Abstract

pancreatite auto-imune (AIP) é definida por infiltrado linfoplasmocitário característica, estenose ductal e um alargamento do pâncreas ou massa que pode imitar o cancro do pâncreas (PACA) . A distinção entre esta doença benigna e câncer pancreático pode ser um desafio. No entanto, um diagnóstico preciso pode antecipar-se a erros de diagnóstico de câncer, permitindo o tratamento médico adequado da AIP e, consequentemente, diminuindo o número de ressecções pancreáticas desnecessários.

A espectrometria de massa (MS) e gel diferencial bidimensional eletroforese (2D DIGE) têm sido aplicados para analisar as alterações de proteínas séricas associadas a AIP e paca e identificar assinaturas de proteínas indicativas das doenças. soros dos pacientes foram Imunodeprimido a partir das 20 proteínas séricas mais proeminentes antes de posterior análise de imagens 2D DIGE e. A identidade das proteínas mais discriminatórios detectados, foi realizada por ELISA e MS foram utilizados para confirmar a sua expressão. Serum profiling análise de dados com 2D DIGE revelou 39 picos de proteínas capazes de discriminar entre AIP e PaCa. As proteínas foram purificadas e analisadas por MALDI-TOF-MS. impressões digitais da massa dos péptidos conduziu à identificação de onze proteínas. Entre eles apolipoproteína AI, a apolipoproteína A-II, de transtirretina, e tetranectina foram identificados e encontrados como 3.0-, 3.5-, 2-, e 1,6 vezes diminuiu em soros PaCa, respectivamente, ao passo que a haptoglobina e apolipoproteína E foram encontrados para ser 3.8- e 1,6 vezes elevados em soros PaCa. Com a excepção da haptoglobina os resultados de ELISA de proteínas identificadas confirmou as características de análise de imagem 2D-DIGE. Integração das proteínas séricas identificados como marcadores AIP pode ter um potencial considerável para fornecer informações adicionais para o diagnóstico da AIP para escolher o tratamento adequado

Citation:. Felix K, Hauck O, Fritz S, Hinz U, Schnolzer M , Kempf T, et al. (2013) Assinaturas proteína do soro Diferenciar auto-imune Pancreatite contra o cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (12): e82755. doi: 10.1371 /journal.pone.0082755

editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Alemanha |

Recebido: 02 de janeiro de 2013; Aceito: 04 de novembro de 2013; Publicação: 09 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Felix et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação alemã de Pesquisa (DFG) FE 940 /2-1. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pancreatite auto-imune (AIP) é uma entidade clínica distinta, descrito como um processo inflamatório crônico do pâncreas com mecanismos auto-imunes. Clinicamente e histologicamente, não existem dois subconjuntos de pancreatite auto-imune (tipo 1 e tipo 2 AIP) e deve ser distinguido [1] – [4]. O tipo 1 AIP, a pancreatite esclerosante lymphoplasmacytic (LPSP), mostra algumas características típicas: periductal lymphoplasmacytic infiltrado, fibrose, venulite obliterante, e infiltração de células plasmáticas IgG4-positivo. O tipo 2 AIP pancreatite conduta centrada idiopática (IDCP) é caracterizada por infiltração massiva de granulócitos no parênquima pancreático e lesões epiteliais do dueto (gel). Esses recursos são descritos nos critérios de Mayo HISORt, que usamos em nossa clínica [5]. Tipo 1 AIP afeta predominantemente homens adultos com 90% dos pacientes com mais de 40 anos de idade [6]. A apresentação clínica mais comum de tipo 1 AIP é a icterícia obstrutiva aguda, que é relatada em até 75% dos pacientes [7]. Além disso, um alargamento do pâncreas ou de massa pode imitar o cancro do pâncreas em até 80% dos pacientes [1]. Na presença de um novo aparecimento da diabetes e perda de peso, a distinção entre AIP e câncer pancreático pode ser um desafio. Além disso, em uma tomografia computadorizada ou ressonância magnética (MRI), um certo alargamento “em forma de salsicha” do pâncreas, com realce periférico atraso (realce rim) é descrito [8] – [10]. Endoscópica retrógrada cholangio-pancreatografia (CPRE) revela estreitamento segmentar típico e múltiplas restrições, que podem ajudar a diferenciar entre câncer de pâncreas e colangite esclerosante primária [11] – [13]. Tipo 1 AIP apresenta várias características serológicas. O mais proeminente deles está níveis séricos elevados de IgG4, que é fundamental para o diagnóstico em ausência de histologia de acordo com os critérios de Mayo HISORt [5]. Além disso, anticorpos antinucleares, anidrase anticarbonic e antilactoferrin pode ser aumentado também. AIP muitas vezes pode ser difícil de distinguir de PaCa como dados demográficos dos pacientes, bem como as características clínicas e de imagem (por exemplo o alargamento do pâncreas, icterícia obstrutiva em 76%, a perda de peso em 35% dos pacientes), são semelhantes. Portanto, é necessário reconhecer AIP desde 2,5-11% de todos os pacientes submetidos a cirurgia para suspeita PaCa são realmente ter uma doença inflamatória benigna do pâncreas [14] – [16]. AIP podem ser tratados por esteróides, e a elevada resposta a esta terapia é um critério de diagnóstico importante. Portanto, é extremamente importante para diagnosticar AIP para escolher o tratamento adequado e evitar a cirurgia desnecessária.

