Abstract
Semiconductor pontos quânticos representam uma nova classe de fluoróforos com propriedades físicas e químicas únicas que poderiam permitir um alargamento notável das aplicações atuais de imagem fluorescente e diagnósticos ópticos. Complexos de pontos quânticos e anticorpos são promissores agentes visualizando para detecção fluorescente de biomarcadores seletivos sobre-expressos em tecidos tumorais. Aqui nós descrevemos a construção de complexos fluorescentes de auto-montagem de pontos quânticos e anticorpos anti-HER2 /neu scFv anti-HER1 ou e suas interações com células tumorais cultivadas. Uma estratégia de ligação com base em uma interacção não-covalente muito específica entre duas proteínas, a barnase e barstar, foi usado para ligar os pontos quânticos e os anticorpos dirigidos contra. Essa estratégia permite combinar as funções de segmentação e visualização simplesmente variando os módulos correspondentes do complexo fluorescente
Citation:. Zdobnova TA, Stremovskiy OA, Lebedenko PT, Deyev SM (2012) Auto-Montagem Complexos de Quantum Dots e anticorpos scFv para Cancer Cell Segmentação e de imagem. PLoS ONE 7 (10): e48248. doi: 10.1371 /journal.pone.0048248
editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de julho de 2012; Aceito: 21 de setembro de 2012; Publicação: 25 de outubro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Zdobnova et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Russa para Pesquisa básica (nos projetos. 12-04-00757-a, 11-04-12091-ofi-m-2011, e 10-04-01506), Presidium da Academia Russa de Ciências (Molecular Biologia Celular e Nanotecnologias . Nanomateriais) e do Ministério da Educação e Ciência da Federação Russa (nos projetos 16.740.11.0497, 14.740.11.0253, 16.512.11.2053 e 11.G 34. 31,0017). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Entre os principais métodos de visualização fluorescente de tumores é a única com base na detecção de biomarcadores seletivos sobre-expressos em tecidos tumorais que permite que revelam o tipo de tumor, processos metastáticos, tumor resistência aos medicamentos, etc. [1]. Os agentes de contraste utilizados para este fim são geralmente constituídas por duas partes, ou módulos:. Um módulo de visualização que é responsável pela detecção de alvo e um alvo uma que se liga selectivamente a um determinado tipo de célula
Na última década, semicondutores fluorescente nanocristais, referido como pontos quânticos (QD), têm atraído muita atenção como agentes de visualização para aplicações biológicas. Entre as propriedades mais vantajosas do QD são o brilho notável de fluorescência, fotoestabilidade, largura de excitação e os espectros de emissão estreito, e uma rica paleta de bandas de emissão espectralmente sintonizáveis, etc. Estas propriedades permitem rotulagem multicolor e a identificação simultânea de diversos objectos biológicos bem como a longo prazo bio-imagem [2].
como um módulo de segmentação, anticorpos scFv parecia ser mais promissor tanto para
in vitro Comprar e
in vivo para aplicativos [ ,,,0],3]. Os anticorpos scFv consistem de uma única cadeia de polipéptido de combinação de domínios variáveis leve de imunoglobulina e cadeias pesadas que estão ligados através de um ligante peptídico. Tais derivados de anticorpo podem ser produzidos em sistemas de expressão bacterianos como proteínas estáveis de retenção especificidade do antigénio de um anticorpo de comprimento completo, ainda que não possua o domínio Fc que é responsável pela função efectora de imunoglobulinas e é geralmente indesejável para o direccionamento in vivo aplicações.
neste trabalho, para detecção de anticorpos modelo (como um módulo de segmentação), escolhemos anti-tumor 425scFv [4] e 4D5scFv [5], que se ligam selectivamente a Marcadores oncológicos HER1 /EGFR e HER2 /neu, respectivamente. Estes Marcadores oncológicos são proteínas trans-membrana a partir da família dos receptores do factor de crescimento epidérmico que são sobre-expressos em muitas células tumorais e tem um grande significado diagnóstico e prognóstico [6]. Anteriormente, estes scFv foram utilizados com sucesso para entrega direccionada de proteínas fluorescentes e agentes terapêuticos para as células tumorais [7], [8], [9], [10].
