Abstract

Cancro células-tronco-like (CSCs) /células iniciadoras de câncer (CICs) são definidos como uma pequena população de células cancerosas que têm alto tumorigenicidade. Além disso, CSCs /CICs são resistentes a várias terapias contra o câncer, e CSCs /CICs são, portanto, pensado para ser responsável pela recorrência do câncer após o tratamento e metástases à distância. Em casos epiteliais de cancro do ovário (EOC), a recorrência da doença após a quimioterapia é frequentemente observada, sugerindo CSCs ovarianos /CICs estão envolvidos. Existem quatro principais subtipos histológicos em EOC, e adenocarcinoma seroso e adenocarcinoma de células claras são neoplasias malignas de alto grau. Nós, portanto, analisados ​​ovarianos CSCs /CICs de linhas celulares de carcinoma do ovário (adenocarcinoma seroso e adenocarcinoma de células claras) e células de cancro do ovário primário neste estudo. Nós isolado ovarianos CSCs /CICs como um aldeído desidrogenase 1 elevada (ALDH1

alto) da população a partir de 6 linhas EOC celulares (3 adenocarcinomas serosa e 3 adenocarcinomas de células claras) pelo ensaio ALDEFLUOR. ALDH1

células de alta apresentou maior capacidade de formação de esfera, maior tumorigenicidade e maior capacidade invasiva, indicando que CSCs ovarianos /CICs são enriquecidas em ALDH1

células de alta. ALDH1

de células de alta poderia também ser isolado a partir de 8 de 11 amostras de carcinoma do ovário primárias. coloração imuno-histoquímica revelou que mais elevados níveis de expressão ALDH1 em casos de câncer de ovário estão relacionados com pior prognóstico em ambos os casos de adenocarcinoma seroso e casos de adenocarcinoma de células claras. Tomados em conjunto, os resultados indicam que ALDH1 é um marcador para CSCs ovarianos /CIC e que o nível de expressão pode ser ALDH1 um biomarcador novo para a predição de mau prognóstico

citação:. Kuroda t, Hirohashi Y, T Torigoe , K Yasuda, Takahashi A, Asanuma H, et al. As células do ovário (2013) ALDH1 de alta-tronco-Como o câncer pode ser isolado de células de células de adenocarcinoma serosa e claras, e ALDH1 alta expressão é associada com mau prognóstico. PLoS ONE 8 (6): e65158. doi: 10.1371 /journal.pone.0065158

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 08 de fevereiro de 2013; Aceito: 22 de abril de 2013; Publicação: 06 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kuroda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid para a Investigação científica do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (números de subvenção 16209013, 17016061 e 15659097) de Investigação Aplicação prática da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão, e para o cancro Investigação (15-17 e 19-14) do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar do Japão, Cancer Research Fund Ono (a NS) e Takeda Science Foundation (para YH). Este trabalho foi financiado em parte pelo Fundo de Investigação e Desenvolvimento Cancer Center Nacional (23-A-44). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é uma doença maligna com alta mortalidade e é a quarta causa mais comum de morte por câncer em mulheres em todo o mundo. [1], [2] sintomas obscuros e pouco claras tornar a detecção de câncer de ovário em estágio inicial difícil. [3] Em geral, o cancro do ovário é relativamente sensível a quimioterapia de primeira linha com base em platina /taxano. [4] resposta clínica completa (CR) muitas vezes pode ser alcançado por cirurgia cytoreductive e quimioterapia em pacientes com câncer de ovário avançado; No entanto, a maioria dos doentes com estádio avançado têm a recorrência da doença, que é a razão da elevada taxa de mortalidade desta doença. [5] Alguns candidatos terapêuticos das drogas alvo molecular para o câncer de ovário tinham sido testados, mas notáveis ​​melhorias no prognóstico não foram atingidos. [2], [6].

O progresso recente na pesquisa do câncer revelou que os cancros são compostas de uma população heterogênea de células e que apenas uma pequena população de células chamado de câncer de células estaminais-like (CSCs) /câncer células -initiating (CICs) têm potencial (hipótese de haste do cancro de células) de alta iniciando tumor. CSCs /AIC são definidos como uma pequena população de células que possuem (1) tumorigenicidade elevada, (2) capacidade múltipla diferenciação e (3) capacidade de auto-renovação. [7] – [9] Os resultados do estudo recente também demonstraram que os CSCs /AIC estão relacionados com a recorrência do cancro e resistência à radiação ou quimioterapia. [10], [11] Portanto, CSCs /CICs são pensados ​​para ser responsável pela recorrência do câncer e metástases à distância, e eliminação de CSCs /CICs é, portanto, indispensável para a cura do câncer.