O objetivo deste estudo inicial foi identificar proteínas séricas (biomarcadores soro) que permitem discriminar AIP a partir PaCa. Para este efeito, aplicou-se uma estratégia de proteómica como descrito na figura 1. A identidade das proteínas detectada foi determinada por uma combinação de várias técnicas, incluindo o fraccionamento de proteínas do soro por subtracção de imunoaf inidade de proteínas proeminentes, electroforese 2D em gel, e de espectrometria de massa e finalmente confirmado e avaliados os níveis de proteína do soro pela enzima ligada ensaios de imunossorvente (ELISA).

seis soros de cada grupo (AIP, PACA e Ctr) foram primeiro submetido a uma redução da complexidade do soro por remoção dos 20 mais abundante proteínas do soro por imunodepleção colunas. Os soros processados ​​por imunoafinidade foram submetidos em paralelo com 2D DIGE e 2 PÁGINA D, e diferencialmente expressos proteínas identificadas através da análise de imagens DIGE foram pareados com o gel preparativo, as manchas de proteína foram excisadas como plugs de gel, preparado para a digestão tríptica e identificados por SENHORA. A validação conformação e piloto de proteínas identificadas foi realizada por ELISA.

Materiais e Métodos

Amostra coleção

amostras de tecido pancreático foram prospectivamente coletados entre Janeiro de 2003 e Março 2010, no Departamento de Cirurgia da Universidade de Heidelberg. O diagnóstico de pancreatite crônica (CP), a paca ou AIP foi confirmado por exame histopatológico. No caso de AIP, foram utilizados os critérios Mayo Clinic (HISORt) [5]. O exame histológico de, embebidos em parafina e H cortes de tecidos pancreáticos E-manchado foi realizada por um patologista do Instituto de Patologia da Universidade de Heidelberg

de sangue no pré-operatório foi coletado de pacientes com diagnóstico de adenocarcinoma de. pâncreas (PACA 270 amostras), pancreatite crônica (CP, 290 amostras), pancreatite auto-imune (AIP, 32 amostras), um grupo controle de voluntários saudáveis ​​(Co, 127 amostras), e outros cancros gastrointestinais (Gica, 165 amostras ). Na admissão características específicas do paciente (idade, sexo, índice de massa corporal (IMC) sintomas clínicos, perda de peso, envolvimento de outros órgãos, complicações, exames de sangue e tratamentos, etc.) foram documentados. Todos os soros foram obtidos de acordo com uma amostragem padronizada e codificação protocolo [17]

Declaração de Ética:. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Heidelberg, e um termo de consentimento informado foi obtido de todos os pacientes.

a detecção de anticorpos IgG total e IgG4

Um traço característico de AIP é a presença de níveis elevados de IgG no soro, particularmente a subclasse IgG4. Para avaliar melhor o valor diagnóstico do total de níveis de IgG e IgG4 em AIP, foi realizada a detecção dos anticorpos. A IgG total e os níveis séricos de IgG4 do subconjunto foram determinados no momento do diagnóstico por nefelometria, usando um BNII Nefelómetro (Dade Behring) como um teste de ensaio padrão para quantificar imunoglobulinas séricas. Os níveis totais de IgG e soro IgG4 foram consideradas para ser elevado quando a concentração atingiu valores de ≥ 16,0 g /l e ≥ 1,4 g /l, respectivamente [18].

