Abstract

Fundo

O análogo de vitamina E α-tocoferol succinato redox-silenciosa (α-TOS) foi encontrado a cooperar de forma sinérgica com a vitamina K3 (VK3) mais ácido ascórbico (AA) na indução de apoptose de células-selectiva do cancro através de uma via independente de caspases. Aqui nós investigamos o mecanismo molecular (s) subjacente a morte celular induzida em células de câncer de próstata em α-TOS, VK3 e AA, e o uso potencial de combinação de drogas específicas para o tratamento de câncer de próstata.

Metodologia /Principais achados

a geração de ROS, a resposta celular ao estresse oxidativo, e autofagia foram investigados em células de câncer de próstata PC3 usando drogas em doses sub-tóxicas. Nós avaliamos se factor de indução de apoptose mediada por PARP1 (FIA) libertação desempenha um papel na apoptose induzida pela combinação dos agentes. Em seguida, o efeito da combinação de α-TOS, VK3 e AA no crescimento de tumores foi examinada em ratinhos nus. VK3 além de AA induziu formação de ROS precoce associada com a indução de autofagia em resposta ao stress oxidativo, que foi reduzido por α-TOS, impedindo a formação de autofagossomas. α-TOS induzida desestabilização mitocondrial levando à liberação de FIA. A translocação da FIA da mitocôndria para o núcleo, em resultado do tratamento combinatória, foi mediada pela activação PARP1. A inibição da FIA, bem como de PARP1 eficientemente atenuada apoptose desencadeada pela combinação de drogas. Usando um modelo de rato com câncer de próstata, a combinação de α-TOS, VK3 e AA foi mais eficiente na supressão do tumor do que quando as drogas foram administradas separadamente, sem efeitos colaterais deletérios.

Conclusões /Significado

α-TOS, um agente de apoptose de direccionamento mitocôndrias, comuta em doses sub-apoptóticos de sobrevivência dependente da autofagia de células cancerosas para o seu desaparecimento por promover a indução de apoptose. Dado o prognóstico sombrio para pacientes com câncer, este achado é de relevância clínica potencial

Citation:. Tomasetti M, Nocchi L, Neuzil J, J Goodwin, Nguyen M, Dong L, et al. (2012) Alpha-tocoferol Succinate Inibe autofágica sobrevivência das células do cancro da próstata induzida pela vitamina K3 e ascorbato para provocar a morte celular. PLoS ONE 7 (12): e52263. doi: 10.1371 /journal.pone.0052263

editor: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Reino Unido

Recebido: 26 de junho de 2012; Aceito: 12 de novembro de 2012; Publicação: 18 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Tomasetti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa da Fundação Câncer de próstata da Austrália ao JN, ea parte adicional do financiamento da investigação da Universidade Politécnica de Marche. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As mitocôndrias surgiram recentemente como alvos interessantes para drogas anti-câncer [1] – [3]. A vitamina K3 (VK3), uma versão sintética de vitamina K, apresenta actividade citotóxica em células cancerosas, causando danos mitocôndrias-dependentes por meio de ciclos redox, bem como a inibição selectiva de ADN polimerase-γ, a enzima chave da replicação do mtDNA [3], [4]. Para potenciar o seu efeito anti-cancro, VK3 foi combinado com o ácido ascórbico redox-activo (AA). O peróxido de hidrogénio gerado pela combinação VK3-AA tem sido relatado para induzir a morte celular em diferentes tipos de cancro [5], [6].

VK3-induzido por AA estresse oxidativo pode ser diferente em células tumorais e normais metabolismo das células, e pode permitir a manipulação concebido para melhorar a terapia do cancro. No entanto, em resposta a células de estresse oxidativo activam as vias que promovem a sobrevivência e adaptação [7]. Um tal mecanismo de resposta ao estresse é autofagia [8], [9]. ROS pode induzir autofagia, o que pode contribuir para a morte celular independente de caspase ou, em contraste, autofagia pode promover um papel protector contra a morte mediada por ROS [10], [11]. Portanto, a descoberta de moléculas que regulam a autofagia pode ser de grande importância no desenvolvimento de drogas para o tratamento do cancro.

