Abstract
Fundo
É um grande desafio clínico para prever quais pacientes, com a cabeça estágio avançado e carcinoma de células escamosas pescoço, não exibirão uma redução no tamanho do tumor após a quimioterapia de indução em a fim de evitar os efeitos tóxicos da quimioterapia ineficaz e atrasos para instituir outras opções terapêuticas. Além disso, é interessante saber até que ponto um gene assinatura, que identifica pacientes com tumores que não respondem a uma quimioterapia de indução particular, é aplicável quando agentes quimioterapêuticos adicionais são adicionados ao regime.
Metodologia /As principais conclusões
para identificar genes que predizem a resistência do tumor à indução com cisplatina /5-fluorouracil (PF) ou PF e um taxano, analisou biópsias de tumores de pacientes com microarrays do genoma inteiro e quantitativa da transcriptase reversa-PCR (TLDA) cartões. A licença de um em procedimento de validação cruzada permitiu a avaliação da ferramenta de previsão. Uma assinatura microarray dez gene classificou corretamente 12/13 respondedores e 7/10 não-respondedores à PF (especificidade de 92%, 82,6% de precisão). análise TLDA (utilizando o mesmo classificador) dos pacientes classificados correctamente 12/12 8/10 respondedores e não-respondedores (especificidade de 100%, 90,9% de precisão). Além disso, a análise TLDA previu corretamente a resposta de 5 novos pacientes e, em geral, 12/12 e 13/15 respondedores não-respondedores (100% de especificidade, 92,6% de precisão). Os produtos proteicos de genes que constituem a assinatura associar fisicamente com 27 outras proteínas, envolvidos na regulação da expressão do gene, que constitui uma rede de interacção. Em contraste, a predição (com a mesma assinatura de genes) de respostas TLDA à base de indução com PF e qualquer um dos dois taxanos foi pobre (0% de especificidade, 25% de precisão e 33,3% de especificidade, 25% de rigor).
Conclusões /Significado
transferência bem sucedida do gene assinatura à base de microarray de uma tecnologia independente, com base em PCR sugere que as assinaturas baseadas em TLDA poderia ser uma tecnologia útil hospital de base para determinar as opções terapêuticas. Embora altamente específico para tumor respostas à indução PF, a assinatura gene é sem êxito quando taxanos são adicionados. Os resultados ilustram a sutileza no desenvolvimento de “medicina personalizada”
Citation:. Tomkiewicz C, Hans S, Mucchielli MH, Agier N, Delacroix H, Marisa L, et al. (2012) uma cabeça e de pescoço do cancro Tumor Response-Specific assinatura genética para Cisplatina, 5-fluorouracil quimioterapia de indução falha com Adicionado taxanos. PLoS ONE 7 (10): e47170. doi: 10.1371 /journal.pone.0047170
editor: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América
Recebido: 12 de maio de 2012; Aceito: 10 de setembro de 2012; Publicação: 09 de outubro de 2012
Direitos de autor: © Tomkiewicz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo CNRS (Centro Nacional de la Recherche Scientifique), INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), Assitance Pública-Hospitais de Paris (CRC03017), Paris Descartes University. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (CECP) é o sexto tipo de câncer mais frequente em todo o mundo [1]. Na França, mais de 20.000 novos casos e cerca de 6.000 mortes foram relatadas em 2003 e a taxa de sobrevivência de cinco anos ainda é baixa (50%). estratégias de tratamento para avançado de cabeça e pescoço mudaram ao longo dos últimos 30 anos. Estratégias de hoje, particularmente para a laringe, oro e hipofaringe, estão focados em procedimentos cirúrgicos e não cirúrgicos que preservam um órgão funcional. [2].
Historicamente, dois estudos clínicos, do Departamento de Assuntos de Veteranos (DVA) de laringe Cancer Study Group [3] e da Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) 91-11 [4], ter influenciado a gestão do câncer de laringe avançado. O estudo DVA [3] foi o primeiro a promover a estratégia de preservação de órgãos e para provar que a sobrevida do paciente após neoadjuvante ou indução quimioterapia (cisplatina e 5-fluorouracil), seguido de radioterapia foi quase idêntico ao que após a laringectomia total e radioterapia pós-operatória.
no entanto, o uso e benefício da quimioterapia manteve-se objecto de debate na sequência de uma meta-análise, em 2000, de 63 ensaios entre 1965 e 1993, que mostrou que a quimioterapia na cabeça não-metastático e carcinoma de células escamosas pescoço 10.741 doentes com carcinoma da orofaringe, cavidade oral, laringe ou hipofaringe deu apenas um pequeno benefício significativo da sobrevivência para quimioradioterapia concomitante [5].
