Abstract

Fundo

O câncer de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal, e o subtipo carcinoma de células claras de ovário (OCCA) demonstra uma resposta particularmente pobre ao tratamento padrão. Melhorias nos resultados de câncer de ovário, especialmente para OCCA, poderia ser esperado de uma compreensão mais clara da patologia molecular que pode orientar as estratégias para o diagnóstico precoce e tratamento mais eficaz.

Metodologia /Principais Achados

celular tecnologia -SELEX foi utilizada para desenvolver novas sondas moleculares para marcadores de superfície de células de câncer de ovário. Foi obtido um total de treze aptâmeros com K

d’s para as células de câncer de ovário no pico- a gama nanomolar. A investigação preliminar dos alvos destes aptâmeros e as suas características de ligação também foi realizada.

Conclusões /Significado

Nós selecionamos uma série de aptâmeros que se ligam a diferentes tipos de câncer de ovário, mas não cervical Câncer. Apesar de se ligar a outras linhas celulares de cancro foi observado, estes aptâmeros poderia levar à identificação de biomarcadores que estão relacionados ao câncer

Citation:. Van Simaeys D, López-Colón D, Sefah K, Sutphen R, Jimenez E, tan W (2010) Estudo sobre o Reconhecimento Molecular de aptâmeros selecionados através de Ovarian Cancer Cell-SELEX. PLoS ONE 5 (11): e13770. doi: 10.1371 /journal.pone.0013770

editor: Cameron Neylon, da Universidade de Southampton, Reino Unido

Recebido: 03 de maio de 2010; Aceito: 06 de outubro de 2010; Publicação: 01 de novembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Van Simaeys et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores obrigado Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para apoio (R01GM079359, R01 CA133086, R01-CA106414). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é o quinto câncer mais comum em mulheres [1], e tem a maior taxa de morte de qualquer malignidade ginecológica. Esta doença é caracterizada por alguns sintomas iniciais, a apresentação em fase avançada na maioria dos casos, e as taxas de sobrevivência pobres [2] – [8]. O prognóstico é especialmente ruim para pacientes com adenocarcinoma de células claras de ovário (OCCA), que é muitas vezes resistentes à quimioterapia baseada em platina [6] – [10].

O biomarcador sérico mais comumente utilizado para o diagnóstico clínico e prognóstico é o antigénio do cancro do ovário 125 (CA-125). O valor CA-125 é elevado em aproximadamente 90% dos casos em estágio final de câncer epitelial de ovário (estágios 3 e 4). No entanto, isso só é elevada em 50-60% de mulheres com doença fase inicial e também é elevada num certo número de condições benignas [2], [5], [7], [11] – [13].

a utilização de aptâmeros tem um grande potencial para a identificação de novos biomarcadores. Os aptâmeros, que são sondas capazes de se ligar especificamente a marcadores da superfície celular expressos por células tumorais alvo [14] – [21], são curtas oligonucleótidos de cadeia simples de cerca de 100 nt. Eles são seleccionados a partir de grandes conjuntos combinatórias de sequências pela evolução sistemática de ligandos por Exponential Enrichment (SELEX) para a sua capacidade para se ligarem a alvos, que pode variar de pequenas moléculas a proteínas ou polissacarídeos, bem como células de tumor [16] – [19 ], [21] – [23]. Os aptâmeros possuem estruturas terciárias bem definidas, que ditam a selectividade para os seus objectivos.

