, ΔΨ

M) foi examinado em células HT1080 de controlo e JGT-tratados após coloração com rodamina 123. O percentagem de células com um elevado MMP (ΔΨ

m) em comparação com células de controlo não tratadas foi calculada usando WinMDI 2,8. (B) As células-Rodamina 123 corados foram observados sob um microscópio de fluorescência (40 × 200 e × ampliação). (C) A perda de MMP (ΔΨ

M) foi examinada usando JC-1 após o tratamento com coloração JGT durante 48 h (200 × 600 e × ampliação). Os dados são representativos de três experiências independentes.

JGT induz a morte celular por activação de p38 e ERK

Estudos anteriores demonstraram que as vias de sinalização MAPK poderia induzir quer a proliferação celular ou morte celular, dependendo do tipo de célula e o estímulo [26,27]. O tratamento com 1,000 ug /ml JGT elevados os níveis de p38 fosforilada e ERK significativamente, mas teve pouca influência sobre a fosforilação de JNK em células HT1080 (Fig 5A) e PC-3 (S3 células FIG). Para elucidar o papel da p38 e a activação de ERK em morte celular mediada por JGT, foram utilizados inibidores farmacológicos de p38 (SB203580), ERK (PD98059), e JNK (SP600125). Pré-incubação com SB203580 e PD98059 protegido células tratadas com JGT de morte de forma eficiente, enquanto que SP600125 teve pouco efeito. Além disso, a pré-incubação com o inibidor da pan-caspase z-VAD-FMK inibiu a morte celular mediada por JGT quase completamente (Fig 5B e 5C). Colectivamente, estes dados sugerem que a morte celular mediada por JGT é exercida através de p38 e activação de ERK seguido pela activação de caspase.

(A) células foram tratadas com 1000 fig /ml para JGT 1, 6, 12, e 24 h, e os níveis de MAPK totais e fosforiladas foram medidos por transferência Western. As intensidades das bandas em relação a células não tratadas foram calculadas após normalização para a expressão da tubulina. Os dados são representativos de três experiências independentes. (B) Depois de pré-tratamento, com ou sem inibidores específicos (10 uM), as células foram tratadas com 500 e 1000 ug /mL JGT durante 48 h, e observados sob um microscópio invertido. (C) A viabilidade das células em (B) foi determinada utilizando ensaios MTT. Os dados são representativos de três experiências independentes realizadas em triplicado e são expressos como médias ± DP. *

p

0,05 vs. controlo não tratada, #

p .

0,05 vs. sem inibidor

Fermentação do JGT melhora seu efeito inibitório sobre

in vitro a proliferação celular e

in vivo

crescimento do tumor sem efeitos adversos

Para investigar o efeito da fermentação bacteriana da JGT, comparamos a morte- anti-proliferativa e celular efeitos indutores de tipo selvagem JGT, autoclavados /não fermentada JGT (aJGT), e autoclavados /fermentados JGT (fJGT162) em células HT1080. Como mostrado na Fig 6A, aJGT fJGT162 e reduziu o número de células viáveis ​​de um modo dependente da dose, semelhantes aos efeitos observados com JGT na Fig 1A. No entanto, fJGT162 exibiu um efeito inibitório superior sobre a proliferação de células do que o JGT não fermentada e aJGT, e as modificações morfológicas apoptóticas em células tratadas com fJGT162 foram mais severas do que aquelas nas células tratadas com aJGT. Em PC-3 e nas células AGS, fJGT162 tinha melhorado actividade na inibição da proliferação das células e indução de morte celular em comparação com JGT e aJGT (S4 figura). Além disso, a transferência de Western revelou que ambos aJGT e fJGT162 aumentou os níveis de p21, p27, Bax, e a clivagem de PARP, e diminuíram os níveis de ciclina B, ciclina D, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6, e XIAP significativamente em comparação com As células de controlo não tratadas (Fig 6B). Além disso, tanto aJGT e fJGT162 activada de p38 e ERK significativamente, mas teve pouco efeito na activação de JNK (Figura 6C), consistente com os efeitos do tratamento JGT. Para avaliar se os efeitos anti-câncer de JGT foram reforçadas por fermentação, o

foram comparados vivo

crescimento do tumor em efeitos inibitórios de aJGT- e fJGT162. As células HT1080 foram inoculadas por via subcutânea na região abdominal de ratinhos nus BALB /c, e 7 dias depois, os ratinhos (n = 5) com o tumor bastante grande (~ 100 mm

3) foram tratados diariamente com soro fisiológico, aJGT, ou fJGT162 durante 14 dias. Tal como apresentado na figura 7A, o tratamento com 120 mg /kg aJGT suprimiu o crescimento do tumor com sucesso em comparação com ratinhos de controlo tratados com solução salina, enquanto que fJGT162 exibiu um efeito inibidor mais potente sobre a