concentrações Recentemente, sub-letais de VK3 e AA, em conjunto com uma dose sub-apoptótica de α-tocoferol succinato (α-TOS), ter sido mostrado induzir eficientemente a morte de células de cancro da próstata, que foi caracterizada pela fragmentação de ADN, lisossomal /perturbação mitocondrial, citocromo

C

libertação, enquanto falta de activação da caspase [12]. A evidência crescente sugere que as vias independentes de caspase desempenham um papel importante na morte do cancro, e o factor de indução de apoptose (AIF) está a emergir como um mediador central de este processo [13] – [16]. Relevante para esta premissa, a activação da enzima poli reparação de ADN (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP1) tem sido relatado como essencial para a libertação FIA por um mecanismo que envolve Ca

2+ influxo para o citosol [17] – [20].

utilizando doses sub-tóxicos de α-TOS com concentrações sub-tóxicos de VK3 + AA identificadas anteriormente [12], avaliou-se o efeito de α-TOS em autofagia ROS mediada desencadeada por VK3 e AA. O mecanismo (s) envolvido na morte celular induzida pelo agente combinação também foi investigada. Nós relatamos que VK3 além de AA induziu a formação de ROS precoce associada a indução de autofagia em resposta ao estresse oxidativo. A inibição da autofagia descobriu o papel protetor da autofagia induzida por AA VK3 + em células PC3. α-TOS foi encontrada para reduzir induzida por AA VK3 + formação de ROS revoga a ROS desencadeia a formação autofagossomas. No entanto, ROS produzidas foram suficientes para induzir a activação PARP1, o que resulta na libertação do factor AIF pró-apoptótica, promover a morte celular que se manifesta por marcas de apoptose, incluindo a condensação da cromatina. A relevância clínica desta pesquisa é fornecido pela supressão substancial de câncer em camundongos tratados com a combinação dos três agentes.

Resultados

α-TOS inibe a autofagia desencadeada por ROS gerados em resposta a VK3 e tratamento de AA

foi relatado que doses sub-tóxicos da combinação de VK3 (3 uM) com AA (0,4 mM) resultaram na geração intracelular de ROS, mas as células morreram apenas na presença de α -Tos (30? M) [12]. Para elucidar o papel do estresse oxidativo no tratamento de combinação, a formação de ROS e respostas celulares ao estresse oxidativo (autofagia) foram avaliados ao longo do tempo. O tratamento de células PC3 com VK3 e AA resultou na formação de moléculas de peróxido relacionadas dentro de 30 min, após o que o sinal fluorescente ROS-associado retornado ao seu nível basal. Enquanto α-TOS sozinho induziu uma formação tardia de moléculas de peróxido relacionado, que foi observada após 120 minutos de incubação, que reduziu o aumento precoce nos seus níveis de resposta para o tratamento das células com VK3 e AA sozinho (Fig. 1A, painel da esquerda). Para investigar se as mitocôndrias são a principal fonte de produção de ROS, os níveis de superóxido foram avaliadas usando dihydroetidium (DHE). Após a interacção com o superóxido, DHE produz brometo de etídio (EtBr) que se acumula no núcleo e produz fluorescência vermelha [21]. FIG. 1A (painel direito) Os documentos aumentar os níveis de superóxido dentro de 20-60 min de tratamento das células com VK3 e AA, que foi reduzida na presença de α-TOS. A coloração nuclear EtBr derivado de DHE ao longo do tempo foi detectada utilizando microscopia de fluorescência, e indica que, após tratamento com VK3 e AA, as bolhas apoptóticas contendo componentes nucleares foram formadas na superfície da célula após 60-120 min; 36-46% das células eram EtBr-negativo (células claras) como consequência da perda de cromatina. Redução do número de células com bolhas nuclear (18% de células pálido) foi observada a incubação prolongada. As células recuperadas após 180 minutos de incubação, indicando, portanto, um processo reversível. A presença de α-TOS inibiu marcadamente a “recuperação” das bolhas como evidenciado pelo aumento de células pálido (66%), promover a morte de células (Fig. 1B).

