Abstract

de Von Hippel-Lindau supressor de tumor (BVS) é perdida na maioria dos carcinomas de células renais de células claras (ccRCC) . Foliculina (FLCN) é um supressor de tumores cuja função é perdido na síndrome de Birt-Hogg-Dubé (BHD), uma desordem caracterizada por o cancro renal de vários tipos histológicos, incluindo carcinoma de células claras, fibrofoliculoma cutânea, e pneumotórax. Aqui nós exploramos se há conexão entre BVS e FLCN em linhas celulares de carcinoma de células renais claras e tumores. Nós demonstramos que regula a expressão do VHL FLCN aos níveis de mRNA e proteína em linhas de células RCC, e que a expressão da proteína FLCN é diminuída em tumores humanos com ccRCC

BVS

perda, em comparação com o tecido renal normal correspondente. Knockdown de resultados FLCN no aumento da formação de tumores por células RCC com o tipo selvagem de VHL em xenoenxertos ortotópico em murganhos nus, uma indicação de que FLCN desempenha um papel na actividade supressora de tumor de VHL. Curiosamente, FLCN, semelhante a VHL, é necessária para a actividade de programa autophagic mediada por LC3C que caracterizaram anteriormente como contribuindo para a actividade supressora de tumor de VHL. Os resultados mostram a existência de crosstalk funcional entre duas grandes supressores de tumor no cancro renal, BVS e FLCN, convergindo sobre a regulação da autofagia

Citation:. Bastola P, Stratton Y, Kellner E, Mikhaylova O, Yi Y, Sartor MA, et ai. (2013) foliculina Contribui para Tumor BVS suprimindo a atividade em Câncer Renal através do Regulamento de autofagia. PLoS ONE 8 (7): e70030. doi: 10.1371 /journal.pone.0070030

editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de abril de 2013; Aceito: 14 de junho de 2013; Publicação: 29 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Bastola et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Myrovlytis Confiança , Bolsa de Investigação; NIH /NCI CA122346; BLR D VAmerit AwardB101BX0011100-02; UC P30-ES006096CEG. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer renal para 2% a 3% de todas as neoplasias de adultos em os EUA. Em 2011 foram notificados mais de 64,770 novos casos e 13.000 mortes, ea incidência está a aumentar em 2,5% ao ano. ccRCC representa a maioria (85% a 90%) dos cancros do rim adulto e é a forma mais maligna. Este cancro é caracterizada por uma perda precoce do supressor de tumor de VHL no braço curto do cromossoma 3 na maioria dos tumores (80%). Está bem estabelecido que a perda de resultados VHL em aumento da acumulação e da actividade do factor de transcrição indutível por hipoxia (HIF), que por sua vez activa a expressão de genes que promovem o crescimento do tumor. Entre estes são factores angiogénicos que conduzem a um aumento do fluxo sanguíneo através dos tumores, aumentando assim a entrega de nutrientes e oxigénio para as células cancerosas. Os genes que estimulam a glicólise anaeróbia também são activados, e este suporta adaptação a reduzida disponibilidade de nutrientes e as células cancerosas desloca em direcção vias metabólicas que promovem o crescimento do tumor. Recentemente, descobrimos que um outro via supressora de tumor é regulada por VHL. Descobrimos que BVS é um regulador importante do processo de macroautofagia (autofagia) [1]. Nós determinamos que BVS, através da indução de microARN-204, inibiu autofagia mediada por LC3B que é necessária para o crescimento tumoral ccRCC. Além disso, a BVS, inibindo HIF, induzida expressão e actividade de uma par�ogo LC3B, LC3C. Em contraste com LC3B, LC3C actua como um supressor de tumor [1].

No processo de busca de novos genes induzidos por VHL que podem participar na actividade supressora de tumor de VHL, descobrimos que a reconstituição dos selvagem -tipo BVS em células RCC com perdidos

BVS

induzida enriquecimento específico e significativo para genes expressos do locus de Smith-Magenis (SM) no braço curto do cromossomo 17p11.2. Síndrome de Smith-Magenis é um distúrbio neurocomportamental complexa caracterizada por deficiência intelectual, anomalias craniofaciais e esqueléticos, e distúrbios do sono [2]. Curiosamente, esse locus contém outro gene do rim supressor de tumor, foliculina (FLCN), cuja actividade é perdida na doença autossômica dominante genética, síndrome de Birt-Hogg-Dubé (BHD) [3]. BHD é caracterizada por pele, fibrofoliculomas cistos pulmonares, e pneumotórax espontâneo, bem como o cancro renal de tipos histológicos, incluindo cromófobo mistas, de células claras oncocítico, e tipo papilar [3]. O objetivo deste trabalho foi determinar se FLCN contribui para a actividade supressora de tumor de VHL. Mostramos que FLCN contribui para a supressão mediada por BVS do crescimento do tumor, afetando LC3B e autofágicos LC3C vias.