Existem várias abordagens para identificar CSCs /AIC de cancros em uma variedade de tecidos de órgãos. [12] Estas abordagens incluem (1) a utilização de marcadores de superfície celular, tais como CD44

+ CD24

– /lowESA

+ [13], CD133

+ [14], CD44

+ CD117

+ [15], e CD166

+ [16], (2) população lateral (SP) de ensaio [17], em que a população de células que tem a capacidade de bombear para fora uma droga (Hoechst33342 [18 ] ou de um corante violeta Ciclo [19]) por meio do transportador de cassete de ligação de ATP é considerada como CSCs /AIC, e (3) ensaio ALDEFLUOR com base no nível de aldeído desidrogenase 1 () actividade da enzima ALDH1. [20].

A função de ALDH intracelular é o de catalisar a oxidação do aldeído, e, por conseguinte, a ALDH desempenha um papel importante na homeostase celular. Estudos recentes revelaram que ambas as células normais e cancerosas com níveis elevados de actividade ALDH1 têm o potencial para funcionar como células estaminais e o potencial de capacidade de auto-renovação e propriedades de resistência ao stress. [20] – [22].

Também em câncer epitelial de ovário (EOC), algumas pesquisas têm sugerido a utilidade da atividade ALDH1 para identificar CSCs /CICs. A existência de células com elevada actividade de ALDH (ALDH1high células, em comparação com células ALDH1low) também foi demonstrado em linhas de células de EOC e em amostras clínicas. [23] – [25] A correlação entre a atividade ALDH1 e prognóstico dos pacientes, no entanto, ainda é controversa na EOC. [26] Ao mesmo tempo, a relevância para a expressão ALDH1 para cada subtipo histológico de EOC ainda não foi esclarecida.

Neste estudo, identificamos e avaliamos a stemness de ALDH1

células de alta em serosa adenocarcinoma e adenocarcinoma de células claras do ovário, não só a partir de linhas celulares estabelecidas, mas também a partir de células de cancro do ovário primários. Nós também analisados ​​estatisticamente a associação entre a expressão ALDH1 e evolução clínica de pacientes com câncer ovariano.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Os ratos foram mantidos e experiências com de acordo com a diretrizes de e após aprovação pela Comissão de Sapporo Medical University School of Medicine, Experimentação animal Center sob licença número 08-006. Qualquer animal encontrado pouco saudável ou doente foi prontamente sacrificados. Todos os estudos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Hospital Universitário Sapporo Medical e do IRB de Hakodate Goryokaku Hospital. O consentimento informado escrito foi obtido de todos os pacientes de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinki.

linhas de células e condições de cultura

Neste estudo, 3 linhas celulares de adenocarcinoma seroso do ovário (AMOC-2, HUOA e foram usadas OVCAR-3) e 3 linhas de ovário claras célula de adenocarcinoma de células (ES-2, RMG-1 e TOV21G). AMOC-2 (gentilmente cedido pelo Dr. Yabushita do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, Aichi- Medical University, Aichi, Japão) [27], HUOA (gentilmente cedido pelo Dr. Ishiwata, Obstetrícia e Hospital Ginecológico, Ibaraki, Japão) [28 ], OVCAR-3 e TOV-21G (ATCC, Manassas, VA, EUA) foram cultivadas em RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). células ES-2 (ATCC) foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich). células RMG-1 (JCRB Cell Bank, Osaka, Japão) foram cultivadas em DMEM /F-12 (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA). Cada meio foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). As células foram incubadas em um umidificado CO 5%

2 incubadora a 37 ° C.

O isolamento de células de câncer primário de espécimes clínicos

Todos os estudos foram aprovados pelos Conselhos de Revisão Institucional (IRB) do Hospital Universitário de Sapporo Medical eo IRB de Hakodate Goryokaku Hospital. O consentimento informado escrito foi obtido de todos os pacientes de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinki.