(A) As células PC3 foram tratadas com a-TOS (30 uM), VK3 e AA (3 uM VK3, AA 0,4 mM) e avaliadas para a geração de ROS usando DCF (um indicador de peróxido de hidrogénio) ou de DHE (um indicador de superóxido), expressa como média intensidade de fluorescência. As células foram avaliadas para o aumento da fluorescência utilizando citometria de fluxo. (B) a visualização microscópica das células PC3 manchado de DHE seguintes tratamentos de droga ao longo do tempo. Após a interacção com o superóxido, DHE (pontuam azul) produz brometo de etídio (EtBr) que se acumula no núcleo e dá fluorescência vermelha (painel superior). As vesículas contendo cromatina nuclear danificada reduzir a coloração com EtBr nuclear (células pálido). A citometria de fluxo quantificação de células (células pálido EtBr-negativos, o painel inferior) foi realizada em células PC3 tratadas como indicado. Os dados apresentados são valores médios ± S.D. (N = 3), as imagens de microscópio são representativos de três experiências independentes. Ampliação 600 ×, barra de escala = 10 mm.

Depois de ter documentado que o tratamento medicamentoso geração induzido de ROS, o próximo examinou seu efeito sobre a autofagia em células PC3 pela avaliação do padrão da expressão de microtúbulos -associated proteína-1 (LC3), por microscopia electrónica de transmissão (TEM), e através da formação de ácidos organelos vacuolares [22]. LC3 existe em duas formas, LC3-I (18 kDa) e LC3-II (16 kDa), sendo este último e aumentou durante autofagia por transformação da anterior [23] ligada à membrana. células PC3 tratadas com VK3 e AA mostrou um nível mais elevado da proteína LC3-II em 60-120 minutos pós-tratamento, que foi inibida na presença de α-TOS (Fig. 2A). MET foi realizada em células PC3 seguintes várias combinações de tratamentos. As células de controlo e α-TOS tratados com destaque mitocôndrias com cristas bem definido, dupla membrana intacta, a densidade homogênea e forma cilíndrica. Aparecimento de um grande número de autofagossomas com uma estrutura de dupla membrana no citoplasma foi observado por TEM após 120 minutos de tratamento com VK3 + AA, com pouco efeito sobre a morfologia mitocondrial. Em contraste, quando VK3 e AA foram combinadas com α-TOS, mitocôndrias anormal proeminente com cristas desorganizado, diminuição da densidade de electrões e aumento no eixo secundário foram observados consistentes com inchaço mitocondrial, enquanto que a formação de autofagossomas não foi detectada (Fig. 2B). A absorção do vermelho fluorescente AO apoia ainda mais o efeito inibidor de α-TOS na autofagia induzida por VK3 AA + (Fig. 2C).

células PC3 (A) foram tratados com as drogas, como indicado eo nível da proteína LC3-II normalizado para a-actina foi expresso como média ± desvio padrão do LC3-II /LC3-I densitométricos proporção. (B) As células PC3 foram tratadas com as drogas, como indicado, durante 2 h e avaliados quanto à morfologia por MET. Ampliação de 4.000 ×, barra de escala = 0,5 m (imagens superiores), ampliação de 9.000 ×, bar = 0,5 m; N = núcleo, m = mitocôndrias, a = autofagossomas. (C) células PC3 foram tratadas como indicado, e formação dos AO-acumulando organelas vesiculares ácidas (fluorescência laranja-vermelho) foi detectada por citometria de fluxo. (D) As células PC3 foram tratadas como indicado na presença ou ausência de inibidores autophagy (3mA e CQ), e a viabilidade celular foi assed após 24 h de incubação. (E) A formação de autofagossomas em células de controlo (1) e na presença de 3MA (2) e CQ (3) foi avaliada por transferência de Western quanto a expressão de LC3-II depois de 2 h de tratamentos com drogas. Os dados são expressos como uma alteração em relação ao controlo não tratado, e são valores médios ± S.D. (N = 3), as imagens são representativos de três experiências independentes. * P . 0,05, em comparação com controles