A especificidade de alvo e a afinidade de aptâmeros são semelhantes aos dos anticorpos, mas com várias vantagens sobre os anticorpos para uso clínico. Os aptâmeros podem ser sintetizadas quimicamente em um curto período de tempo com custos relativamente baixos, o que permite uma melhor reprodutibilidade de lote para lote e mais fácil incorporação de modificações químicas. Desde aptâmeros para as células são seleccionadas, sem conhecimento prévio das moléculas alvo, aptâmeros seleccionados pode ser utilizada para identificar novos marcadores de superfície em células do cancro [14], [16] – [18], [20], [24] – [27] .

neste trabalho, um total de 13 aptâmeros foi selecionado para linhas celulares de cancro do ovário dois modelo: a linha OCCA TOV-21G [28] (10 aptâmeros) eo ovário linha de adenocarcinoma seroso Caov-3 [29 ] (3 aptâmeros). Os alvos de superfície celular dos aptâmeros também foram investigados brevemente. A investigação preliminar das metas dos aptâmeros e características de ligação também foi realizada

Resultados e Discussão

Dois modelo linhas celulares de cancro do ovário foram escolhidos para a seleção de aptâmeros de câncer de ovário:. a linha de células OCCA TOV -21G e a linha celular de adenocarcinoma seroso do ovário Caov-3. A fim de identificar os aptâmeros que se ligam especificamente a células de cancro do ovário, a linha celular de cancro cervical HeLa foi utilizada para contra-selecção. O procedimento SELEX para TOV-21G é brevemente descrito abaixo. Uma descrição detalhada é fornecida na secção experimental.

Para iniciar o processo de seleção, 20 pmol de biblioteca naive foi enriquecida por ligação monocamadas celulares para TOV-21G sequenciais. Sequências que mostram uma ligação não específica de marcadores de superfície celular gerais foram removidos por incubação do conjunto enriquecido com células HeLa (rounds 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 20, 21, 22). A piscina eluído para cada rodada de SELEX foi amplificado através de PCR, após o qual as piscinas ssDNA de interesse foram recuperados e monitorados para o enriquecimento em direção TOV-21G por citometria de fluxo. Como os conjuntos seleccionados foram enriquecido com sequências que reconhecem e se ligam à linha de células-alvo, um aumento em sinal de fluorescência foi observado (Figura 1a). Mas as tentativas para omitir contra-selecção nas rodadas 13 a 19 levaram ao enriquecimento de sequências de HeLa-vinculativos. As sequências que se ligam a células HeLa foram removidas com sucesso por selecção em ciclos subsequentes contador, enquanto que o enriquecimento para a linha de células alvo foi mantida (Figura 1b). Após 22 ciclos de SELEX, um conjunto enriquecido que se ligam especificamente à linha celular OCCA modelo, mas marginalmente a células HeLa, foi obtido (Figura 2). Assim, a associação foi enriquecida para sequências de ligação com sucesso marcadores de superfície expressas pela linha celular OCCA modelo, mas não por células de cancro do colo do útero.

A) O enriquecimento de células com TOV-21G B) A ligação marginal da respectiva piscinas a células HeLa. Ao fazer a seleção balcão, sequências de ligação para HeLa foram removidos.

O controlo negativo nestes ensaios de ligação foi PE /Cy5 marcado biblioteca aleatória. C) As células foram incubadas com concentrações variáveis ​​de aptâmero PE-marcado com Cy5 em duplicado. A intensidade de fluorescência proveniente de ligação em cada concentração de fundo foi subtraída da intensidade de fluorescência média do aptâmero correspondente

Após a conclusão do processo de seleção, três piscinas foram escolhidos e enviados para a sequenciação:. A piscina final, (round 22), a piscina anterior (round 21) e uma associação que mostra o enriquecimento mínima (round 13). Piscina sequenciação foi utilizado para ajudar a identificar candidatos de aptâmeros de gerar grandes quantidades de sequências. Este número de sequências (aqui um mínimo de 2000 por piscina) é grande o suficiente para permitir a identificação de aptâmeros que só tem uma pequena representação na piscina (ou seja, menos de 1%). Como pode ser visto na Tabela 1, aptâmeros seleccionados foram de facto presente, o mais cedo observou-se um enriquecimento mínimo. percentagem do tamanho AptTOV1 diminuiu à medida que o SELEX continuou, o que é notável dada a elevada afinidade deste aptâmero. Este comportamento também foi observado em outras selecções [30]. Outros aptâmeros mostram um aumento consistente em percentagem tamanho que o enriquecimento aumentada. Os resultados de AptTOV6 são incluídos para demonstrar que, mesmo relativamente pequenas famílias podem levar a aptâmeros.