Os tumores sólidos foram cortadas em fragmentos, lavadas em tampão fosfato salino (PBS), e centrifugado a 2000 rpm durante 10 minutos. Em seguida, os agregados de células foram incubadas a 37 ° C durante cerca de 30 min, com 2 mg de grau de investigação ™ Liberase (Roche, Basileia, Suíça) em 10 ml de Iscove modificado por Dulbecco Médio (IMDM, Life Technologies) até separados em células individuais. As células obtidas por estes procedimentos foram analisadas por citometria de fluxo, tal como descrito abaixo.

Ensaio celular ALDEFLUOR e Isolamento por Fluorescência-activada (FACS)

Foi utilizado um kit de ensaio de ALDEFLUOR (Stem Cell Technologies ™, Vancouver, BC, Canadá) para determinar a actividade ALDH1 de células de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram suspensas em tampão de ensaio contendo ALDEFLUOR 1 umol /l por 1×10

6 células do substrato de ALDH, boro-dipirrometeno-aminoacetaldeído (BAAA), e incubadas durante 50 min a 37 ° C. Cada amostra foi tratada com 50 mmol /L de um inibidor específico da ALDH, dietilaminobenzaldeído (DEAB), como um controlo negativo. As células coradas foram analisadas por BD FACSAria ™ II (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). As células foram coradas com 1 ug /ml de iodeto de propídio para avaliar a sua viabilidade antes da análise.

Para o isolamento de células epiteliais de cancro do ovário a partir de amostras sólidas, que as células cancerosas epiteliais classificados utilizando anticorpos anti-CD326 (Ep-CAM) anticorpo APC (BD Biosciences). Usamos microesferas anti-CD326 (BD Biosciences) e um sistema de autoMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) para enriquecer as células epiteliais de ascite maligna de casos de cancro do ovário antes do ensaio ALDEFLUOR.

análise do ciclo celular e

in vitro

celular crescer Análise

ALDH1

células de alta e ALDH1

baixas foram diretamente fixada com etanol a 70%, após triagem. Em seguida, elas foram ressuspensas em PBS contendo 250 ug /ml de RNase A (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a 37 ° C e coradas com /mL de iodeto de propídio 50 ug durante 10 minutos a 4 ° C no escuro. As células coradas foram analisadas com um FACSCalibur (BD Biosciences), e os dados foram analisados ​​usando o programa de análise do ciclo celular Mod-Fit.

Para

in vitro

ensaio de crescimento celular, ALDH1

células de alta e ALDH1

células isoladas a partir de baixo AMOC-2 e células RMG-1 foram semeadas numa placa de 6 cavidades, com 5 x 10

4 células por poço. Após incubação durante 48 e 96 horas, as células foram removidas por tripsina e o número de células viáveis ​​foram determinadas utilizando Countess® (Life Technologies).

-Esfera formando Ensaio /única célula-Esfera formando Ensaio

ALDH1

células de baixa e de alta ALDH1

foram isolados por FACS e em seguida, cultivadas em pratos de 6 poços superfície de fixação ultra-baixo (Corning, Tewksbury, MA, EUA) a 1000 células por poço. Para o ensaio de células formadoras de esfera única, tanto ALDH1

alto e ALDH1

baixo foram classificados em 96-bem pratos de fixação ultra-baixas (Corning) em uma única célula por poço. As células foram cultivadas em meio de células-tronco, DMEM isento de soro /F12 (Life Technologies) suplementado com N-2 suplemento (Life Technologies), 20 mg /factor humano recombinante ml epitelial crescimento (Life Technologies), 10 mg /mL humano factor de crescimento de fibroblastos básico (Sigma-Aldrich), 4 ug /ml de heparina (Sigma-Aldrich), 4 mg /ml de albumina de soro de bovino (Life Technologies), 20 g /ml de insulina humana, solução de zinco (Life technologies), e 2,9 mg /ml de glucose (Sigma-Aldrich). [29] alteração morfológica foi observada diariamente sob um microscópio de luz durante 14 dias.