Em seguida, perguntou se a autofagia afeta a morte celular. Para resolver esta questão, a autofagia foi suprimida com o 3MA inibidor farmacológica (inibição fase inicial) e CQ (inibição fase tardia). células PC3 foram então tratadas com α-TOS ou VK3 + AA e α-TOS VK3 + + AA. Como mostrado na Fig. 2D, a inibição do processo de redução da viabilidade celular autophagic cedo em células tratadas com AA + VK3 numa extensão comparável ao que observado quando α-TOS foi combinado com VK3 + AA. Este efeito não foi encontrado quando bloqueando o último passo da via autophagic. A formação de autofagossomas na ausência ou na presença dos inibidores autofágicos 3mA e CQ foi avaliada como a expressão de LC3-II depois de tratamentos com drogas (2 h). A expressão induzida LC3-II + VK3 mistura AA, que foi inibida na presença de 3MA mas não CQ (Fig. 2E). Isto indica que a autofagia é uma resposta protectora para a morte celular induzida por VK3 + AA, e a inibição da autofagia na fase precoce é uma estratégia para induzir a morte celular.

Mecanismo de α-TOS, VK3 e AA- induzida morte celular

Para investigar o mecanismo (s) envolvida na morte celular induzida pela combinação α-TOS com VK3 + AA, avaliamos o papel da FIA. fraccionamento sub-celular mostrou que apenas quando a-TOS (30 uM) foi combinado com VK3 (3 uM) e AA (0,4 mM), FIA re-distribuído a partir da mitocôndria para o citoplasma e para o núcleo (Fig. 3A). Para testar se FIA ​​re-distribuição está envolvida na morte celular induzida pela combinação de três agentes, a proteína foi silenciada e a viabilidade celular avaliada. Como mostrado na Fig. 3B, siRNA alvejando FIA eficientemente silenciada a expressão FIA que, por sua vez, a morte celular induzida atenuada pela combinação de α-TOS, VK3 e AA. A eficácia da FIA siRNA está documentado na fig. 3C.

O painel (a) mostra imagens de microscopia de fluorescência FIA translocação para o núcleo, após 180 minutos de tratamento com um TOS-(30 uM), e AA VK3 (3 uM VK3, AA 0,4 mM) sozinho ou em combinação (painel da esquerda). A translocação nuclear de FIA ​​é demonstrada pela distribuição similar do vermelho (AIF-TRITC) e sinal azul (núcleo); ampliação de 600 ×, barra de escala = 10 mm. O painel da direita mostra a análise western blot de FIA ​​translocação em frações celulares. Organelo (org), citoplasma (cyto) e as fracções (Nucl) nucleares foram obtidos a partir de células PC3 tratadas com as drogas como acima e o nível de FIA ​​avaliada. células PC3 foram transfectadas com ARNsi NS FIA ou ARNsi, e avaliadas para o nível de proteína FIA (C). As células transfectadas foram tratadas como acima durante 24 h de incubação e avaliadas quanto a viabilidade usando o ensaio de MTT (B). Os dados apresentados são valores médios ± S.D. (N = 3), as imagens são representativos de três experiências independentes. O símbolo “*” indica resultados estatisticamente diferentes para FIA siRNA- e NS células transfectadas com siRNA com p . 0,05

Para determinar a relação direta entre o aumento intracelular níveis de ROS e morte celular FIA mediada induzida pelo tratamento combinatória, as células PC3 foram pré-tratados com o antioxidante NAC, o qual bloqueou eficientemente a translocação nuclear e citoplasmática da FIA induzidos pelos três agentes, indicando o papel de ROS (Fig. 4A, B). A inibição da translocação nuclear FIA foi associada com uma revogação da morte celular induzida por droga (Fig. 4 C, D). Além disso, para testar se a re-distribuição do FIA ocorre é um modo independente de caspases, as células foram expostas aos três agentes, na presença do inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk, que nem bloqueada FIA translocação nem exercida qualquer efeito protetor contra o tratamento combinatória (Fig. 4 a-D).