Actualmente, existem duas abordagens de conjugação QD com agentes segmentação: conjugação directa e conjugação via moléculas adaptadoras. conjugação directa não é um método ideal porque os agentes de direccionamento são alterados durante o processo de conjugação. Por exemplo, anticorpos conjugados com QD retêm a sua especificidade antigénica, mas a sua afinidade pode diminuir significativamente. [11]. Além disso, a conjugação directa de QD para um anticorpo segmentação requer testar a actividade do anticorpo em cada caso particular
O uso de adaptadores de auto-montagem -. Pequeno e moléculas “pegajosas” e eficaz e que se ligam especificamente umas às outras sem formação de homodímeros, parece ser um método mais promissor de se ligar ao anticorpo para direccionamento QDs. Neste trabalho, apresentamos o sistema barnase-barstar (BBS) como uma ferramenta universal para a produção de complexos fluorescentes de selectividade diferente e parâmetros de fluorescência com base em anticorpos QDs e scFv para a visualização de células tumorais.
Materiais e Métodos
expressão bacteriana e purificação de proteínas recombinantes
O barstar mutante C40 /82A (aqui referida como barstar), do tipo selvagem barnase [7], [12], anti- recombinante HER2 /neu 4D5scFv e anticorpos anti-HER1 425scFv [13], bem como (4D5scFv proteína de fusão)
2-Bn [14] foram produzidos em
Escherichia coli
e purificada como descrito anteriormente [7].
o plasmídeo de expressão de proteína de fusão 425scFv-Bs foi calculado com base no plasmídeo PSD-4D5scFv-barstar [15] (
Figura 1
). manipulações de engenharia genética, cultura de células e lise celular foram realizadas de acordo com protocolos padrão. O fragmento de ADN que codifica a proteína 425scFv foi amplificado a partir de um plasmídeo pKM30425M1ChCl [4], utilizando iniciadores 5’GACTCGATATCGAAGTGCAACTGCAGCAGTC e 5’CTGTGGAATTCCCGTTTGATCTCCAGTTCTG. O produto de amplificação foi clonado no plasmídeo PSD-4D5scFv-barstar em vez do gene 4D5scFv usando EcoRV e EcoRI endonucleases de restrição. A resultante PSD-425-BS-A
6 construção foi verificada por sequenciação.
O 425scFv-Bs-His
6 construção começa com uma tag FLAG curta N-terminal (F, azul escuro ) seguido por 425scFv em V
H-ligante-V
L orientação (V
H, ciano; G, cinzento; V
L, turquesa), 16-amino-ácido dobradiça ligante (verde ), barstar (roxo). A construção termina com um Sua
6-tag (azul escuro) ligado ao terminal C da proteína de fusão 425scFv-barstar. O gene de fusão está sob controle do
lac
promotor.
OmpA
– o péptido de sinal para a secreção dirigida do proteína recombinante para o
E. coli
periplasma.
Para a produção de 425scFv-Bs contendo Sua
6-tag no
C
-terminus, o
Escherichia coli estirpe
BL21 foi transformada com PSD-425-B-His
6 e crescido em caldo de lisogenia (LB) a 28 ° C. A expressão 425scFv-B foi induzida por adição de IPTG 0,5 mM a uma densidade óptica
550 de 0,8. As bactérias foram então incubadas a 28 ° C durante 12 h. As células foram recolhidas, centrifugadas e o sedimento foi re-suspenso em tampão de lise (Tris-HCl 0,01 M, pH 8,3, com NaCl 0,1 M e EDTA 10 mM) e sonicado em gelo. O ligado foi então centrifugado a 22000 g durante 30 min a 4 ° C. O sedimento foi utilizado para a purificação de Sua
6-proteína marcadas no Ni
2 + -NTA coluna (Qiagen) sob condições desnaturantes de acordo com as instruções do fabricante. A proteína foi desnaturada com ureia a 8 M, renaturada, durante 5 h utilizando um gradiente linear de 8-0 M de ureia e eluida com imidazole 250 mM. Para a purificação final do 425scFv-B, fracções de eluição foram diluídas 20 vezes, aplicada sobre Q Sepharose FF de 1 ml de coluna (GE Healthcare) e eluída com um gradiente linear de 0 a 500 mM de NaCl.
de SDS /PAGE a análise de proteínas foi realizada de acordo com protocolos padrão, utilizando 14% (para a barnase e barstar) ou 12,5% (para as outras proteínas recombinantes) geles de poliacrilamida.