In vivo

tumorigenicidade

Ordenado ALDH1

células de baixa altura e ALDH1 foram ressuspensas a 1,0 x 10

2, 1,0 × 10

3 e 1,0 × mistura 10

4 células em 100 ul de PBS e Matrigel (BD Biosciences) (1: 1). Em seguida, cada mistura foi injectada por via subcutânea na direita /esquerda do meio para trás áreas de /-deficiência imunológica diabéticos não obesos do sexo feminino grave combinada (SCID NOD /) ratos 6 semanas de idade (NOD.CB17-Prdkcscid /J, Charles River Laboratory, Yokohama, Japão), sob anestesia inalatória pelo isoflurano. iniciação e progressão do tumor foi observada por semana até os ratinhos foram sacrificados às 7 semanas após a injecção. volume do tumor externa foi calculada como 0,5 × Dmax × (Dmin)

2 [mm

3] (Dmax: eixo longo, Dmin: eixo curto da massa).

imuno-coloração para tecido de câncer de ovário

coloração imuno-histoquímica de ALDH1 e Ki-67 foi realizada com secções fixadas em formalina, embebidos em parafina de 123 tecidos epiteliais do cancro do ovário (62 adenocarcinomas serosa, 37 adenocarcinomas de células claras, 18 adenocarcinomas endometrióides e 6 adenocarcinomas mucinosos) como descrito anteriormente. [30] [31] Antigénio de recuperação foi realizado por secções em ebulição de 120 ° C durante 5 minutos num forno de microondas em Citrato de pré-aquecida de 0,01 mol /L de sódio (pH 6,0). A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada por peróxido de hidrogénio a 3% em etanol durante 10 min. Após o bloqueio com leite seco a 1% não gordo em PBS (pH 7,4), fizeram-se reagir as secções com o anticorpo de ratinho anti-ALDH1 monoclonal (1: 250, Sigma-Aldrich) ou rato de anticorpo monoclonal anti-Ki-67 (1: 100 , DAKO, Glostrup, Dinamarca) durante 1 hora seguida por incubação com biotinilado anti-IgG de ratinho (Nichirei) durante 30 min. Subsequentemente, as secções foram coradas com um complexo de biotina-setreptavidin (Nichirei Biosciences, Tóquio, Japão), seguido por incubação com 3,3′-diaminobenzidina como um cromogénio utilizado e a contra-coloração com hematoxilina. coloração citoplasmática foi considerado como positivo para ALDH1 e núcleos de coloração foram considerados positivos para Ki-67. Para a avaliação da coloração ALDH1, os casos foram divididos em dois grupos (ALDH1

alta do grupo e ALDH1

baixo grupo) por medianas (medianas para adenocarcinoma seroso a mediana e adenocarcinoma de células claras sendo 20% e 15%, respectivamente) .

Matrigel Invasion Ensaio

A capacidade invasiva das células foi avaliada utilizando câmaras de matrigel invasão (BD Biosciences). Isoladas ALDH1

altos e ALDH1

células de baixa (1,0 × 10

4) foram semeadas em cada câmara superior em DMEM isento de soro. As câmaras exteriores foram cheias com DMEM incluindo 10% de FBS como um quimioatractor. As células foram incubadas durante 48 horas, e as células invasoras foram coradas com hematoxilina, montadas em lâminas, e contou a 400 vezes campo superior por microscopia de luz.

Análise Estatística

A análise estatística, os dados de montagem e os gráficos foram realizadas usando o pacote de software estatístico SPSS ver.19 (SPSS, Chicago, IL, EUA). Os dados são apresentados como média ±

SD

de pelo menos 3 experiências independentes e teste t de Student foi utilizado para avaliar as diferenças estatisticamente significativas (p 0,05). A sobrevida global (OS), definida como intervalo entre a data do primeiro diagnóstico da data de morte por progressão da doença e sobrevida livre de progressão (PFS), definido como o intervalo entre a data de primeiro diagnóstico da data da progressão da doença, foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. Associações de expressão ALDH1 com o estágio clínico, metástases linfáticas e difusão foram analisados ​​pelo teste de Fisher.