Materiais e Métodos

Cultura Celular Os métodos e tratamentos

O nosso método para gerando poças de VHL humana (-) e BVS (+) 786-O, A498 e células Caki-1 foram descritas por nós antes [1], [4], [5]. células RCC4 foram presente do Dr. Jamie Cairo (Jefferson University) e foram descritos por nós antes [6]. autophagic fluxos foram realizadas como descrito anteriormente [1]. Para a proteína ou de extracção de ARN, as células foram plaqueadas, 24 h mais tarde meio foi mudado para que com 10% ou 0,1% de soro, e as células foram recolhidas 48 horas mais tarde. As células foram então lisadas em tampão RIPA com protease, fosfatase e inibidores de proteossomo para análise PAGE, ou TRI Reagente para extração de RNA. Para experiências de RNAi, com sede em pLKO.1 shRNA constrói para FLCN (TRCN0000005969, TRCN0000005970 e TRCN0000010979; Abrir Biosystems) foram VSV-G envelope empacotados (do Cincinnati Children Hospital Medical Center Viral Vector Core) e infectados em células, que foram então tratados com reagentes selecção do plasmídeo apropriado. construções BVS shRNA foram descritos antes [5]. Transduções com partículas lentivirais foram realizadas utilizando 2 ug /ml de polibreno

RCC tumores humanos

amostras de congelação fresca de tumores ccRCC (n = 128) e amostras de rim normais correspondentes (N = 114. ) foram obtidas e analisadas para

BVS

sequência e de expressão de proteínas, tal como descrito antes [4]. As amostras foram analisadas quanto à expressão de proteína e de ARNm, também conforme descrito antes.

RT-PCR quantitativo

Para a análise do mRNA, as amostras foram primeiro transcrito de forma inversa utilizando o kit TaqMan microARN Transcrição Reversa (Applied Biosystems) e quantificado com PCR em tempo real em um Applied Biosystems 7900HT rápido real-Time CRSystem. qRT-PCR foi realizada como descrito anteriormente, e utilizando iniciadores descritos na Tabela S4. Descrição dos microarrays de RNA é fornecida em Métodos Suplementares.

Western Blot Analysis

Total de lisados ​​celulares foram obtidos por células em tampão RIPA contendo inibidores de protease e fosfatase lise. 5 a 30 ug de extractos foram separados em 4% a 12% ou 10% de geles de poliacrilamida e transferidos para membranas de PVDF. imunotransf erência semi-quantitativa para tumores RCC humanos e os rins normais correspondentes foi realizada como descrito anteriormente [4]. Os anticorpos policlonais seguintes foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvar, MA): anti-FLCN, anti- S6 quinase 1 e T

389 fosforilação; anti-S6 e S

240/244 fosforilação; anti- 4EBP e T

37/46 ou S

65 fosforilação. anti-LC3B policlonal (Abcam, Cambridge, MA) e anti-LC3C (Abgent, San Diego, CA) foram usadas. A sequência de ratinho foram usados ​​anticorpos monoclonais: anti-VHL (Pharmingen; San Jose, CA), anti-hemaglutinina (Boehringer Ingelheim, Áustria); e anti-GAPDH (Abcam, Cambridge, MA).

experiências com ratos de Xenoenxerto

para as injecções intra-renais, 30.000 células foram novamente suspensas em Matrigel a um volume final de 30 uL, e, em seguida injectada lentamente alguns milímetros sob a capsula do rim de ratinhos nus atímicos com 4 a 5 semanas de idade. Depois de 10 a 12 semanas os ratos foram sacrificados, os tumores com rins foram coletados e fixados em paraformaldeído a 4%, embebidos em parafina, e H E manchado ou processados ​​para S6 coloração /S6P na histopatologia Núcleo em no Departamento de Patologia da CCHMC

análise estatística de dados quantificados

normalização e análise de microarrays de RNA de dados são descritos em Métodos suplementares. Os dados foram depositados para Gene Expression Omnibus com o número de acesso GSE47106. Para estatísticas descritivas, os dados são expressos como média ± SEM, a menos que indicado de outra forma. Análise de expressão diferencial foi realizada utilizando o teste t ou análise unidireccional da variância (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey-Kramer testes de comparação múltipla. Para a quantificação dos experimentos immunoblotting os valores normalizados de níveis de abundância de proteínas foram LOG2 transformado para facilitar a análise robusta, outlier-insensitive. parcelas box-and-suiça padrão foram usados ​​para comparar as distribuições da medida de abundância normalizada para as proteínas individuais. As diferenças entre os níveis médios em dois tipos de amostras foram avaliadas por meio (frente e verso) t-test e mais validada pelo teste de Wilcoxon. As diferenças resultantes em P 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Ética Declaração