Painel (a) documenta FIA-TRITC visualizados por microscópio de fluorescência, ampliação de 600 ×, barra de escala = 10 mm. (Painel da esquerda), e as imagens de Western blot (painel da direita) de FIA ​​translocação para o citosol e núcleo after180 mínimo de tratamento com um-TOS (30 uM), VK3 e AA (3 uM VK3, AA 0,4 mM) na ausência ou na presença de NAC (10 mM) ou z-VAD-fmk (10 pM). A densidade de banda FIA foi normalizada utilizando um actina ou lamina, e é expressa como média ± S.D. FIA

cito-FIA

nucl /AIF

org relação de densitometria. (B). efeito citotóxico do tratamento combinatória em células PC3, na ausência ou presença de NAC (10 mM) e z-VAD-fmk (10 pM) foi avaliado como viabilidade celular após 24 horas de exposição das células aos fármacos (C), e micrografias de contraste de fase da célula tratada correspondentemente estão representados (D); aumento de 200 ×, barra de escala = 100 mm. Os dados apresentados são valores médios ± S.D. (N = 3), as imagens são representativos de três experiências independentes. O símbolo “*” indica resultados estatisticamente diferentes para não tratada

vs

trataram células PC3 na ausência ou presença de NAC ou zVAD-fmk com p . 0,05

Tem sido previamente relatou que os danos de ADN mediada por ROS desencadeia a activação de PARP1 e subsequente morte celular [24]. activação PARP1 gera o polímero PAR no núcleo e translocar para a mitocôndria para mediar libertação FIA [20]. Para clarificar a relação entre a FIA e PARP1, avaliou-se a actividade de libertação FIA e PARP1 em células PC3, após exposição ao ácido a-TOS, VK3 e AA em diferentes pontos de tempo. FIA translocação para o citoplasma foi detectável dentro de 5 a 60 minutos do tratamento combinatória das células, e a libertação citoplasmática de AIF foi concomitante com a activação PARP1. Em contraste, a translocação de FIA ​​para o núcleo foi atrasada por, pelo menos, 60 minutos (Fig. 5A, B). Inibição de PARP1 por 3ABA atenuou tanto a translocação nuclear FIA (Fig. 5C, D) e indução da morte celular (Fig. 6 E, F).

O painel A mostra a cinética da actividade de libertação e o painel B FIA de PARP1 nas células PC3 expostos à ct-TOS (30 uM), VK3 (3 uM) e AA (0,4 mm). Painel C mostra micrografias de fluorescência usando imagens Western Blot (painel direito) de PARP1 e FIA ​​translocação PARP1-FITC e FIA-TRITC (aumento de 600 ×, barra de escala = 10 mm) (painel esquerdo), e para o núcleo após 180 min tratamento com á-TOS VK3 + + AA na ausência ou na presença de 3ABA (2 mM). (D) A densidade de banda FIA foi normalizada para a-actina ou lamina e expressos em média ± S.D. do FIA

cito-FIA

nucl /AIF

org relação de densitometria. (E) Efeito citotóxico do tratamento combinatória em células PC3, na ausência ou presença de 3ABA foi avaliado como viabilidade celular após 24 horas de exposição das células aos fármacos. Painel F mostra micrografias de contraste de fase das células tratadas com as três drogas, com ou sem 3ABA; aumento de 200 ×, barra de escala = 100 mm. Os dados apresentados são valores médios ± S.D. (N = 3), as imagens são representativos de três experiências independentes. O símbolo “*” indica resultados estatisticamente diferentes para não tratada versus células PC3 tratadas na ausência ou na presença de 3-ABA com p 0,05

O tratamento com α-TOS + VK3 + AA suprime a progressão do tumor.

de modo a avaliar o efeito anti-cancro das três drogas, Balb-c ratinhos nus com xenoenxertos PC3 foram tratados oralmente com doses sub-tóxicos de VK3 (3 mg /kg), AA (400 mg /kg), e com α-TOS (15 mg /kg) por via intraperitoneal entregue, e com as combinações VK3 + AA, ou α-TOS VK3 + + AA. Uma inibição do crescimento tumoral significativa foi observada no grupo de tratamento mais VK3 AA; este efeito foi consideravelmente aumentado no prolongamento dos tempos de tratamento, quando os dois agentes foram combinados com α-TOS (Fig. 6A). A terapia combinatória com as três drogas induziram formação de DNA strand ruptura (TUNEL positivo), correspondendo a um processo de apoptose, o que foi associado com a translocação nuclear FIA (Fig. 6B). Mais áreas morte de células tumorais foram encontrados em ratos expostos à terapia combinatória com tri-respeito aos ratinhos não tratados (85 ± 16 × 10