Em 2007, um estudo multicêntrico Eastern Cooperative Oncology Group fase II [6] relataram uma alta taxa de órgão-preservação com quimioterapia baseada em taxano para o câncer de orofaringe, mas não para o câncer de laringe. Dois estudos clínicos [7], [8], foram publicados, em 2007, que comparou um regime de quimioterapia mais intensiva de indução; docetaxel foi adicionado ao regime de cisplatina /5-fluorouracilo convencional. terapia sequencial com docetaxel indução, cisplatina e 5-fluorouracil (TPF) melhorou significativamente a sobrevida e sobrevida livre de progressão em relação cisplatina e 5-fluorouracil (PF) na laringe localmente avançado, o câncer de oro e hipofaringe [7] sugerindo o uso de TPF sequencial seguido por carboplatina quimio-radioterapia como uma opção de tratamento para preservação de órgãos e melhorar a sobrevida na laringe localmente avançado, oro e hipofaringe. O grupo europeu estudo TAX 323 [8] em comparação TPF com PF como quimioterapia de indução em pacientes com locorregionalmente doença avançada, irressecável e mostrou que a sobrevida livre de progressão mediana foi de 11,0 meses no grupo TPF, em comparação com 8,2 meses no grupo PF. Embora a adição da docetaxol taxano à cisplatina /5-fluorouracilo quimioterapia de indução melhora a resposta clínica e a sobrevivência, em comparação com cisplatina /5-f luorouracilo sozinho ou cisplatina /5-fluorouracilo em associação com radioterapia, que podem ter uma maior incidência de eventos hematológicos adversos (neutropenia e complicações relacionadas) [9]. No entanto, cerca de 30% dos pacientes mostram quer nenhuma melhoria ou agravamento da sua doença após a indução. É, assim, um importante desafio clínico para prever quais os pacientes não irão beneficiar de quimioterapia de indução i) para evitar efeitos tóxicos da quimioterapia ineficaz; ii) para evitar atrasos para outras opções terapêuticas e iii) minimizar o custo do tratamento.
investigações anteriores de resposta à quimioterapia de indução em HNSCC mostrou que as diferenças nos genótipos de várias enzimas estão associados com variações na resposta à cisplatina à base de quimioterapia de indução [10]. Ciclina A expressão em HNSCC previu uma melhor resposta à cisplatina /5-fluorouracil quimioterapia [11]. Além disso, melhores índices de sobrevivência de pacientes foram encontrados quando a expressão da laminina e sindecam-1 mudou em resposta à quimioterapia [12]. No entanto, todos estes estudos se concentrar em apenas um ou alguns genes. À base de Microarray perfis dos cânceres de cabeça e pescoço a expressão do gene foi usado principalmente para a classificação de tumores ou para prever metástases à distância ou o resultado [13] – [15]. Embora gene-expressão análises avaliaram a resposta a quimio-radioterapia pré-operatória [16] ou a quimioterapia de indução com 5-fluorouracil, cisplatina e adriamicina [17] no câncer de cabeça e pescoço, nenhum estudo microarray do genoma abordou cisplatina /5-fluorouracil terapia de indução. Neste estudo usando análise de microarray do genoma, buscou-se identificar genes que eram preditivo de uma resposta do tumor à quimioterapia de indução com cisplatina /5-fluorouracil. Nós ainda procurou determinar até que ponto esta assinatura gene era aplicável quando adicional agentes quimioterápicos (cisplatina /5-fluorouracil e um taxano-docetaxel ou paclitaxel) foram adicionados ao regime de tratamento.