As sequências foram alinhadas em famílias de acordo com a homologia de sequência. O número de homólogos foi comparado entre os diferentes piscinas seqüenciados para validar o seu enriquecimento através do processo de seleção usando informática básica bio. Dez sequências que mostram a melhor homologia ao longo dos conjuntos foram seleccionados como candidatos de aptâmeros, sintetizados e testados quanto à ligação às linhas celulares de cancro do ovário modelo. Todos os candidatos mostrou ligação a TOV-21G, com afinidades de ligação no pico- a gama nano-molar (Tabela 2). Isto demonstra o potencial de sequenciação próxima geração em SELEX para tornar-se um método poderoso e reprodutível para o desenvolvimento de aptâmeros.

Como se mostra na Tabela 2, aptâmeros aptTOV1 (K

d = 0,25 ± 0,08 nM) e aptTOV2 (0,90 ± 0,25 nM) se ligam muito bem às células TOV-21G. Como mostrado na Tabela 2, ambos os aptâmeros podem distinguir TOV-21G a partir de células HeLa.

A ligação dos aptâmeros seleccionados foi testado com diferentes linhas celulares de adenocarcinoma, bem como outros tipos de linhas celulares de cancro, como mostrado na tabela 2. Cinco dos aptâmeros seleccionados contra TOV-21G mostrou ligação a células CEM (leucemia linfoblástica aguda), enquanto que nenhum dos aptâmeros ligados a células de Ramos (linfoma de Burkitt) ou HL-60 (leucemia promielocítica aguda). Todos os aptâmeros obtidos se ligam ao adenocarcinoma colorrectal (HCT-116) e glioblastoma (A172). Os aptâmeros obtidos a partir TOV-21G não se ligam a DLD-1 (Dukes ‘C colorectal adenocarcinoma tipo), enquanto que os aptâmeros provenientes de Caov-3 se ligou a esta linha de células. Este comportamento é semelhante ao observado em trabalhos anteriores realizados no nosso laboratório.

Uma vez que ambas as selecções teve lugar a 4 ° C, os aptâmeros seleccionados foram testados em condições fisiológicas. Os aptâmeros foram incubados com a linha de células alvo, a 37 ° C e 4 ° C e a sua ligação foi medida. Todos os aptâmeros mostrou semelhante que ligue a 4 ° C e 37 ° C (por exemplo, aptTOV1 na Figura 2a), o que sugere que eles têm potencial para estudos in vivo.

Para investigar a natureza da molécula-alvo de cada aptâmero, ligação de cada aptâmero foi testada depois do tratamento das células alvo com as proteases tripsina ou proteinase K. Como pode ser visto na Figura 3a, aptTOV1 mostra uma clara perda de ligação a TOV-21G, após tratamento com protease. O mesmo comportamento também foi observado com todos os outros aptTOV aptâmeros. Curiosamente, para a segunda linha de células de modelo, Caov-3, DOV3 e DOV4 retiveram a sua ligação após tratamento com protease (Figura 3b), o que sugere que estes aptâmeros não pode ser a ligação a proteínas de membrana da superfície da célula, mas em vez de um outro tipo de marcador da superfície celular (ou seja, hidratos de carbono ou lípidos). Nem DOV3 nem DOV4 se liga às células de leucemia testadas (Tabela 3).

A) Não foi observada ligação para aptTOV1 para tripsinizadas células TOV-21G. B) A ligação da DOV 3 e 4 para as células Caov-3 não foi afectado por tratamento com protease. Todas as outras aptâmeros apresentaram o mesmo comportamento como representado em um).