3? M

2

vs 238 ± 45 × 10

3 mm

2, respectivamente,

p Art 0,05). Este tratamento pareceu exercer nenhuma toxicidade detectável lado, uma vez que os ratinhos não mostraram nenhuma perda de peso, assim como não há sinais de citotoxicidade no rim e fígado, como detectado por análise histológica e por análises bioquímicas (dados não mostrados).

(a) ratos pelados Balb-C com xenotransplantes derivados células PC3 foram tratadas por administração oral de VK3 (3 mg /kg) andAA (400 mg /kg), e a injecção intraperitoneal de á-TOS (15 mg /kg) isoladamente ou em combinação, conforme indicado, 5 vezes por semana, e o volume do tumor (mm

3) foi quantificada por pinças. (B), secções de tumores embebidos em parafina fixadas em formalina (5 mm) foram inspeccionados para TUNEL positividade (verde células pontuado) (aumento de 200 ×, barra de escala = 100 mm) e foram imuno-coradas com anti-FIA IgG (setas brancas translocação nuclear indicou de FIA-TRITC e núcleos picnóticos detectada utilizando DAPI); ampliação de 400 ×, barra de escala = 50 mm. Os dados de volume de tumor são a média ± SEM (n = 8), não foram encontradas diferenças significativas entre os ratinhos controlo e ratos individuais tratados com a droga, enquanto que foram encontradas diferenças significativas entre os ratos de controle e VK3 + animais tratados com AA nos dias 22-31 ( p = 0,034) e α-TOS + VK3 + animais tratados com AA nos dias 43-49 (p = 0,043).

Discussão

foi utilizada administração oral de AA e VK3 no tratamento de doentes com cancro da próstata [25]. Esta abordagem foi benéfica quando a combinação droga foi co-administrados com agentes quimioterapêuticos conhecidos [26]. Assim, a co-administração de doses sub-letais de AA + VK3 (sistema redox-ativo) com o redox silenciosa α-TOS resultou em

in vitro a morte eficiente

celular. A combinação de VK3 + AA foi mostrado para promover sinergisticamente a produção de peróxido de hidrogénio no meio extracelular [12], [27].

Consistente com as observações anteriores, verificou-se que a combinação de VK3 + AA causada rápido geração de tanto peróxido de hidrogénio (DCF fluorescência) e superóxido (fluorescência DHE), atingindo um máximo de 10-20 min e 30-60 min de exposição das células para as duas drogas (

CF

Fig. 1a). Em resposta a esse stress oxidativo, as células activada a via autophagic. Isto foi evidenciado pela formação de bolhas e vesículas nucleares autofágicos (organelos vacuolares ácidas), bem como o aumento dos níveis da proteína LC3-II (

CF

fig. 2A-C). No entanto, após 180 minutos de este tratamento, as células completamente recuperado. Isto é mostrado por coloração induzida pela oxidação da DHE EtBr nuclear, o que documenta que o aumento do índice de células pálido observados após 60 min de tratamento com VK3 + AA diminui acentuadamente durante períodos de tempo prolongados (

CF

Fig. 1B). O inibidor 3MA autofagia (processo autophagic precoce) provoca a morte celular induzida por VK3 AA + indicando que autofagia é um mecanismo de protecção no contexto de células PC3 (

CF

Fig. 2D). Estes resultados indicam que o stress oxidativo precoce resulta numa resposta adaptativa de células cancerosas que permita a sua recuperação a partir do insulto. Por outro lado, as doses sub-apoptóticos de α-TOS induziu uma redução na formação de ROS desencadeada por VK3 + AA (

CF

Fig. 1A). Podemos hipótese de que a hidrólise de α-TOS por esterases em células conduz à geração de α-tocoferol (α-TOH), que actua como um eliminador de ROS [28]. Como encontrado anteriormente [29], observamos que o ROS gerados em resposta a cc-TOS consistem principalmente de espécies de peróxido de relacionados, mas não superóxido. Em contraste, α-TOS foi relatado para induzir a produção de superóxido por meio de interacção com o complexo II da cadeia respiratória mitocondrial [30]. Não se pode excluir que nas nossas condições experimentais, as doses sub-tóxicas ofα-TOS conduzir à geração de quantidades baixas de superóxido, que podem ser rapidamente dismutadas e escapar à detecção.