A resposta imune a 15

H. proteínas pylori

Semelhante ao desenvolvimento de câncer gástrico, um papel patogênico da

H. pylori

tem sido discutida por doença pancreática [19]. Nós investigamos a associação de anticorpos para 15 diferentes

H. pylori

proteínas e doença pancreática em relação ao

H. doença gástrica -associated pylori

. Foram analisados ​​os soros de pacientes com pancreatite auto-imune (AIP, n = 32), pancreatite crónica (CP, n = 290) e do cancro do pâncreas (PaCa, n = 269), e em comparação com controlos saudáveis ​​(CO, n = 127) e outra cancros tracto gastrointestinal (gica, n = 165) com

H. pylori

sorologia multiplex [20] que permite a detecção simultânea de anticorpos para 15

H. pylori

antígenos espec�icos (uréia, catalase, GroEL, Napa, CagA, CagM, Cagδ, HP0231, Vaca, HpaA, CAD, HyuA, OMP HcpC, HP0305). O método de multiplex é baseado em uma glutationa-S-transferase de captura ensaio imunossorvente combinado com a tecnologia fluorescente talão [21], [22]. Recombinante GST

H. proteínas de fusão pylori

foram usadas como antigénios, carregada e-purificado por afinidade em glutationa-espectralmente distinto-caseína acoplada (GC) de grânulos de poliestireno marcado com fluorescência (SeroMap, Luminex, Austin, Texas). Os anticorpos ligados às esferas através da GST

h. proteínas de fusão pylori

foram coradas com IgA de cabra biotinilado anti-humano, de IgM, IgG (Dianova, Hamburgo, Alemanha) e a estreptavidina repórter conjugado de R-ficoeritrina marcada. Um analisador Luminex 100 identificados a cor interna do grânulo e, por conseguinte, o antigénio transportado pelo grânulo. A quantidade de anticorpos ligados foi determinado como o repórter mediana da intensidade de fluorescência (IMF) de pelo menos 100 esferas por pérola definida por soro.

Para todos os 15 antigénios, os valores de corte específico para o antigénio determinada num estudo de validação [20] foram aplicadas a partir dos valores de MFI de 20 soros adicional negativo em Helicobacter-R Biopharm-ELISA como média mais 3 desvios-padrão com exclusão de outliers positivos. dados do estudo foi normalizado para este estudo de validação anterior, dividindo as reactividades de anticorpos específicos para o antigénio pelas inclinações das linhas de regressão dos pares de dados de um painel de soros de controlo de qualidade com 77 a

H definido. pylori

run estatuto neste e no estudo de validação anterior. Todos os soros foram analisados ​​uma vez no 1:100 diluição dentro de um único dia do ensaio.

H. pylori

sero-positividade foi definida como sero-positividade para . 3 proteínas, que mostrou excelente concordância (kappa = 0,70) com a classificação teste sorológico comercial [20]

análise Proteome

2D-DIGE Antes da análise bidimensional diferenciação de AIP, PACA e soros de controlo, um passo de separação para eliminar as proteínas do soro 20 mais proeminentes foi realizada para obter um melhor acesso às proteínas séricas menos proeminentes. Para este fim, os soros dos pacientes foram submetidos a um passo imunodepleção usando o kit de ProteoPrep 20 e guia de utilizador (Sigma, Deisenhofen, Alemanha). Os soros esgotados e diluídas foram subsequentemente ajustado às concentrações de proteína necessárias de 1,0 mg /ml com o protocolo de precipitação de proteínas de Wessel e Flügge, e os precipitados de proteína foram reconstituídos em tampão de lise (ureia 8 M, Tris 20 mM, 4% CHAPS, pH 8,5) [23]. As amostras utilizadas para análise 2D DIGE foram marcadas com CyDye DIGE fluor corantes mínimas (GE-Healthcare GmbH, Freiburg, Alemanha) antes da análise de gel 2D. Para este fim, 50 ^ g de proteína foram misturadas com 400 pmol CyDye dissolvido em DMF, agitada em vórtice, centrifugada e incubada no escuro em gelo durante 30 min. O excesso de corante foi obrigado pela adição de 1 ml de lisina 10 mM à mistura. Um protocolo detalhado é descrita no Manual do Utilizador Ettan DIGE System (GE Healthcare-2005) e [24].