Métodos
pacientes e quimioterapia de indução
Entre 2002 e 2007, os pacientes com carcinoma histologicamente comprovado orofaríngea, sem história prévia de localizações de câncer ou tumores múltiplos e sem contra-indicação para quimioterapia à base de cisplatina foram inscritos no estudo, no Pompidou Hospital Georges Europeia (HEGP), Paris. Os pacientes, todos os quais tinham avançado (estágio 3 ou 4) tipos de câncer, receberam PF (100 mg /m
2 Dia cisplatina (D) 1 e 1 g /m
2 5-FU D1-D5) ou TPF (ou carboplatina (paraplatine) -AUC5 D1 (onde AUC é a área sob a curva, uma fórmula que permite o cálculo da dose, adaptando-a ao valor da depuração da creatinina) e 175 mg /m
2 D1 paclitaxel (T1PF) ou PF mais docetaxel: 75 mg /m
2 cisplatina D1, 75 mg /m
2 docetaxel D1 e 750 mg /m
2 5-FU como uma perfusão contínua D1-D5 ( T2PF) a quimioterapia de indução. Uma média de 3 campos (intervalo 2-5) foi administrado com intervalos de 14-21 dias entre os cursos e as doses foram ajustadas para levar em conta a tolerância e da resposta individual. os pacientes foram avaliados pela Cabeça e Pescoço Junta tumor da HEGP (composto por especialistas da cabeça e pescoço, radiologistas e patologistas). Nós estudamos os doentes em dois dos quatro grupos na classificação ECOG [18], de modo a ter dois grupos que estavam a mais “clinicamente” diferente . A resposta foi definida por ambos exame clínico e radiológico; respondedores clínicos completos (CCR) mostrou que mais de 90% de diminuição do tamanho do tumor enquanto o grupo não-respondedor (NR) mostrou menos do que 50% de redução no tamanho do tumor ou a progressão da doença.
HES-NR e HES CCR correspondem a coloração hematoxilina-eosina-safran de um representante não-respondedor e indivíduos completos de resposta clínica, respectivamente, e IHC-p16 e HPV HIS-oncogênico correspondem a imuno-histoquímica positiva representante para o antígeno p16 (coloração marrom ) e hibridação
in situ Compra de DNA HPV oncogênico (coloração nuclear azul punctata), respectivamente. A barra representa 40 microns nos painéis superiores e 20 microns nos painéis inferiores.
Ética
O estudo foi autorizado pela comissão de ética (CCPPRB Paris-Broussais-HEGP N ° 2002-035) ea legislação pesquisa biomédica francesa obedecida. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.
Coleta de Amostras, Histologia e Virologia
Para fins de diagnóstico, amostras de tumor foram obtidas durante a endoscopia sob anestesia geral antes de qualquer tratamento. Cada biópsia do tumor foi imediatamente colocado em RNAlater (Ambion) para evitar a degradação do RNA. A biópsia foi cortado em 2 partes, uma para o exame patológico e a outra foi imediatamente congelado a -80 ° C até processamento adicional para extracção de ARN. -Fixadas com formalina, os blocos de tecido embebidos em parafina foram usadas para preparar as lâminas durante 1) hematoxilina-eosina-Safran (HES) coloração para a avaliação do estado do tumor e a percentagem de células tumorais na biópsia, 2) coloração imuno-histoquímica para o antigénio p16 e 3)
in situ
hibridação usando o HPV (Papiloma vírus Humano) III Família 16 Probe (B) kit para detectar os principais tipos oncogênicos de DNA HPV INFORM 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 (Roche Diagnostics, França). A coloração foi realizada usando o benchmark Clyde aparelho Ventana Roche ULTRA. Foram utilizados protocolos dos fabricantes. O status do HPV não pode ser determinado para um indivíduo CCR do grupo tratado PF. As análises histológicas estabelecido que todos os tumores eram carcinomas de células escamosas (Figura 1 mostra a coloração representante HES de biópsias de NR e CCR pessoas). Os grupos NR e CCR exibiu extensões globais semelhantes de diferenciação do tumor e por cento da celularidade do tumor.
O classificador 10 gene separa claramente os membros da NR (esferas azuis) e CCR grupos (esferas vermelhas). 82-83 por cento da variabilidade está contida nestes primeiros três dimensões.
Preparação e Avaliação da Qualidade RNA
“TriPure reagente de isolamento” (Roche) foi usado para extrair RNA a partir da biópsia. Resumidamente, a biópsia (menos do que 100 mg) foi homogeneizado em 1 ml TriPure com 3 esferas de tungsténio estéreis num Retsch MM20 Misturador Mill (3 min a uma velocidade de moagem 29, 3 vezes). Após a adição de 100 uL de dois clorofórmio, o tubo foi agitado vigorosamente à temperatura ambiente durante pelo menos 5 minutos e deixada em repouso durante mais 5 min antes da centrifugação (15 min, 12500 rpm, 4 ° C). A camada aquosa superior, contendo ARN foi recolhido. Após a adição de 500 uL de isopropanol e incubação a -20 ° C durante 10 min, o ARN foi sedimentado por centrifugação (15 min, 12500 rpm, 4 ° C). O sedimento foi lavado com 1 mL de etanol a 75%, centrifugado como foi descrito acima e secou-se à temperatura ambiente durante 10 min. O ARN total foram re-suspensos em 40 ul de água isenta de RNase. RNA foi ainda purificado com a RNase-free DNase Conjunto (Qiagen) e limpeza minielute RNeasy (Qiagen), de acordo com o protocolo do fabricante. RNAs foram quantificados usando um espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 e a sua qualidade foi avaliada por electroforese usando um Bioanalyzer (Agilent).