QD conjugação
QDs com emissão de fluorescência máxima a 565 ou 605 nm foram utilizados para a concepção do módulo de visualização. Carboxilo QDs revestidos por grupo (Qdot 565 ITK ™ pontos carboxilo quântica e Qdot 565 ITK ™ carboxilo pontos de quantum, Invitrogen) foram conjugados com qualquer uma das proteínas BBS usando EDC /NHS química de acoplamento. 2 uM QDs em MES 0,1 M (pH 6,0) e NaCl 0,5 M foram primeiro activada com EDC (~ 2 mM) e NHS (~ 5 M) à temperatura ambiente durante 15 min. A mistura de reacção foi aplicada sobre Sephadex G-25 e eluiu-se com um tampão contendo 40 mM de Na2B4O7 e KH2PO4 30 mM, pH 8,0. partículas seguida, eluiu activadas foram misturados com barstar barnase ou dissolvido no mesmo tampão e incubados durante 1 h à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi aplicada sobre Sephadex G-25 de coluna e as proteínas não ligadas foram eluídas com PBS (pH 7,4). Os QD: relações molares de proteína foram optimizados para cada proteína
electroforese em gel de agarose
Electroforese de QDs e QD-conjugados foi realizada utilizando gel de agarose a 1% em tampão TAE (50 mM de Tris-acetato. , 1 mM de EDTA, pH 7,6) a 10 V /cm durante 30 min. QDs foram diluídos em TAE e misturado com 6 × tampão de carga (50% de glicerol, 0,1% de azul de bromofenol) antes do carregamento para o gel. Os géis foram visualizados com o sistema Transilluminator multi Doc-It Digital Imaging.
Barstar ea atividade barnase ensaio
A atividade ribonuclease de barnase, (4D5scFv)
2-Bn e QD-Bn conjugados foi testada com o ensaio de ácido insolúvel ARN-precipitação descrito em [16], com a modificação de todos os volumes de solução de dimensionadas para baixo cinco vezes. A actividade da barstar, 425scFv-B, e conjugados QD-BS foi avaliada pela sua capacidade para inibir a actividade de ribonuclease de barnase. Barnase a uma concentração constante de 26 nM foi incubada com diluições em série de barstar, 425scFv-BS, ou QD-Bs conjugados. As soluções obtidas foram então usados no ensaio de Rushizky [16].
A avaliação da afinidade do anticorpo
Medições de uma constante foram realizados usando instrumentos de dissociação BIAcore (BIAcore 3000). p185 recombinantes
HER2-ECD ou domínio extracelular do EGFR (Sino Biological, Inc.) foi acoplado num chip CM5 a uma densidade de 4500 RU de química de acoplamento de amina padrão. Todas as proteínas foram usadas em quatro concentrações (1 uM, 330 nM, 110 nM e 37 nM) em HBS-EP (HEPES 0,1 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,005% de Tween-20). Os sensograms foram obtidos a uma taxa de fluxo de 5 ul /min a 25 ° C. A fase de dissociação durou 20 min.
As culturas de células
O adenocarcinoma de ovário humano SKOV-3 (HTB-77, ATCC), epidermóide humano carcinoma A431 (CLR-1555), e de hamster chinês células (Russo celular Cultura Collection) CHO ovário foram cultivadas em meio de McCoy 5A (por SKOV-3) ou RPMI-1640 (para A431 e CHO) com 10% (v /v) de soro fetal de vitela (Hyclone) e 2 mM de
L
-glutamina. As células foram cultivadas em 5% de CO
2 a 37 ° C.