Immobiline DryStrips de 24 cm e pH 3-10 NL (GE Healthcare) foram passivamente carregados com 300 ug de amostras de proteína ressuspenso em 350 ul de uma mistura de 150 ul de tampão de lise (ureia 7 M, 2 M tioureia, 4% w /v de CHAPS) e 200 solução destreak ul (2% w /v de IPG-anfólito, de 2% w /v ditiotreitol DTT). IEF foi realizada com um sistema Ettan IPGphor IEF unidade (GE Healthcare) e um gradiente de voltagem de até 8 kV (total 35,5 KVH). Antes da segunda dimensão executar em uma página de 15%, as tiras de IPG foram gradual equilibrada durante 15 min em um /HCl-tampão Tris (pH 8,8, ureia 6 M, glicerol a 30%, 2% SDS) com 1% DTT, seguido 2,5% iodoacetamida. Foi utilizado um marcador de peso molecular (SM0671 Sigma), e a electroforese é executado durante a noite a constante de 12 W. Os geles foram digitalizadas utilizando um scanner Typhoon 9410 (GE Healthcare). quantificação de proteínas em todas as amostras foi realizada utilizando DeCyder 2D 6.5 software (GE Healthcare). Aplicando um módulo DIA, o Cy2 rotulados padrão interno permitiu a normalização das manchas de proteína em todos os géis. Com o módulo BVA, um teste t de Student (não emparelhado, bicaudal) foi usada para calcular significativa (p 0,05) as diferenças de uma quantidade de proteína /local relativa em seis soros AIP em comparação com seis soros PaCa. Spots não foram encontrados para ser estatisticamente significativa foram mapeados e isolado para uma investigação mais aprofundada, conforme descrito abaixo.

Identificação de proteínas de géis 2D por MALDI-TOF MS.

Depois de alinhar os géis corados com prata com os géis preparativos correspondentes, os pontos recorrentes e correspondentes foram marcados com um número de identificação. As manchas de proteína foram seleccionados perfurados para fora a partir dos géis 2D, colocados em tubos de 200 ul marcado com ID individuais, e lavou-se duas vezes com 70% de acetonitrilo (ACN), 40 mM de NH

4HCO

3. Depois da redução com DTT 10 mM durante 1 h a 56 ° C e a alquilação com iodoacetamida 55 mM durante 30 min à temperatura ambiente, os tampões de gel foram lavados três vezes alternadamente com 40 mM NH

4HCO

3 e etanol. Após secagem com acetonitrilo, uma digestão com tripsina em gel foi realizada por adição de 100 ng de tripsina em 40 mM de NH

4HCO

3, durante a noite a 37 ° C. Os péptidos resultantes foram extraídos a partir dos tampões de gel por uma adição de 15 ul de solução de extracção (1% de ACN, 1% de ácido fórmico).

Para a identificação por espectrometria de massa das digestões com tripsina de impressão digital de massa do péptido, foram preparadas amostras em alvos PrespottedAnchorChip (PAC) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante (Bruker-Daltonik, Bremen, Alemanha). a-ciano-4-hidroxicinâmico foi utilizado como uma matriz [25]. Os espectros de massa foram registados no modo de iões reflector positiva com a extração atrasada em um Ultraflex I instrumento time-of-flight (Bruker-Daltonik, Bremen, Alemanha). aceleração de iões foi ajustada para 25,0 kV, o reflector de 26,3 kV, e a primeira placa de extracção de 21,75 kV. Os espectros de massa foram obtidos pela soma 500-1500 disparos de laser individuais. Calibração de espectros foi realizada externamente por um ajuste quadrático usando uma mistura padrão de calibração contendo péptido bradiquinina (1-7) a m /z 757,399, a angiotensina II, a m /z 1.046,542, angiotensina I a m /z 1.296,685, neurotensina a m /z 1672.917, renina substrato a m /z 1758.933, clip ACTH (1-17) em m /z 2.093,086, clip ACTH (18-39) a m /z 2.465,198, clip ACTH (1-24) em m /z 2.932,588, e clipe de ACTH (7-38) a m /z 3.657,929. massas peptídicas monoisotópico de carga única foram utilizados como insumos para a pesquisa de banco de dados. Pesquisas foram realizadas no banco de dados NCBInr (lançado 2009-09-09) usando o mascote versão algoritmo de busca v2.2 (Matrix Ciência, London, UK). Taxonomia foi mamíferos, a massa de proteína foi restrita a 100 kDa, e pontos isoeléctricos foram autorizados a variar de 0 a 14. Carbamidomethylation de cisteína foi incluído como modificação fixo, e a oxidação da metionina foi deixada como a modificação variável. Até um perdido local de clivagem tríptica foi considerado, e a tolerância em massa para as massas peptídicas monoisotópico foi definido a +/- 75 ppm.