Todos os experimentos com camundongos foram realizados em estrita conformidade com o protocolo aprovado pela Universidade de Cincinnati Institutional Animal Care e do Comitê Use. (número de protocolo: 06-07-21-01). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia isoflurano e todos os esforços foram feitos para minimizar a dor. Todas as amostras humanas foram anônimas e isentos Universidade de requisitos do protocolo de Cincinnati Revisão Interna do Conselho de Administração.

Resultados

A expressão de FLCN é induzida pela BVS

Para identificar os genes induzidos por BVS que pode participar na actividade supressora de tumor de VHL, foi realizada de ARNm experiências microarray em que são comparadas a expressão do gene em RCC humano 786-S BVS (-) células e as mesmas células com reconstituído, do tipo selvagem de VHL (786-o BVS (+)). A análise estatística identificados 1.310 transcritos expressos diferencialmente nos dois tipos de células (FDR 0,1 e mudança 50% no nível de expressão). (Tabela S1)

Curiosamente, entre os 588 transcritos induzidos pela reconstituição de VHL, encontramos um enriquecimento significativo em genes localizados no braço curto do cromossoma 17 (10,71% de todos os genes induzidos significativamente), e particularmente em 17p11.2 cytoband, que contém o locus SM (1,7% de todos os genes induzidos significativamente) (Tabela 1 e S2). Houve também uma concentração de genes induzidos por VHL no cromossoma 14 (7,85% de todos os genes induzidos significativamente) com as principais cytoband sendo 14q22.1. indução mediada por BVS de vários dos genes SM foi adicionalmente confirmada por RT-PCR quantitativo (Fig. S1). Em contraste, os genes que foram reprimidos pela BVS foram enriquecidos no cromossomo 7 (63 genes, 9,75% de todos os genes significativamente reprimidas) e cromossomo 9 (42 genes, 6,5% de todos os genes reprimidos) (Tabela S3).

O locus SM contém um gene que codifica outro supressor de tumor renal renal, FLCN. Análise do ARNm e da proteína FLCN revelou aumento da expressão de ambos em células 786-S e A498 com VHL reconstituído, em comparação com VHL parental (-) células (Fig. 1A e B). Além disso, mRNA FLCN e expressão de proteínas foram reprimidos em Caki1 células cancerosas renal em que assolavam expressão BVS endógena usando shRNA (Fig. 1C e 1D). A mudança na expressão de ARNm de FLCN estava na gama de 1,5 a 2 vezes, semelhante a outros genes SM (comparar Fig. S1). No entanto, a indução ao nível da proteína era na gama de 3 a 4 vezes, uma indicação de que os mecanismos de pós-transcrição desempenham um papel neste regulação. Nestes estudos, observaram-se também a indução mediada por BVS de p53, um outro gene localizado no cromossoma 17p13.1 na proximidade do locus SM, validando assim a conclusão de que foi anteriormente descrita por outros [7].

Reconstituição de VHL em células 786-S e A498 levou à indução de FLCN e ARNm de p53 (a) e proteínas (B). Knockdown de VHL nas células Caki-1 resultou numa diminuição de ARNm FLCN (C) e os níveis de proteína (d); *** P 0,001, ** P 0,01. virus controle disputa Scr-.

Porque a BVS é perdida no carcinoma de células renais de células claras esporádica (ccRCC), medimos a expressão de FLCN em lisados ​​de tumores ccRCC humanos, em comparação com o tecido renal adjacente em amostras com o estatuto de VHL

conhecida

. Temos anteriormente descrito a população de pares de rins ccRCC-humana normal que usamos para esta análise [4]. A proteína FLCN foi analisada por imunotransf erência semi-quantitativo tal como anteriormente [4] e descrito ARNm foi determinada por RT-PCR quantitativo. A expressão da proteína FLCN foi marcadamente diminuída em tumores ccRCC em comparação com rins normais na população de ccRCC com o

BVS

suprimido (Fig. 2A e 2B). Em contraste, nós não ver diferenças significativas nos níveis FLCN ao comparar ccRCC com o tipo selvagem

BVS

ao tecido renal normal correspondente (Fig. 2C). Curiosamente os níveis de ARNm FLCN não diferiram entre os pares tumor-renais em ambos os grupos de tumores (Fig. 2D), apoiando um papel para os mecanismos de pós-transcrição na regulação da expressão FLCN.