Não há formação de autofagossomas ou morfologia alterada de organelos foi observada em α-TOS- e VK3 + AA células tratadas (

CF

Fig. 2A-C). Isto liga a redução do ‘adaptável’ estresse oxidação prematura com a prevenção do processo de autophagic induzida pela combinação de VK3 + AA sozinho, e é ainda confirmada por TEM, revelando a ausência de autofagossomas em células tratadas pela combinação dos três drogas (

cf

Fig. 2B). A inibição da autofagia induzida byα-TOS promovido aparecimento de um aumento da sub-conjunto de células claras, a formação de bolhas nucleares e mitocondriais inchaço com cristas desorganizado e diminuição da densidade de electrões, todos os recursos de morte celular. Por conseguinte, a inclusão de α-TOS no tratamento combinatória de células PC3 inibe os mecanismos adaptativos e sobrevivência levando à indução da morte.

A indução de autofagia foi reportado para promover a sobrevivência de células tumorais, deste modo neutralizar ou limitando a eficácia da indução da morte celular por agentes quimioterapêuticos, comprometer o resultado da terapia do cancro [31]. De acordo com esta noção, os nossos dados mostram um papel protetor da autofagia após a exposição das células PC3 para VK3 e AA. Descobrimos que as células tratadas, que exibiram morfologia que lembra (autofágica) morte celular, em grande parte recuperado, e apenas uma pequena fração das células com potencial de trans-membrana mitocondrial interrompido foi além de resgate e morreu sob estas condições.

Verificou-se anteriormente que a apoptose é retardada em células sem as proteínas Bax e Bak, que são necessários para a permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP), que é uma característica da morte celular por apoptose e um pré-requisito para a célula a atravessar o ‘ponto de nenhum retorno “[32]. Verificou-se que α-TOS induz a translocação da Bax para dentro da mitocôndria em células de cancro da mama [33] – [36]. Outro relatório documentado α-TOS para induzir a apoptose mitocondrial envolvendo o eixo FoxO1-Noxa-Bak [37], [38]. Uma via intrínseca independente de caspases mediada por FIA-Bak foi previamente descrito [39]. O fragmento solúvel FIA é liberado da mitocôndria sobre permeabilização da membrana exterior através Bax /Bak poros [40]. Mostramos que a libertação FIA da mitocôndria é necessário para a morte celular induzida pelo tratamento combinatória de células de cancro da próstata com α-TOS VK3 + + AA em doses sub-tóxicos dos agentes individuais. Silenciar a proteína FIA por ARNsi atenua substancialmente a morte de células PC3 induzidas pelo tratamento combinatória (

CF

Fig. 3).

a produção de ROS desempenha um papel importante na libertação de AIF e o promoção da morte celular subsequente. Nós documentar que esta premissa é válido para o nosso sistema, que mostra que o eliminador de ROS NAC completamente abolida a morte de células PC3 expostos à combinação de α-TOS VK3 + + AA (

CF

Fig. 4). Nós documentamos ainda que a ativação PARP1 ROS-dependente está associado com o lançamento do FIA da mitocôndria para o núcleo (

cf

Fig. 5). Em resposta ao dano no DNA, PARP1 catalisa a síntese e a transferência de unidades de PAR para as proteínas aceitadoras, em que as suas actividades modulação e regulação da reparação do ADN [41], [42]. No entanto, os danos excessivos de ADN activa um programa de morte celular dependente de PARP1 único, que é independente de caspase, mas dependente FIA ​​[43]. Mesmo que, em menor grau no que diz respeito a VK3 + AA, a combinação AA α-TOS VK3 + + induzida formação precoce de ROS, que se verificou anteriormente para induzir danos no ADN precoce [12]. O dano no DNA induzido por ROS provocou um aumento robusto na actividade PARP1, o que resultou na libertação de AIF da mitocôndria para o citoplasma, e ainda mais para o núcleo. Assim, como consequência da activação sa PARP1, a proteína FIA translocado do citoplasma para o núcleo, resultando na indução de condensação da cromatina com subsequente morte celular (