ensaio imunoenzimático (ELISA)

em fase sólida ELISA sanduíche de captura foram realizados utilizando kits disponíveis comercialmente para a apolipoproteína AI (ALerCHEK Inc., Portland, Maine). A apolipoproteína A-II, apolipoproteína E e haptoglobina eram de AssayPro (AssayPro, St. Charles, MO), tetranectina de USCN Life Science Inc. (Wuhan, China), e transtirretina de Immundiagnostik AG (Bensheim, Alemanha). A haptoglobina ELISA de AssayPro é também um ELISA sanduíche, mas com uma técnica de imunoensaio enzimático competitivo. Os seis ELISA utilizados quantificar a soma de todos os antigénios que se ligam a anticorpos e, portanto, não revelam a contribuição relativa de isoformas ou formas modificadas pós-tradução. Todos os soros foram diluídos de acordo com as instruções do fabricante fornecidas com tampões ou tampão TBS, e os ensaios foram realizados de acordo com os protocolos do fabricante. Carboidratos antigénio 19-9 (CA 19-9) foi determinada no soro por um imunoensaio sanduíche com a utilização de um imunoensaio de electroquimioluminescência (ECLIA, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha).

análise biométrica

a análise estatística foi realizada por GraphPad Prism 5 software (software GraphPad, Inc., San Diego, Califórnia, EUA) e SAS versão de software 9.1 (SAS Institute, Cary, Carolina do Norte, EUA).

Biometric a análise foi realizada para examinar a força de correlação entre os parâmetros clínicos de massa corporal-índice (IMC) e o marcador tumoral CA 19-9 com níveis de validações baseado em ELISA dos seis marcadores proteicos. Dependendo da natureza das distribuições dos parâmetros quantitativos em cada grupo o coeficiente r correlação com o seu valor p correspondente de Pearson e Spearman foram utilizados para analisar as correlações. O caráter das distribuições dos parâmetros quantitativos foi determinada por meio do teste de Shapiro-Wilk e um gráfico de probabilidade normal.

Resultados

anormalidades sorológicas

Dois padrões clínicos são distintos em pacientes diagnosticados com AIP: classificados como tipo 1 e tipo 2. Foram analisadas nossa coorte em conformidade. A marca da AIP tipo 1 é a elevação da gamaglobulina e seu subconjunto, o G4 imunoglobulina (IgG4) níveis séricos; portanto, analisamos nossas amostras para essas anormalidades. A partir das amostras analisadas (n = 32), três pacientes foram caracterizados com IgG anormal total de 16 g /L, e 18 amostras (59%) apresentaram níveis elevados de IgG4 (limite máximo 1,4 g /L), variando entre 1,8 e 16,6 g /L (Fig. 2).

os níveis séricos de IgG e IgG4 foram determinados por imunonefelometria automatizado, e considerada elevada quando ≥16.0 g /l e ≥1.4 g /L, respectivamente (linhas a tracejado).

H. pylori e AIP

Desde

infecção por Helicobacter pylori

tem sido associado com a patogênese da AIP, foi investigada a associação de anticorpos para 15 diferentes

H. proteínas pylori

em soros de 32 AIP e em comparação com outras doenças e controles pancreáticas. análises de anticorpos foram realizados com serologia multiplex com base na expresso de forma recombinante e purificada por afinidade

H. pylori

proteínas em combinação com a tecnologia talão fluorescente (Luminex).