Análise de proteína FLCN (A -C) e mRNA (D) em amostras de ccRCC humana com conhecido

BVS

status, em comparação com o tecido renal adjacente. A. Uma análise por Western blot representativo de proteína em pares de FLCN rim (K) e de tumor com perdeu

BVS (BVS-DEL) separados em PAGE a 10%. A banda inferior pode representar uma degradação ou pós-translacional modificação de FLCN. B e C. A quantificação da expressão da proteína FLCN em tumores que tinham perdido

BVS

(BVS-DEL) e tumores com o tipo selvagem

BVS

(BVS-WT). As caixas representam os quartis inferior e superior separadas pela mediana (linha horizontal de espessura) e os bigodes se estender até os valores mínimos e máximos, excluindo pontos que estão fora do intervalo interquartil 1,5 a partir da caixa (marcado como círculos). Significa SD ± de cada distribuição são indicados por pontos fechados e cruzes sobre os bigodes, respectivamente. medição de D. RT-PCR quantitativa dos níveis de mRNA FLCN em rins e ccRCC BVS-DEL e tumores BVS-WT.

FLCN Contribui para mediada por BVS Tumor Repressão

Para determinar se havia uma ligação funcional entre FLCN ea atividade supressora de tumor de VHL, nós derrubado expressão de FLCN no 786-o BVS (+) células usando três shRNAs (Fig. 3A) diferente. Em seguida, estas células injectados sob as cápsulas dos rins de ratinhos nude, o que resultou num aumento da incidência de tumores e ao maior tamanho do tumor, em comparação com os tumores derivados de células de controlo que foram injectados transduzidas com lentivírus que contêm sequência de encriptação (Fig. 3B). Os tumores com FLCN knockdown teve um altamente maligno, fenótipo desdiferenciado (Fig. 3C).

knockdown induzida shRNA de FLCN promove a formação de tumor por células 786-O com VHL reconstituída. A. Western blot demonstrando um decréscimo na expressão da proteína FLCN em células que expressam estavelmente três diferentes FLCN shRNAs em comparação com células transfectadas com controlo de precipitação (SCR). B. Quantificação de incidência e o peso de tumores formados pelas linhas celulares indicadas em xenoenxertos ortotópicos. peso médio NK dos rins normais. C. H E coloração de secções representativas de tumores cultivados pela BVS (+) /células de controlo mexidos e células BVS (+) com knockdowns FLCN. Barras de escala = 50 mm.

Porque FLCN foi mostrado para inibir a actividade da via mTORC1 em UOK257 células e modelos de mouse BHD cancro do rim [8], [9], foram analisados ​​os efeitos da FLCN knockdown sobre a actividade da via em células usadas para estes xenoenxertos ortotópicos. Importante, knockdown de FLCN resultou numa diminuição da actividade mTORC1 (Fig. 4A), tal como medida por fosforilação de S6K, S6 e 4EBP, em células em cultura. Nós também determinaram expressão de S6 e S6-P é secções de xenoenxertos de tumores formados por BVS (+) /encriptem células transfectadas versus tumores formados por estas células com FLCN derrubado. De forma consistente com os resultados obtidos a partir de experiências de cultura de células, a partir de secções de VHL (+) /FLCNKD tumores apresentaram coloração inferior a S6-P, em comparação com os tecidos de controlo, enquanto que a coloração para o total S6 foi semelhante (Fig. 4B). Este resultado sugere que a actividade aumentada da via mTORC1 não contribui para o aumento do crescimento de tumor nestas células.

. A análise Western blot de mTOR alvos a jusante no 786-O BVS (+) células que expressam de forma estável, quer disputa ou dois diferentes FLCN shRNAs. O controle de carregamento GAPDH é mostrada para cada grupo de imunotransferências processados ​​a partir do mesmo gel. seções B. representativos de tumores indicados coradas para S6 e S6P. Barra de escala = 50 mm.