Em conclusão, nós selecionamos uma série de aptâmeros com alta afinidade para as células de câncer de ovário, incluindo OCCA (TOV-21G) e adenocarcinoma seroso (Caov-3). Pelo contador seleção contra células HeLa, foram selecionados aptâmeros que podem distinguir o cancro do ovário de câncer cervical. Em particular, mostrou uma AptTOV muito elevada afinidade para TOV-21G, com uma K

d de 250 pM.

Dado o número limitado de biomarcadores de cancro do ovário actualmente disponíveis, os aptâmeros obtidos a partir destas selecções têm potencial para melhorar o diagnóstico eo tratamento desta doença mortal. Porque os aptâmeros também se ligam quistos benignos (Tabela 3), os aptâmeros não pode ser usado para identificar o cancro do ovário e

per se

. No entanto, uma vez que os apamers aptTOV não se ligam a um cancro de etiologia semelhante (CAOV3) e também não a células HeLa, que ainda tem o potencial de fornecer mais conhecimento sobre a patologia do cancro do ovário. Tem sido observado que existem diferenças significativas no proteoma de cancro do ovário e células serosas claro [31]. Os alvos para estes aptâmeros são provavelmente regulada negativamente ou silenciados nestes dois modelos celulares. Além disso, os aptâmeros AptTOV mostrar ligação a linhas de células de cancro a partir de diferentes tipos de cancro não relacionados (Tabela 3), e alguns aptâmeros AptTOV também ligar-se células CEM. Este resultado sugere que os aptâmeros obtidos a partir deste SELEX pode ser utilizado para perfis de expressão de proteínas de membrana de diferentes tipos de cancro. Identificar os alvos dos aptâmeros selecionados está prevista para lançar luz sobre os mecanismos subjacentes envolvidos.

A descoberta de dois aptâmeros que eram insensíveis à protease digestão é intrigante. Além disso, a sua ligação a todas as células de adenocarcinoma testadas, mas não com qualquer das linhas celulares de leucemia, sugere o potencial para elucidar melhor as diferenças moleculares subjacentes entre estes tipos de cancro. Estudos complementares são necessários para identificar os alvos destes aptâmeros e avaliar o seu desempenho em amostras clínicas.

Materiais e Métodos

Instrumentação e reagentes

Todos os oligonucleótidos foram sintetizados por fosforamidite padrão química usando um sintetizador de ADN 3400 (Applied Biosystems) e foram purificados por HPLC de fase reversa (Varian Prostar). Todas as misturas de PCR continha KCl a 50 mM, Tris-HCl a 10 (pH 8,3), MgCl 2,0 mM

2, dNTP (cada um a 2,5 mM), 0,5 ^ M de cada iniciador, e Hot Start Taq DNA polimerase (5units /microlitro ). A PCR foi realizada em um termociclador Biorad e todos os reagentes foram adquiridos a partir de Takara. Monitorização de enriquecimento piscina, caracterização dos aptâmeros seleccionados, e identificação dos ensaios de proteína-alvo foram realizadas por análise de citometria de fluxo utilizando um citómetro FACScan (BD Immunocytometry Systems). Tripsina e proteinase K foram adquiridos de Fisher Biotech. A imagem latente de células foi realizada com um microscópio confocal Olympus FV500-IX81 (Olympus America Inc., Melville, NY). As sequências de DNA foram determinados pela sequenciação do genoma serviços de laboratório na Universidade da Flórida, com o uso de 454 sequenciação (Roche).