rotulagem celular e imagiologia
Para /imagens de células HER2-neu dirigida, as células SKOV-3 que sobre-expressam HER2 /neu eram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 2 × 10
4 células por poço e cultivadas durante a noite. As células foram lavadas duas vezes com PBS (pH 7,4) antes da coloração. Todas as proteínas e os conjugados QD foram dissolvidos em PBS (pH 7,4). Após uma breve lavagem com PBS frio, as células foram subsequentemente incubadas com a (4D5scFv)
2-Bn direccionamento da proteína a uma concentração final de 30 nM e, em seguida, com 80 nM QD
605-B ou QD
565-B conjuga durante 40 min a 4 ° C. Depois de cada passo de incubação, as células foram lavadas três vezes com PBS frio (pH 7,4). Os resultados da marcação celular foram analisadas com um microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200 (Zeiss, Alemanha). As imagens foram obtidas utilizando uma câmara CCD (AxioCamHRc, Zeiss, Alemanha) e software AxioVision (Zeiss, Alemanha).
imagens de células-HER1 dirigido foi realizada de forma semelhante, usando células A431 que sobre-expressam HER1-, 425scFv-Bs módulo de segmentação e QD
605-BN ou QD
565-BN módulos visualizando.
a citometria de fluxo análise
Para citometria de fluxo, as células foram semeadas em 6-poços placas (Corning) a uma densidade de 4 x 10
3 células por poço e cultivadas durante a noite. As células foram coradas como descrito acima. As células coradas foram separadas com PBS (pH 7,4) contendo EDTA 5 mM e centrifugadas. O pelete foi re-suspenso em 1 ml de PBS (pH 7,4) contendo 0,1% de azida de sódio. intensidade de fluorescência associada às células foi medida usando um citómetro de fluxo FACS Calibur (BD Bioscience) com um comprimento de onda de excitação de 488 nm (laser de árgon). A fluorescência foi analisada de, pelo menos, 10.000 células por amostra. autofluorescência celular foi estimada utilizando células tratadas com PBS como controle.
In vitro
análise de citotoxicidade
A citotoxicidade de QDs utilizados, seus conjugados e complexos na linha celular foi avaliada através de ensaio de microtitulação. As células SKOV-3 foram semeadas a uma densidade de 4 x 10
3 células por poço numa placa de 96 poços, e foram deixadas a ligar durante a noite. Em seguida, as células foram incubadas com PBS (pH 7,4) contendo diferentes concentrações de sondas QD a 4 ° C durante 1 h. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com PBS frio (pH 7,4) e cultivadas durante 48 horas em condições do standart. Após 48 h, a viabilidade celular foi estimada pelo ensaio de MTT do standart tal como descrito em [9]. A viabilidade celular foi expressa em percentagem da densidade óptica de células não tratadas a partir de duas experiências realizadas em triplicado
Resultados
Estratégia geral:. Sistema barnase-barstar
nosso trabalho anterior, o sistema barnase-barstar (BBS) foi inicialmente desenvolvido para [15], [17] anticorpo multimerização. O barnase ribonuclease bacteriana de
Bacillus amyloliquefaciens
e sua barstar inibidor natural são pequenas proteínas (12 e 10 kDa, respectivamente), com extremamente elevada afinidade de ligação (K
d~10
-14 M) [18], o que é comparável com a afinidade da interacção biotina-estreptavidina [19]. Aqui utilizámos estas proteínas como adaptadores moleculares para se obter uma série de complexos fluorescentes de auto-montagem com base em pontos quânticos com especificidade anti-tumor diferente, e cor (
Tabela 1
). As sondas são compostas de um módulo de visualização, ou seja, QDs conjugado com uma das proteínas de BBS (quer barstar ou barnase), e um módulo de segmentação, isto é, anticorpos anti-tumor fundido com a proteína BBS parceiro (quer barnase ou barstar, respectivamente ) (
figura 2A
). Os módulos de visualização e de segmentação resultantes podem ser combinados de maneiras diferentes, dependendo da especificidade molecular e as propriedades ópticas necessárias para uma tarefa particular, bioimaging (
figura 2B
).