Recentemente, temos descrito que BVS suprime, a autofagia pró-oncogênico mediada por LC3B enquanto estimula um tumor romance suprimindo programa autofágica, mediada por LC3C [1]. LC3s estão bem estabelecidos autofágicos reguladores necessários para a formação dos autofagossomas de dupla membrana e para a aquisição de carga. Assim, nós investigamos se FLCN pode exercer a sua actividade supressora de tumor jusante da BVS, regulando LC3C ou LC3B autofagia. LC3C é induzido pela fome na BVS (+) células, assim, nestas experiências, VHL (+) 786-S e RCC4 células foram privadas de soro a 0,1% durante 48 horas e depois tratou-se durante 1 h com cloroquina, um inibidor lisossomal em ordem para inibir o fluxo autophagic e a acumulação da forma mais rápida de migração, lipidada (LC-II) de LC3B e LC3C foi medido por transferência de western. Descobrimos que knockdown de FLCN resultou num decréscimo substancial na acumulação de LC3C com um aumento em ambos LC3B linhas celulares (Fig. 5). A mudança na LC3B em células RCC BVS (+) não foi associada com as alterações consistentes na miR-204 (dados não apresentados). Este resultado indica que regula FLCN autofagia semelhante a VHL, e, assim, os efeitos sobre a autofagia pode ser parcialmente responsável pela contribuição de FLCN para a actividade supressora de tumor de VHL.

knockdown de FLCN (shRNA 3) em 786- células O (A) ou RCC4 (B) BVS (+) reduz a acumulação de supressor do tumor LC3C-II, mas induz a expressão oncogénica de LC3B-II. As transferências de Western foram sondadas com anticorpos indicados. C. Quantificação de 3 experiências independentes, como mostrado no painel A e B. Os níveis de proteína LC3 medido por densidade óptica foram primeiro normalizados para GAPDH. Em seguida, foi calculada a relação entre os níveis de LC3 LC3 medidos em amostras de cloroquina tratados em células com FLCN derrubado e células de controlo (comparar pista 6 a pista 3 nos painéis A e B). D. Modelo da proposta de regulamento.

Discussão

Aqui nós relataram que BVS regula a expressão de FLCN e que, por sua vez, FLCN participa da atividade supressora do tumor de VHL. Os efeitos observados de FLCN knockdown sobre o crescimento do tumor são consistentes com o efeito negativo de FLCN sobre-expressão na formação de tumores por 786-S de VHL (-) células, como observado por outros [10]. Importante, FLCN regula programas LC3B e autofágicos LC3C de um modo semelhante a VHL, i.e. inibe FLCN LC3B e estimula a actividade autophagic LC3C (Fig. 5D). Uma vez que foi demonstrado que ambos os efeitos LC3B e exercício LC3C importantes e opostos sobre o crescimento de tumores ccRCC [1], propomos que a contribuição de FLCN para a actividade supressora de tumor de resultados VHL, pelo menos parcialmente, a partir dos seus efeitos sobre a autofagia (Fig . 5D). Regulamento de LC3B por FLCN provavelmente representa um mecanismo adicional para o anteriormente descrito por nós inibição mediada pelo BVS da LC3B através de miR-204, como nós não medir os efeitos consistentes de FLCN no miR-204. Ao mesmo tempo, ambos os supressores tumorais poderia induzir a expressão de LC3C através da repressão do HIF, uma vez que é um gene LC3C inibida pelo HIF. VHL está bem reconhecido pela sua capacidade para inibir a expressão da proteína HIF-aS e actividade. Recentemente, FLCN também tem sido relatado para diminuir a actividade de HIF, mesmo que ele não afecta a acumulação de subunidades de HIF-aS [11].

O papel específico da FLCN na regulação da autofagia é ainda apoiada pela recentemente presença identificado domínio de DENN na região carboxi-terminal da FLCN [12]. Este motivo está presente também em folicullin associado proteína-1 e 2 (FNIP1 e FNIP2 [13]), e, interessantemente, em outra proteína expressa a partir do locus SM, SMCR8 [13], o que também descobrimos ser induzida por BVS (Fig . S1). Estas proteínas estão agindo como fatores de câmbio GDP-GTP (GEFs) para GTPases Rab, potencialmente necessárias para a autofagia associada ao tráfico e fusão [11], [13].

O locus SM não tem sido associada a ccRCC. Anteriormente, apenas um gene de neste locus, TNFSF13 (factor de necrose tumoral membro da superfamília 13), tinha sido estudada a este respeito. Verificou-se a apresentar níveis de mRNA diminuiu em ccRCC em comparação com o rim normal. Além disso, os níveis mais elevados deste receptor foram mostrados para ser correlacionado com melhor sobrevivência global e livre de doença [14]. No entanto, é possível que uma análise mais aprofundada irá revelar funções adicionais relacionadas com a autophagy de genes expressos de SM lócus.