Etiquetagem e purificação de sondas
Para os estudos de microarray, um total de 23 amostras e uma referência universal, ARN compreendendo ARN a partir de 10 tecidos humanos diferentes (Clontech), foram usadas para sintetizar ARNc marcado. Resumidamente, o ARN total de 200-300 ng extraído de biópsias ou a partir da referência de ARN foram marcadas utilizando cyanine3-CTP-CTP ou cyanine5 e a “baixa de entrada de ARN Kit fluorescente Linear Amplification” (Agilent), de acordo com as instruções do fabricante. As sondas fluorescentes foram purificados (purificação RNeasy Mini Kit, Qiagen) e a concentração das sondas e o nível de incorporação dos corantes para as sondas foi medida (espectrofotómetro Nanodrop D-1000). electroforese em agarose das sondas marcadas (gel de agarose a 1,2% em 0,5 × TBE) realizada sobre uma lamela de microscópio em conjunto com marcadores de ADN (100 pb, Biolabs) foi realizada e a fluorescência do gel foi avaliada em um scanner Genetac IV (Perkin-Elmer ). Tanto a intensidade do sinal e o perfil das amostras indicou que a qualidade da rotulagem.
A hibridação e lavagem de microarrays
As sondas (1 ug cada de uma amostra de biópsia e da referência , design direta) foram então hibridizado a um microarray humana 44K pan-genómica (Agilent) contendo 41.000 sondas, correspondente a genes ou etiquetas de seqüências expressas, usando o Agilent 60-mer protocolo de processamento oligo microarray (Agilent). A hibridação foi realizada durante 17 horas a 60 ° C com rotação num forno de hibridação (Agilent) como descrito pelo fabricante. Os microarrays foram lavadas como descrito no protocolo do fabricante e secas imediatamente em uma centrífuga de velocidade vac por 2 minutos.
Scanning matriz e Processamento de Imagens
Os microarrays foram digitalizados usando um scanner Axon 4000B ( Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) a 5 uM resolução. voltagens de PMT foram ajustados automaticamente para equilibrar a distribuição das intensidades de vermelhas e verdes e para optimizar a dinâmica de quantificação de imagem. A taxa de pixels saturados foi limitado a 0,01%. Os 16 bit imagens resultantes foram analisados e a quantificação dos sinais sobre as matrizes foi realizada usando o software GenePix Pro 6.0 (Axon Instruments, Union City, CA). Segmentação foi calculado com o método “círculo adaptativa” de processamento. Fundos não foram subtraídos e não encontrado, saturada e pontos ruins foram descartados. normalização-array Intra (excluindo os pontos de controle, 2.615 sondas) foi realizada utilizando o método de loess com um parâmetro de 0,5 span.
Análise Estatística
Os genes diferencialmente expressos entre CCR e NR no estudo microarray foram identificado por um teste de permutação mutivariable controlar a taxa de detecção falsa (um teste t moderado com ajustamento de valores de p [19] utilizando o software manga [20]. os genes foram seleccionados como significativamente expressos diferencialmente quando o valor de p era inferior a 0,025 , a alteração média de dobragem (a mudança de dobragem entre os meios de sinais normalizados de os 13 respondedores clínicos completos e dos 10 não respondedores) maior do que 1,3, em valor absoluto e a intensidade média (log
2 (Cy5 * Cy3) /2) superior a 7. Cada gene tem, pelo menos, um valor entre as duas médias de log
2 (NR /ref) e log
2 (CCR /ref) maior do que 0,4, em valor absoluto e pelo menos um valor entre os dois desvios-padrão de log
2 (NR /REF) e log
2 (CCR /REF) inferior a 0,5. Além disso, não é a recuperação mínima entre CCR e NR (