A ligação de anticorpos scFv a QDs através adaptadores moleculares barnase-barstar (a) e construtor molecular baseado em BBS composto de um conjunto de fluorescing variável e segmentação módulos (B) são mostrados
segmentação módulo:. construção e caracterização de reconhecimento proteínas
anticorpos
anti-HER1 425scFv e anti-HER2 4D5scFv foram utilizados como moléculas de direccionamento para entrega dirigida de QDs para células tumorais. Obteve-se um número de proteínas de fusão e 425scFv 4D5scFv com barnase ou barstar em combinações diferentes. Duas proteínas de fusão com os rendimentos mais elevados de expressão foram escolhidos como os módulos de segmentação para entrega QDs: monovalente 425scFv fundido a barstar (425scFv-Bs) e bivalente 4D5scFv fundido a barnase ((4D5scFv)
2-Bn)
proteínas de fusão de segmentação foram produzidos em
E. coli
e purificada conforme descrito em Materiais e Métodos. As proteínas foram obtidos de o peso molecular esperado e homogeneidade de acordo com SDS-PAGE (
figura 3A). A constante de dissociação do (4D5scFv)
2-Bn purificados a partir do p185
HER2-ECD foi ~2.2 nM. Este valor está de acordo com a do anticorpo parental 4D5scFv (~5.2 nM). A actividade enzimática do preparado (4D5scFv)
2-Bn avaliada por ensaio de ARN precipitação ácida insolúvel em [16] era ~ 8% da actividade de barnase nativa (
figura 3B
). Para comparação, a actividade de barnase fundido com diferentes proteínas foi relatado como sendo -75% para cada molécula de enzima em proteínas 4D5scFv-dibarnase [7] e ~ 80% para a barnase fundido a exotoxina A de
Pseudomonas aeruginosa
[20]. Presumivelmente, a fusão de duas moléculas de anticorpo de barnase resulta em efeito impedimento estérico e diminuição concomitante da actividade de RNAse.
(a) 12%, confirmando a purificação de (4D5scFv) SDS-PAGE
2-Bn ( um, 71 kDa) e 425scFv-Bs (a ‘, 40 kDa), Coomassie Brillian Blue R-25 gel corado; marcador de proteína padrão (M) e as pistas da proteína de fusão (P) são mostrados. (B) de actividade de RNAse (4D5scFv)
2-Bn (linha a cheio) em comparação com a actividade de barnase livres (linha a tracejado) e avaliadas com ensaio de ARN-precipitação ácida insolúvel. (C) Inibição da barnase livre por 425scFv-Bs (linha sólida), em comparação com a inibição pelo barstar livre (linha pontilhada).
A constante de dissociação do (4D5scFv)
2-Bn de a EGFR purificado foi de ~ 2 uM. O padrão de inibição barnase pela 425scFv-Bs foi semelhante ao de barstar livre (
Figura 3C
). Assim, a porção barstar de proteína de fusão 425scFv-Bs manteve a sua funcionalidade
Visualizando módulos fluorescentes:. Conjugação de QDs com as proteínas BBS
Os seguintes conjugados QD com as proteínas BBS foram obtidos para posterior usar como visualizar módulos fluorescentes: QD
605-Bs, QD
605-Bn, QD
565-Bs, e QD
565-Bn. Os QDs para ser usado em combinação com segmentação módulo contendo barnase ((4D5scFv)
2-Bn) foram conjugados com barstar, enquanto que aqueles para ser usado com o módulo contendo barstar (425scFv-B) foram conjugados com barnase. Barnase e barstar foram conjugados com QDs usando EDC /NHS química de acoplamento. No decurso da reacção, os grupos carboxilo activados na superfície de QDs reagir com grupos e-amino dos resíduos de lisina da proteína, bem como grupo α-amino do resíduo N-terminal, resultando na formação de ligações amida estáveis.
a eficiência da etapa de conjugação foi verificada por eletroforese em gel de agarose (
Figura 4a
). Sob as condições exploradas na configuração electroforese (pH 7,6), QDs não conjugados são carregados negativamente, e portanto migrar do cátodo para o ânodo (
figura 4A
,
pista 1, 4
). Após a adição das proteínas BBS a suspensão QD, a mobilidade electroforética das nanopartículas parecem ser afectados de formas diferentes, dependendo da proteína adicionada. O padrão de migração da mistura de QDs e barstar carregado negativamente (pI 4,6) é semelhante ao de QDs livres (
figura 4A
,
pista 2) .Em contraste, a adição de positivamente barnase cobrado (pI 9,8) que podem ligar-se a QDs, devido à atração eletrostática resultou em um padrão de migração manchada (
Figura 4a
, pista 5).