cultura de células e buffers

O Caov-3, HeLa, Hs832 linhas de células (C) T e TOV-21G, onde obtidos a partir da cultura celular Tipo americana (ATCC). O Caov-3 e linhas celulares de cancro do ovário TOV-21G, onde mantidas em cultura com MCBD 105: Meio 199 (1:01); a linha celular de HeLa foi cultivada em meio RPMI-1640; e a linha de células Hs832 (C) T foi cultivada em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM). Todos os meios onde suplementado com FBS a 10% e 100 IU /ml de penicilina-estreptomicina. Outras linhas de células utilizadas para ensaios de selectividade incluídos CEM (leucemia de células T), Ramos (linfoma de Burkitt), HCT-116, DLD-1, HT-29 (adenocarcinoma colorrectal), NCI_H23 (cancro do pulmão de não pequenas células) e A172 (glioblastoma ), todas as quais foram cultivadas de acordo com as especificações do ATCC. Todas as linhas celulares onde foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2

atmosfera.

Durante a selecção, as células foram lavadas antes e após a incubação com tampão de lavagem (WB), contendo 4,5 g de glucose L /e MgCl 5 mM de

2 em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio (Sigma). tampão de ligação (BB) usado para a selecção foi preparada por adição de ARNt de levedura (0,1 mg /mL) (Sigma) e BSA (1 mg /mL) (Fisher) para o tampão de lavagem para reduzir a ligação de fundo.

SELEX biblioteca e primers

A biblioteca purificados por HPLC continha um segmento de sequência aleatória de 40 nucleótidos (nt) flanqueada por locais de hibridação de iniciador 20-nt:

(5’ATC CAG AGT GAC GCA GCA (N)

40 TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3 ‘) e (5’-ACT ACC AAC GAG CGA CCA CT (N)

40 AGA GTT CAG GAG AGG CAG GT-3′). Os iniciadores directos foram marcados com 5′-FITC e os iniciadores inversos foram marcados com 5′-biotina.

In Vitro Cell-SELEX

Neste estudo, TOV-21G foi usado como o linha de células alvo e células HeLa foi usada para contra-selecção. Para a primeira rodada, as células foram incubadas com 20 pmol de biblioteca ssDNA naïve dissolvido em BB. Por rodadas, 50 pmol de piscina enriquecido foram utilizados para incubação, também dissolvido em BB. Antes da incubação, o pool de ADNcs foi desnaturada por aquecimento a 95 ° C durante 5 minutos e foi arrefecida rapidamente em gelo durante 5 minutos, permitindo que cada sequência de modo a formar a estrutura secundária mais estável.

As células foram lavadas duas vezes ( 2 min) com BM e incubadas com o conjunto de ADN em gelo num agitador orbital durante 30 min. Em posteriores rondas de selecção, as células foram lavadas com maior rigor para remover as sequências de ligação (fracamente um maior número de lavagens e aumento do tempo de lavagem, até 5 minutos). As sequências ligadas foram eluídas em 500 uL BB por aquecimento a 95 ° C durante 15 min, arrefeceu-se em gelo durante 5 min e centrifugadas a 14.000 rpm durante 2 min

.

O sobrenadante contendo as sequências de ADN foi então incubado com uma linha celular negativa para realizar uma subtracção de sequências gerais, como descrito acima. As restantes sequências foram amplificadas por PCR utilizando o FITC e iniciadores marcados com biotina. As amplificações foram levadas a cabo a 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 30 s, seguido de extensão final durante 3 min a 72 ° C. O sentido de ADNcs seleccionado foi separada do anti-sentido ADNcs biotinilado por pérolas de sefarose revestidas com estreptavidina (Amersham Bioscience). O ADNcs foi eluída das esferas de sepharose por fusão de uma solução de NaOH 0,2M.