H. pylori

seroprevalência foi de 43,8% em AIP e 56,9% em CP em comparação com 64,7% em PACA 69,7% em diferentes cancros GI e 50,4% nos controlos (resumidas na Tabela 1).

H. pylori

pacientes soropositivos com AIP apresentaram respostas de anticorpos significativamente mais baixos para 3 antígenos (Cagδ, CagA, HP0231) e pacientes com pancreatite crónica a 9 (Cad, Cagδ, CagA, CagM, HP0305, HpaA, HyuA, Omp e VacA) em comparação com

H. pylori

pacientes soropositivos com outros tipos de câncer do trato gastrointestinal, como referência, com a existência de um aumento significativo de reatividade de anticorpos para VacA no

H. pylori

pacientes soropositivos com AIP e Napa em pessoas com câncer pancreático. Entre os doentes com doenças pancreáticas, nossos dados não suporta uma associação significativa da

H. pylori

infecção com AIP

expressão da proteína do soro de perfil aplicando imunodepleção e 2D DIGE:. Para localizar e identificar biomarcadores de diagnóstico potenciais para o diagnóstico diferencial da AIP e PaCa, foram analisados ​​soros de seis AIP e seis pacientes Paca de acordo com a estratégia apresentada na Figura 1. Para esse efeito, os soros foram primeiro Imunodeprimido de proteínas de elevada abundância, em seguida, marcadas com corantes de fluorescência e separadas por electroforese de gel de duas dimensões. A análise estatística das imagens de gel obtidos com um pacote de software DeCyder 39 revelou significativamente alterado (p 0,05) entre as proteínas AIP e grupos PACA. As manchas de proteínas de correspondência com a regulação diferencial mais elevada (n = 14) foram excisados ​​a partir de géis 2D-PAGE preparativa e sujeito a digestão em gel tríptica. misturas de péptidos trípticos foram analisadas com MALDI-TOF-MS e identificados por uma busca de base de dados utilizando o algoritmo de MASCOT. Uma lista de proteínas identificadas, regulados diferencialmente em AIP e PaCa está resumida na Tabela 2. Um ponto foi perdida durante a preparação, mas mais tarde identificada como a apolipoproteína A-II. Para a sua identificação do gel Cy2-coradas foi subsequentemente corado com prata, a mancha foi cortado, digerido com tripsina e sujeita a análise de espectrometria de massa.

identificado apolipoproteína AI, a apolipoproteína A-II e transtirretina com uma razão de AIP /PaCa de 3, 3,5 e 2, respectivamente. Em AIP também encontramos níveis séricos elevados de tetranectina e imunoglobulinas, enquanto que em PaCa soros, apolipoproteína E e haptoglobina (PaCa rácio /AIP de 1,6 e 3,8 respectivamente) foram encontrados elevados.

Conformação de expressão diferencial de biomarcador candidato proteínas

Para avaliar a precisão do diagnóstico dos biomarcadores candidatos encontrados por 2D DIGE e MS, medimos os níveis séricos de apolipoproteína-AI, apolipoproteína-a-II, apolipoproteína-e, os níveis de transtirretina, de tetranectina e haptoglobina por ELISAs disponíveis comercialmente em uma coorte de 32 AIP, 30 PaCa, e 30 controles saudáveis ​​de amostras escolhidas aleatoriamente. Com estes ensaios, foram capazes de discriminar os soros AIP a partir do grupo PaCa, e confirmaram os resultados de espectrometria de massa. Com a excepção da haptoglobina (p = 0,1), todos marcadores aqui testadas revelaram diferenças significativas (p 0,05). A Figura 3 mostra os gráficos dos resultados de proteína de cada grupo. Os valores estão apresentados como média com SEM. Parcelas

Dot de apolipoproteína A-I, apolipoproteina A-II, apolipoproteína E, transtirretina, tetranectina, e haptoglobina para cada grupo. A análise estatística foi realizada com GraphPad Prism5 aplicação do teste Mann Whitney (bicaudal). Os valores são apresentados como uma média com SEM.