(a) a mobilidade eletroforética de QDs e QD -conjugates em gel de agarose a 1%, em tampão Tris-acetato-EDTA (pH 7,4). QDs executados a partir do cátodo (-) de ânodo (+). Lanes: 1 – QD
605, 2 – mistura de QD
605 e barstar (sem EDC), 3 – QD
605-Bs conjugado, 4- QD
565, 5 -Mistura de QD
565 e barnase (sem EDC), 6 – QD
565-Bn conjugado. (B) espectros de fluorescência normalizada de QD
565 (linha azul), QD
605 (linha violeta) e seus conjugados, QD
565-Bn (linha verde) e QD
605-Bs ( linha Vermelha). (C) A atividade ribonuclease de QD
605-Bn (linha vermelha e círculos) e barnase livre inibição da atividade RNAse de QD
605-B (linha azul e quadrado). QD
605 (linha verde) não afetam a atividade ribonuclease de barnase.
covalente conjugação de QDs com as proteínas BBS usando EDC reticulador resultou em alteração significativa dos padrões de migração. conjugados QD-Bs exibiram menor mobilidade do que QDs iniciais ou a mistura de QDs e barstar livre, indicando funcionalização sucesso da superfície do QD (
Figura 4a
, a pista 3
). conjugados QD-Bn mal deixar os poços do gel de agarose, presumivelmente devido à neutralização da carga negativa do QD mediante a conjugação com barnase (
Figura 4a
, pista 6
) .Nós também testou proteínas QDs eo BBS para a retenção de suas propriedades dentro dos conjugados. medidas de espectroscopia de fluorescência demonstrou que o espectro de emissão, bem como rendimentos quânticos de fluorescência QD após conjugação de barnase ou barstar manteve-se praticamente inalterada (
Figura 4B
). O ensaio de ARN precipitação insolúvel em ácido-[16] indica que os conjugados de QD-BN retêm as propriedades funcionais da barnase, ou seja, a actividade de ribonuclease, e conjugados QD-BS reter capacidade e actividade de inibição da barnase de ligação de barnase (
figura 4C
).
imagens de células vivas
HER1- e linhas celulares de cancro HER2-superexpressão, incluindo epidermoide A431 humano (3 × 10
6 receptores HER1 /célula [21]) e células de carcinoma do ovário humano SKOV-3 (2,6 x 10
5 HER2 /neu receptores /célula [22]), foram escolhidas para testar coloração específica das células tumorais com os complexos fluorescentes de auto-montagem. HER1- e HER2 /células de ovário de hamster chinês-neu negativo (CHO) foram utilizados como controlos.
Um dos principais problemas para a imagiologia celular com QDs é que QD sondas tendem a ser “pegajosos”, e muitas vezes ligam-se de forma não específica a membrana da célula, proteínas, e matriz extracelular [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29]. A ligação não-específica depende de propriedades de superfície de QD e as linhas celulares utilizadas. Avaliou-se a não específica propriedades dos QDs carboxilados iniciais utilizados para a construção da sonda fluorescente de ligação. Como mostrado na
Figura 5
(
Aa e B – A linha verde
), considerável ligação não-específica é observado com QD
605 incubadas com células SKOV-3, as células A431 e em CHO 4 ° C. Atribuímos o nível de ligação não específica de interacções electrostáticas dos QDs carregados negativamente com a superfície da célula. Por conseguinte, para a coloração e dirigida específica de células tumorais com QDs é necessário não só para assegurar a orientação correcta do oncomarker de interesse, mas também para diminuir a ligação não específica de QDs. Para reduzir a ligação não específica, QDs são frequentemente modificados com poli (etileno glicol) (PEG), um polímero hidrofílico rotineiramente utilizados para esses fins em aplicações biológicas. Mas, no presente trabalho a necessidade de PEGilação pode ser evitado. Surpreendentemente, verificou-se que a conjugação QD para ambos o BBS proteínas – barnase e barstar – diminui a ligação não específica de QDs a superfície da célula. Quando as células foram incubadas com QD
605-B ou QD
605-Bn, a 4 ° C, fraco ou nenhum sinal fluorescente foi detectado na superfície das células, indicando que as QDs conjugados com proteínas têm BBS não negligenciável a ligação específica (
Figura 5
, Ab e da linha B-laranja para o QD
605-Bs ou linha amarela para QD
605-Bn
). Resultados semelhantes foram obtidos para QD
565 e seus conjugados. Assim, a utilização das proteínas BBS permitiu não só a ligação de anticorpos QDs com segmentação, mas também reduzir a ligação não específica de QDs a superfície da célula.