O enriquecimento de sequências específicas foi testada utilizando citometria de fluxo, tal como explicado abaixo. Quando o nível de enriquecimento atingido um patamar, piscinas de interesse foram submetidos a sequenciação. A selecção aptâmero para a linha celular CAOV3 foi realizada utilizando o mesmo protocolo, no entanto, um passo tripsinização 1 minuto foi usado para suspender as células antes de adicionar as piscinas. Dados Suplementar S1 e S2 contêm os dados de Clustal os alinhamentos de cada selecção (conjunto final)

estudos de afinidade:. Análise de fluxo citofluorométricas para a determinação da afinidade de ligação

Para determinar as afinidades de ligação de os aptâmeros, as células alvo (5 × 10

5) foram incubadas com várias concentrações de 5′-biotina aptâmeros marcados em gelo durante 20 min em 100 mL de BB. As células foram então lavadas duas vezes com 500 mL de BB, e suspendeu-se em 100 uL de BB contendo estreptavidina-PE-Cy5.5. As células foram então lavadas duas vezes com 500 mL de WB, e foram suspensas em 200 uL de BB para análise de citometria de fluxo, utilizando uma 5′-biotina marcado com sequência aleatória como controlo negativo. Todas as experiências de ensaios de ligação foram repetidos pelo menos 2 vezes. A intensidade de ligação específica foi calculada por subtracção da intensidade de fluorescência média da ligação a partir da intensidade de fluorescência média dos aptâmeros de fundo. A constante de equilíbrio de dissociação (K

d) do ligando fluorescente foi obtida ajustando uma curva da intensidade de ligação específica contra (Y) a concentração de aptâmero (X) para a equação Y = B

maxX /(K

d + X) utilizando SigmaPlot. (Jandel, San Rafael, CA). S3 dados Suplementar contém os dados de fluxo para todos os experimentos apresentados neste artigo.

Seletividade e especificidade

Para determinar a especificidade celular dos aptâmeros selecionados, linhas de células, incluindo células HeLa, K562, H23, H69 , A172, HL-60. HT-29, Ramos e CEM foram usadas em ensaios de ligação por citometria de fluxo como descrito acima.

Efeito da temperatura na aptâmero ligação

O processo de selecção aptâmero e todos os ensaios de ligação foram realizados em Gelo. Tem sido observado que alguns dos aptâmeros seleccionados a temperaturas mais baixas pode não se ligam bem a 37 ° C [26], que conduz a um mau desempenho sob condições fisiológicas. A fim de verificar a estabilidade de ligação, aptâmeros foram incubados com o alvo, a 37 ° C, e a intensidade de fluorescência foi determinada por citometria de fluxo. Os aptâmeros incubadas em gelo foram usadas como controlo positivo.

Protease digestão ensaio

As células alvo (5 × 10

5) foram separados utilizando uma solução de dissociação de células não enzimática. Após ressuspensão, as células foram lavadas com 3 mL de PBS e depois incubadas com 1 mL de 0,05% tripsina /EDTA 0,53 mM em HBSS ou 0,1 mg /ml de proteinase K em PBS a 37 ° C durante 1, 5, 15, 30 e 60 minutos. Puro FBS foi adicionado para extinguir as proteinases. Após lavagem com 2 mL de BB, as células tratadas foram usadas para ensaios de ligação tal como descrito acima.

Apoiando informação

dados S1.

allignment da piscina TOV última

doi:. 10.1371 /journal.pone.0013770.s001

(1,13 MB TXT)

Dados S2.

allignment da piscina CAOV3 última

doi:. 10.1371 /journal.pone.0013770.s002

(0.20 MB TXT)

Dados S3.

Este arquivo contém os dados de fluxo dos números apresentados neste artigo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0013770.s003

(3.69 MB ZIP)

Dados S4.

Legend à quantidade de vantagens. Esta figura foi nosso guia para determinar a quantidade de vantagens para a tabela 3.

doi: 10.1371 /journal.pone.0013770.s004

(0.04 MB PDF)

Reconhecimentos

Agradecemos Drs. Parag Parekh e Tahir Bayrac para as muitas discussões científicas úteis que contribuíram para este trabalho, o Sr. George Ansoaunoor para ajuda técnica. Agradecemos também o Dr. Kathryn Williams por sua revisão crítica do manuscrito. Agradecemos o núcleo de sequenciamento de DNA, ICBR, da Universidade da Flórida.