In vivo

crescimento do tumor do que aJGT. Os ratinhos de controlo tinham um peso tumoral médio de 3,95 ± 0,50 g, enquanto que os ratinhos tratados com aJGT e fJGT162 tinham pesos de tumor de 1,26 ± 0,56 g e 0,54 ± 0,38 g, reflectindo reduções de 68,1% e 86,3%, respectivamente (Fig 7B). Estes resultados sugerem que JGT é uma formulação anti-câncer potente, e que a fermentação melhora a

in vivo

efeitos anti-câncer de JGT notavelmente. Além disso, os ratinhos da perda de peso significativa em aJGT- e fJGT162-administradas não foi observada ao longo do tratamento, indicando aJGT e fJGT162 não demonstraram efeitos tóxicos graves (Fig 7C). Para avaliar se a administração diária de aJGT fJGT162 e provoca toxicidade grave, comparou-se o peso corporal, peso dos órgãos, e os parâmetros hematológicos /serológicos em ratinhos tratados com veículo (solução salina), aJGT, ou fJGT162. A administração de aJGT e fJGT162 a uma dose de 120 mg /kg durante 14 dias não afectou corporais e pesos de órgãos (Tabelas S1 e S2). Além disso, os valores de GOT, GPT, BUN, CRE, e os parâmetros hematológicos não foram significativamente diferentes entre aJGT-, fJGT162-, e ratos tratados com solução salina (Tabelas S3 e S4). Estes dados indicam que a administração repetida de aJGT e fJGT162 na dose de 120 mg /kg não têm efeitos adversos.

(A), células HT1080 foram tratados com as concentrações indicadas de aJGT ou fJGT162 durante 48 h, e a viabilidade celular foi avaliada utilizando ensaios de MTT e a morfologia das células foi observada sob um microscópio invertido. Os dados são representativos de três experiências independentes realizadas em triplicado e são expressos como médias ± DP. *

p

0,05 vs. controlo não tratada, #

p 0,05 vs.

JGT ou aJGT. (B) Os níveis de cycle- celular e proteínas relacionadas com a morte celular em células HT1080 ou aJGT–tratados fJGT162 foram examinadas por transferência de 48 h pós-tratamento Ocidental. (C) A activação da MAPK foi analisado por transferência de Western após aJGT fJGT162 ou tratamento de 1, 6, e 18 h. As intensidades de banda relativas aos de células não tratadas foram calculadas após normalização para a expressão da tubulina.

(A), células HT1080 (2 × 10

6 /murganho em 200 uL de PBS) foram inoculadas por via subcutânea no ratinhos BALB /c nus. Após 7 dias os ratinhos foram tratados diariamente com soro fisiológico (controle), 120 mg /kg aJGT, ou 120 mg /kg durante 14 dias fJGT162. No 21 ° dia após a inoculação do tumor, os tumores foram removidos e fotografados. (B) O peso final do tumor no final da experiência foi medido. (C) O peso corporal foi medido durante a experiência. Os dados são médias ± DP.

Identificar os componentes principais em JGT, aJGT e fJGT162 usando HPLC-DAD

Para analisar ingredientes ativos em JGT, aJGT e fJGT162, foram selecionados 8 compostos marcadores: 5-HMF (

Rehmanniae Radix Preparata

), paeoniflorin (

Paeoniae Radix)

, glycyrrhizin (

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

), nodakenin e nodakenetin (

Angelicae Gigantis Radix

), berberina e palmatina (

Phellodendri Cortex

) e hesperidina (

Citri Unshius Pericarpium

). Um gradiente de eluição de água e o acetonitrilo foi aplicado para adquirir uma separação óptima, e o TFA foi utilizado para melhorar a forma do pico e inibir a cauda de pico. Os comprimentos de onda de UV dos oito compostos foram ajustadas com base na absorção UV máxima de cada componente. Cada composto nas amostras foi identificado pela comparação dos tempos de retenção (

t

R

) e espectros de UV dos compostos padrão quimicamente definidos. Como mostrado na Figura 8 e S5 Fig, 5-HMF (1,

t

R

: 9.3 min), paeoniflorin (2,

t

R

: 32,6 min), nodakenin (3,

t

R: 40,7 min), hesperidina (4,

t

R

: 43,3 min), nodakenetin (5,

t

R

: 48,2 min), a berberina (6,

t

R

: 51,2 min), palmatina (7,

t

R

: 51,7 min), e glycyrrhizin (8,

p Art Os dados são apresentados como médias ± DP.