(A) A microscopia óptica de células A431 HER1overexpressing que foram pré-incubadas com QD
605 (a), QD
605-Bn (b), 425scFv-Bs e QD
605-Bn (c). As células CHO HER1-negativos foram utilizados como controle para coloração com
605-Bn (d) 425-Bs e QD. Como teste de ligação competitiva controle adicional de livre 425scFv e anti-HER1 425scFv-Bs /QD complexo
605-Bn foi realizada (e). linha esquerda, imagem de campo brilhante; linha direita, imagem de fluorescência com 488 nm de excitação e 605 nm picos de emissão. (B) A citometria de fluxo de células SKOV-3, A431 $ \\ raster (70%) = “RG1” $ As células CHO incubadas com QD
605 (linha verde), QD
605-Bn (linha amarela), QD
605-B (linha laranja), (4D5scFv)
2-Bn e QD
605-B (linha vermelha), 425scFv-Bsand QD
605-Bn (linha azul).
O ‘rotulagem específica armament’of conjugados proteicos QD-BBS com segmentação anticorpos permitido e imagiologia de células tumorais. A estratégia geral para a rotulagem de células tumorais específicas por fluorescentes QD-scFv complexo de auto-montagem com base no sistema BBS é ilustrado no
Figura 6
(à esquerda)
. As células tumorais foram pré-incubados com proteína de fusão de segmentação e em seguida corados com conjugados de proteína-QD BBS. Visualizando módulo foi ligado ao módulo de segmentação associada às células por meio da interacção de barnase-barstar. Assim, o QD
605-BN conjugados eficazmente HER1 coradas na superfície de células A431 depois as células foram incubadas com o 425scFv-Bs segmentação proteína (
Figura 5
, Ac
) . Da mesma forma, SKOV-3 células com superexpressão de HER2 /neu foram fotografadas por tratamento sequencial com (4D5scFv)
2-Bn e QD
605-Bs. Os controlos com células CHO HER1- e HER2 /neu-negativos não apresentaram coloração, indicando a especificidade de ligação dos complexos de auto-montagem segmentados. Além disso, quando as células A431 foram tratadas com complexo fluorescente e 425scFv livre (razão molar 01:02), a ligação do complexo à membrana celular foi completamente bloqueada (
Figura 5
anti-HER1, Ae
). Resultados análogos foram obtidos utilizando Skov-3 células, anti-HER2 complexo /neu e livre 4D5scFv.
Legends como na figura 1.
O uso de QD
565- módulo bs torna possível a realização de imagens de células na região espectral verde. Assim, os complexos de QD-scFv com especificidades anti-tumorais desejadas e espectros de fluorescência foram obtidas por combinação de visualização e segmentação módulos (Tabela 1).
Além disso, as células tumorais foram fotografadas com sucesso através de um método de um só passo usando pré-montado complexos QD-scFv. Neste caso, o módulo de segmentação (425scFv-B ou (4D5scFv)
2-Bn) e o módulo de visualização (Bn-QD ou BS-QD, respectivamente) foram pré-misturados para a formação do complexo seguido por incubação das células tumorais com os complexos resultantes. (
Figura 6
).
Apesar de QDs são agente de visualização única em termos da sua photophysical e propriedades químicas, a sua implantação em aplicações biomédicas são ainda muito debatido devido à sua citotoxicidade potencial. Foram realizadas algumas experiências preliminares, a fim de estimar a citotoxicidade dos dotes quânticos utilizados e os seus conjugados e complexos. testes de citotoxicidade não demonstrou qualquer influência significativa da QD
605 e QD
565 (bem como os seus derivados) sobre a sobrevivência de células SKOV-3 (
figura 7
). Estes resultados correspondem bem com os dados publicados anteriormente que demonstra que quantum dots revestidas com material de cobertura polimérica em concentrações requeridas para a visualização dos receptores de superfície específicos mostram nenhuma influência sobre a sobrevivência de culturas de células [30].