análise biométrica

Os dados categorizados CA 19-9 e IMC dos três grupos são apresentados na Tabela 3 e Tabela 4 e distribuição gama é mostrado como gráfico de caixa-and-whisker na Figura 4A. Para avaliar a força da associação linear entre os níveis de validações baseadas em ELISA com índice de massa corporal (IMC) e níveis de CA 19-9 coeficientes de correlação para todos os seis marcadores de proteína foram determinadas

A:. Índice de massa corporal e CA 19-9 níveis no AIP-, PaCa- e grupo-controle utilizado nas validações baseadas em ELISA. O IMC e os valores de CA 19-9 de três grupos AIP, paca e controle são apresentados como parcelas caixa de e-suiça. As comparações entre os três grupos foram realizadas por meio do teste de Kruskal-Wallis como teste geral seguido pelo Mann-Whitney U para comparações de pares. B: Reavaliação dos ELISAs para os seis marcadores aplicando uma CA 19-9 corte de 37 U /ml. No que diz respeito aos marcadores proteicos seis subgrupos de AIP e PaCa definidos por um valor CA 19-9 37 U /ml foram comparados com o unilateral de Mann-Whitney U.. A significância foi aceita pelo nível de 95%. Os diagramas de caixa com max, Q3, mediana, Q1 e min.

Na análise de associação dos seis marcadores e IMC única tetranectina reveladas para os três grupos como um todo, um negativo coeficiente de correlação com um valor de r = -0,374 e p = 0,01. Essa correlação negativa foi ainda mais pronunciada quando o grupo PaCa só foi analisada com r = -0,588 e p = 0,006.

A análise de associação dos seis marcadores e CA 19-9 níveis para os três grupos como um todo revelou uma correlação negativa para a apolipoproteína AI e transtirretina com o coeficiente de correlação foi de r = -0,388 (p = 0,012) e r = -0372 (p = 0,0235), respectivamente. Analisando PaCa sozinho um coeficiente de correlação negativa foi encontrada somente para apolipoproteína A-II com um valor de r = -0,439; mas não o nível de significância com p = 0,08.

Uma vez que todas as amostras AIP mostrou CA 19.9 níveis séricos abaixo de 37 U /ml comparamos os dados de ELISA com o subgrupo PaCa correspondente (n = 21) com CA 19-9 níveis inferiores a 37 U /mL. A análise estatística revelou ainda diferenças significativas para apolipoproteína A-I, tetranectina e thransthyretin. A apolipoproteína A-II (p = 0,053) e da apolipoproteína E (p = 0,061) falhou ligeiramente o nível de significância (Fig. 4B).

Discussão

A distinção AIP a partir PaCa através de abordagens não-invasivas tais como marcadores biológicos, ou de imagem é importante uma vez que até 11% dos pacientes submetidos a cirurgia para câncer de pâncreas são diagnosticados para ter uma condição inflamatória benigna. marcadores sorológicos tal como y-globulinas elevados, especialmente IgG4, foram sugeridos como bons candidatos para diagnóstico diferencial. Níveis elevados de IgG4 são considerados como o marcador sérico mais sensível para o diagnóstico de AIP [18]. No entanto, demonstrou-se recentemente que a IgG4 podem também ser elevados em até 10% dos pacientes PACA e é, por conseguinte, nem sempre é específico para distinguir AIP a partir PaCa [26]. Além disso, casos soronegativos de AIP foram descritos por Ghazale [27].

O nosso aqui investigada AIP estudo de coorte mostrou que apenas 58% das amostras com valores IgG4 acima de 1,4 g /l. Uma variedade de auto-anticorpos contra o antigénio de entre eles nuclear, lactoferrina ou anidrase carbónica II (CAII) foram relatados em AIP soros dos doentes, mas nenhum deles é conhecido como sendo da subclasse IgG4. Ainda não está claro se a formação desses auto-anticorpos e aumento dos níveis de IgG4 desempenhar um papel patogênico ou são epifenómenos da AIP [28], [29]. Uma equipa de investigação no Japão sucedido na indução de AIP em ratinhos atímicos recém-nascido por imunização los com lactoferrina e CAII [30]. Outro grupo de pesquisa detectados anticorpos contra α2 amilase em AIP [31]. Nenhum dos marcadores relatados são tão específicos que podem discriminar com segurança entre AIP e PaCa.