FLCN contribui para a supressão do tumor induzida por VHL por um mecanismo que não parece envolver a activação da via mTOR. De fato, em células 786-O com VHL reconstituído e FLCN knocked-down, que realmente mostrou uma forte redução em vários eventos de fosforilação que são usados ​​como indicadores da actividade mTOR. De forma consistente com a inibição da mTOR que medidos aumentaram a acumulação de LC3B, uma leitura autophagic amplamente utilizado, e este aumento da autofagia mediada por LC3B pode contribuir para o crescimento do tumor. Os efeitos observados de FLCN sobre a atividade da mTOR são consistentes com diversas publicações relatando uma correlação positiva entre os níveis de FLCN e mTOR no U251, HEK293, HK-2, ACHN, 786-O BVS – células [15] (). Contudo, o entendimento corrente canónica da ligação FLCN-mTOR é que FLCN regula negativamente a via mTOR [8], [9], [16]. A este respeito, a linha celular humana derivada de UOK257 um paciente BHD, que não expressa de VHL, mostra um nível elevado de actividade da mTOR, e ratos knockout com FLCN demonstram níveis elevados de fosforilação S6 [8], [9]. A razão para esta discrepância não é actualmente compreendido, mas talvez os dados apontam para um efeito de FLCN compartimentada em mTOR que é afectada pelo contexto celular, tal como actividade de VHL. No entanto, a ligação de VHL a um supressor de tumor, que regula uma via metabólica em cancro renal pode revelar um aspecto novo da actividade supressora de tumor de VHL que é complementar aos seus papéis na regulação da angiogénese e autofagia.

importante , os níveis de proteína FLCN são diminuídos em ccRCC humano com

BVS

perda, apoiando ainda um papel para este supressor de tumor, no crescimento de ccRCC. Até agora, não há mutações FLCN ou alterações nos níveis de ARNm ter sido medidos em ccRCC. Esta convergência nas funções de BVS e FLCN é de especial interesse considerando o fato de que o carcinoma de células claras podem fazer parte do tipo multihistological de câncer renal que ocorre na síndrome BHD.

A natureza do mecanismo molecular direta pela que BVS induz FLCN supressores de tumor renal continua a ser determinado, mas é provável que envolvem vários mecanismos. Uma vez que nós medimos um efeito de VHL em níveis de estado estacionário de ARNm FLCN em linhas de células RCC, espera-se um certo nível de indução da transcrição ou da estabilização do ARNm FLCN. A esse respeito, não encontramos nenhum efeitos da knockdown p53 na expressão FLCN. Porque não encontramos alterações nos níveis de mRNA FLCN entre pares de tumor renal humanos embora encontramos diferença no steady-state de proteína FLCN, propomos que há também um componente de translação importante a este regulamento, possivelmente, dependendo da especificidade do diferentes populações de células do rim. Uma explicação é que BVS pode reprimir a expressão de microRNAs específicos, que por sua vez reprimir tradução FLCN.

Em resumo, com o estudo atual, nós fornecemos primeira evidência para uma conexão direta entre a BVS e FLCN tumor-supressora caminhos convergentes sobre a regulação da autofagia no câncer renal.

informação de apoio

Figura S1.

BVS induz a expressão de vários genes expressos a partir do locus de Smith Magenis-786-0 e em células A498. O gráfico mostra as alterações na expressão de ARNm individuais com base em medições quantitativas qRT-PCR. Fold mudança representa a diferença na expressão de ARNm em BVS (+) versus BVS (-) células. A sequência dos iniciadores é fornecida em

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s001

(PDF)

Tabela S1. : Lista de genes significativamente reprimido ou induzida por BVS em células 786-S. Dobre mudança representa BVS (+) /BVS (-) rácio

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s002

(DOCX)

Tabela S2.

Genes significativamente induzida pela BVS e enriquecido para cromossomo ou cytoband específica

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s003

(XLS)

Tabela S3.

Genes significativamente reduzidos pela BVS e enriquecido para cromossomo ou cytoband específica

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s004

(DOCX)

Tabela S4.

Seqüência de primers para os genes indicados utilizados em qRT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s005

(DOCX)

Reconhecimentos

obrigado G. Doerman para a preparação de Figuras e Dr. M. Daston para a edição do manuscrito.