Relativamente a viabilidade celular de SKOV -3 células após tratamento com QDs iniciais (linha vermelha), seus conjugados com barstar (linha azul) e seu complexo com 4D5scFv (linha laranja) são mostrados.
Discussão
A propriedades físicas e químicas excepcionais de QDs permitir multicolor e de imagem de longo prazo, aumentando assim substancialmente os actuais métodos de imagem fluorescente de células cancerígenas e profiling multiplex de marcadores tumorais moleculares [2].
O HER1 e HER2 /neu marcadores oncológicos, os membros da família do receptor do factor de crescimento epidérmico, desempenham um papel essencial na génese e progressão de certos tipos de tumores, incluindo os do endométrio, ovário, mama, próstata e pulmão, e são marcadores clinicamente significativas tumorais [6].
p> para a entrega selectiva para células de tumor que sobre-expressam os marcadores de interesse, QDs precisa ser funcionalizado com moléculas de direccionamento. Os anticorpos monoclonais contra HER1 [31] e HER2 [31], [32], [33], [34], [35], bem como o EGF, o ligando natural de HER1 [36], [37], [38], têm sido utilizados com sucesso como porções de direccionamento para a criação de agentes de contraste anti-tumor com base em QDs. No entanto, os anticorpos de comprimento completo são relativamente grandes, de modo que o número de anticorpos que podem ser ligadas à superfície de QDs é limitada e a distribuição intra-tumoral das nanopartículas é impedida, o que restringe a utilização de anticorpos de comprimento completo como QD segmentação agentes. O scFv parecem ser mais vantajosa para a geração de sondas alvo QD-neu ou HER2 HER1- /, que sejam menores do que os anticorpos de comprimento completo, mas retêm a especificidade de antigénio e de alta afinidade binging de anticorpos parentais. Outras vantagens dos anticorpos scFv como segmentação módulos incluem a relativa simplicidade da sua produção em bactérias, baixa imunogenicidade, e falta da função efectora do anticorpo [17].
Estudos anteriores revelaram a viabilidade de ensaios in vitro e in vivo imagiologia de células tumorais utilizando nanopartículas conjugados com anticorpos scFv segmentação HER1 [38] ou HER2 /neu [39].
O uso de adaptadores de auto-montagem (moléculas pequenas “pegajosos” que se ligam um ao outro com elevada eficiência e especificidade, mas não formam homodímeros) é uma abordagem mais promissora para a ligação de conjugação directa QD-anticorpo. A formação de complexos envolvendo essas moléculas não tem efeito considerável sobre a afinidade do anticorpo e permite a fácil preparação de diversas combinações de anticorpos com diferentes especificidades e QDs com vários espectros de fluorescência.
Neste estudo, utilizou-se o sistema baseado em uma interacção muito específica e forte não-covalente (ou seja electrostática) entre duas proteínas, a barnase e barstar, como adaptadores moleculares de auto-montagem. A afinidade de ligação de barnase e barstar é comparável ao do (estrept) do sistema avidina-biotina, o mais forte conhecido entre biomoléculas.
BBS foi escolhido por causa de várias propriedades notáveis essenciais para a concepção de módulos de segmentação . (I) A biotina não é um péptido, a sua fixação às proteínas, v.g. anticorpos, por métodos de engenharia genética não é possível. ligação química é caótico, geralmente não específica em termos de cinemática e muitas vezes requer sofisticada separação pós-modificação de componentes. Por contraste, ambos os componentes de BBS são geneticamente codificados, que permite a criação de módulos de segmentação como proteínas de fusão codificada por um único gene expresso em sistemas bacterianos [15] .Barnase e barstar são de carga oposta e assim permitem escolher o mais adequado BBS proteína para cada anticorpo utilizado para a construção de direccionamento módulos. Isso ajuda a evitar as complicações associadas com o isolamento de proteínas, por exemplo, “colagem” mútua dos domínios da proteína recombinante obtida. Além disso, a barnase como um constituinte de proteínas recombinantes pode agir como uma chaperona molecular garantir a sua correcta dobragem [40]. (Ii) Nenhuma das proteínas BBS tem análogos em mamíferos, o que diminui o fundo não específico quando este sistema é utilizado
in vivo
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