Uma possível interligação entre

Helicobacter pylori

infecção e AIP tem sido relatada [19]. Vários laboratórios sugeriu um mimetismo molecular como uma causa, em que os anticorpos dirigidos para

H. proteínas pylori

também se ligam a sequências peptídicas do corpo-próprio e induzir uma resposta imune no pâncreas [32] – [36]. Notavelmente, em um trabalho recente, mostrou-se que em 19 de 20 doentes de PAI rastreadas, auto-anticorpos contra as proteínas de ligação do plasminogénio a partir de

H. pylori

foram encontrados, que foram provavelmente um marcador sorológico útil distinguir AIP de PACA e CP [19]. No entanto, o rastreio de todos os nossos pacientes AIP revelou um

H. pylori

soroprevalência de 43,8% e foi o menor de todos os grupos testados. Uma explicação para a discrepância entre os resultados dos estudos poderia ser a origem geográfica e ambientalmente diferente dos pacientes. Nossos resultados também confirmam um estudo anterior, onde no pâncreas de 11 pacientes AIP nenhuma

H pylori

urease A e 16S rDNA foram detectados por PCR [37].

Profiling de soros empatou e subfractionated da AIP e os pacientes Paca em ProteinChip em um de nossos estudos anteriores que aplicam a técnica SELDI-TOF-MS revelou 38 proteínas marcadores potenciais que variam entre 3,14 e 42,23 kDa [38]. Aprofundar a análise dos resultados de perfis obtidos por SELDI-TOF-MS, realizamos aqui um estudo 2D DIGE em imunoafinidade soro empobrecido para identificar candidatos a marcadores para o diagnóstico diferencial das duas doenças. Comparando o AIP e PaCa 2D-DIGE dados de expressão de proteína utilizando a análise de imagem DeCyder, que encontramos nos soros de doentes de PAI três vezes os níveis mais elevados de apolipoproteína AI, níveis de 3,5 vezes mais elevadas de apolipoproteína A-II e duas vezes os níveis mais elevados de transtirretina (CTT). Em AIP também encontramos tetranectina elevada e imunoglobulinas, enquanto que em PaCa, apolipoproteína E e haptoglobina foram maiores. Observações sobre diminuição dos níveis de apo AI, apo A-II ea CTT em PACA e CP em comparação com indivíduos normais foram feitas em nossos estudos anteriores [17], [38], [39].

Devido ao fato que as observações aqui descritas podem contribuir para um melhor diagnóstico diferencial da AIP e PaCa, realizamos ELISAs para os seis proteínas para confirmar os dados 2D DIGE /MS e para avaliar o seu desempenho global. Com a exceção de haptoglobina, para o qual não houve diferença significativa, as relações entre os dois grupos revelou características semelhantes, mas as proporções eram menos proeminentes. Os níveis elevados de apolipoproteína sérico em pacientes Paca avaliados neste estudo inicial 2D DIGE e ELISA estão em concordância com um estudo recente ser Chen et al. A aplicação de abordagens diferentes, incluindo ELISA eles encontraram um up-regulação da apolipoproteína E na PACA-tecidos e níveis elevados de apolipoproteína da paca soro pacientes [40].

O grupo de AIP e controle soros mostrou uma gama de distribuição semelhante para as apolipoproteínas, indicando que o teor de soro destas proteínas é comparável. O próximo passo seria testar se a combinação dos marcadores identificados nos permite fazer uma previsão confiável em amostras de soro desconhecidas. Também outra aqui nas proteínas estudo identificou poderia ser integrado em tais testes. A razão para a diminuição dos níveis das proteínas acima mencionadas em PACA e soros CP, em comparação com voluntários saudáveis ​​ou AIP, é claro, mas existem algumas explicações. Ambos os pacientes Paca CP e sofrem de desnutrição e caquexia estimulando a síntese de proteínas de fase aguda no fígado, mas a síntese de apolipoproteínas, transtirretina, e gotas de proteína de ligação do retinol. No entanto, a identificação de caquexia não era possível, sem perda de peso dramática na história médica do paciente foram registrados, a maioria dos pacientes aqui analisados ​​mostraram normal ou ligeiramente elevada IMC e apenas um paciente PaCa tinham um IMC abaixo de 19 como mostra a Tabela 4. O