CF

Fig. 5).

outros têm observado que altas doses de AA autofagia induzida em células de câncer de próstata, que não recuperaram e foram cometidos para morrer [10], [44]. As diferentes doses das drogas exercem efeitos diferentes sobre as células através da produção de quantidades variáveis ​​de ROS. Com base na insulto ROS, as células respondem de modo diferente pela indução da sua sobrevivência ou programa de morte. Aqui, as doses sub-tóxicos de VK3 + AA induziu um insulto ROS não são capazes de desencadear a morte celular, mas causando danos de organelos celulares com a subsequente activação do processo autophagic sobrevivência. A presença de α-TOS reduziu o insulto oxidativo induzido por AA VK3 +, inibindo, assim, a resposta de sobrevivência celular. No entanto, o ROS formados foram suficientes para induzir a activação PARP1 resultando na libertação FIA e a subsequente morte celular.

Dada a actividade anti-cancro possível dos três agentes, o efeito da combinação de α-TOS + VK3 + AA no crescimento de tumores foi examinada em ratinhos nus. A administração oral da mistura de VK3 + AA reduziu significativamente o crescimento do tumor nos dias 22-31 (p = 0,034). N positividade TUNEL foi encontrado nas secções de tumores tratados com VK3 AA +, o que sugere que a redução do tamanho do tumor induzida por VK3 + AA foi devido à inibição do crescimento do tumor em vez de morte celular (

CF

Fig 6A). Isto é corroborado pelo fato de que pelo tempo prolongado de exposição à droga (dias 35-49) os tumores re-começou a crescer. O tratamento com o crescimento α-TOS VK3 + + AA inibiu significativamente a tumor (dias 43-49, p = 0,04), induzindo a vastas áreas de morte celular associada a translocação nuclear FIA em comparação com os animais de controlo e aqueles tratados com as drogas individuais (

CF

Fig. 6A, B). Notavelmente, o efeito anti-tumoral do α-TOS + + VK3 combinação AA foi associada com nenhuns sinais de efeitos secundários deletérios. Estes resultados suportam o

In vitro

dados que mostram que α-TOS inibe a recuperação de células do cancro e a sobrevivência após o tratamento de AA + VK3, induzir a morte celular eficiente no prolongamento dos tempos de exposição para a combinação dos três agentes.

Conclusões

Muitos fatores, tais como a vascularização do tumor e captação de células de câncer afectar as concentrações de droga dentro massa tumoral. Por conseguinte, ao nível do tumor, as drogas anti-cancro pode ser não no nível de matar mesmo quando administrados em altas concentrações. Assim, em vez de induzir morte celular, níveis baixos de drogas anti-cancerosas poderia induzir uma resposta adaptativa levando as células cancerosas proliferam para. Aqui, verificou-se que a resposta celular adaptativa ao stress oxidativo induzido pelo sistema redox-activo de VK3 + AA foi superado pela combinação com o agente redox silenciosa α-TOS, o que causou uma mudança de sobrevivência autophagic a morte celular (Fig . 7). Uma vez que os níveis séricos de anti-cancro agentes estavam abaixo do limite de detecção, a sua farmacocinética não foi avaliada, por conseguinte, a concentração eficaz dos agentes que poderiam traduzir-se em ambientes clínicos não são precisamente conhecida. Na prática clínica, doses baixas de AA e VK3 pode ser facilmente alcançado por administração oral. Desde α-TOS converte completamente ao α-tocoferol ineficiente após aplicação oral, a administração intravenosa ou transdérmica representa um modo plausível para atingir os seus níveis farmacológicos e o efeito anti-cancro. Não obstante os meios clínicos de administração, o que ainda está para ser testado, este relatório demonstra o uso potencial da combinação de drogas específicas para o tratamento de câncer de próstata.

A combinação AA VK3 + induz a formação de ROS (i), a