Resultados

Isolamento de ALDH1

altas células de linhas de células EOC

vários métodos para isolar CSCs /AIC foram já descritos [12], e uma população elevada aldeído desidrogenase 1 (ALDH1

alta) identificado pelo ensaio ALDEFLUOR foi descrito para ser enriquecido com CSCs /AIC. [20] Por isso, analisaram linhas de células de carcinoma de ovário pelo ensaio ALDEFLUOR para isolar ovarianos CSCs /CICS. Investigou-3 humano linhas de células de adenocarcinoma do ovário serosos (AMOC-2, HUOA e OVCAR-3) e linhas de células humanas 3 claras de células de adenocarcinoma (ES-2, RMG-1 e TOV-21G) (Figura 1). ALDH1

elevada população foi identificada em todas as células da linha de carcinoma de ovário, ea proporção de ALDH1

células de alta variou de 0,7% para as células ES-2 para 7,9% para as células TOV-21G. Poderíamos isolar ALDH1

células de alta de forma estável a partir de 4 linhas de células (AMOC-2, ES-2, RMG-1 e TOV-21G), e, portanto, usou estas linhas de células para análise posterior.

ALDH1

células elevados foram detectados em 3 linhas celulares de adenocarcinoma seroso (AMOC-2, HUOA e OVCAR-3) e em 3 linhas de células de adenocarcinoma de células claras (ES-2, RMG-1 e TOV-21G). SSC-A: análise de conformação em hélice única. BAAA: aminoacetaldeído boro-dipyrromethene-. Um FITC: isotiocianato de fluoresceína análise. Percentagens em caixas indicam ALDH1

rácios celulares elevadas. Dietilaminobenzaldeído (DEAB), um inibidor específico da ALDH, foi utilizado como controle negativo.

Caracterização de ALDH1

altos Cells

Desde CSCs /CICs são conhecidos para formar esferas em flutuantes condições de cultura [29], foram analisados ​​ALDH1

células de alta por um ensaio de formação de esfera. Um total de 10

3 células por poço foram classificados e incubou-se em uma placa de 6 poços num ambiente independente de ancoragem. No dia 10, ALDH1

células de alta derivadas de células AMOC-2 apresentou maior capacidade de formação de esfera do que a de ALDH1

células de baixa. Resultados semelhantes foram obtidos a partir de células ES-2, células RMG-1 e células TOV-21G (Figura 2A). Uma vez que o ensaio de formação de esfera não é adequado para a quantificação das relações entre os CSCs /CICs em ALDH1

células de alta, foi realizado um ensaio de células formadoras de esfera única. Esfera formação foi observada em 4,86% dos poços de ALDH1

de células de alta derivadas de células AMOC-2 e em 3,13% dos poços de ALDH1

de células de alta derivados de células ES-2 (Figura 2B). Por outro lado, os poços de ALDH1

células de baixa derivada de ambos AMOC-2 e ES-2 células não mostraram qualquer formação esfera.

Um ensaio Sphere-formação Mil ALDH1

células de alta e ALDH1

células baixas foram cultivadas em uma condição flutuante. As esferas foram contadas no dia 10. Ampliação de imagens: × 100. Critério para o tamanho esferóide: mais de 100 um. Cada valor representa o número médio de esferóides ± DP. * Os valores de P. ensaio de formação de esfera única célula B ordenada ALDH1

de células de alta e ALDH1

células foram cultivadas em baixo uma condição de flutuação em uma única célula por poço. As esferas foram contadas no dia 12. Apenas ALDH1

células de alta da AMOC-s e as células ES-2 iniciado esferóides de células individuais. Ampliação de imagens: × 200. Cada valor é a média percentual de esferóides ± SD. C Matrigel ensaio de invasão Imagens: células derivadas de ALDH1 Matrigel-invadindo

baixa de células de alta /de ES-2 e células TOV-21G. Ampliação de imagens: × 100. Cada valor representa a média do número de invadir células ± DP. * Os valores de P.

Em seguida, investigaram a capacidade invasão de ALDH1

alto e ALDH1

células de baixa pelo ensaio matrigel invasão. ALDH1

células de alta derivadas de todas as quatro células de linhagem mostrou maior capacidade invadindo matrigel do que ALDH1

células de baixa (Figura 2C).

O status do ciclo celular de ALDH1

células de alta e que de ALDH1

células baixas foram analisados. Os rácios de ALDH1

de células de alta na fase S e G2 /M foram fase maior do que o índice de ALDH1

células de baixa na fase S e G2 /M de fase (Figura 3A). Celular crescer análise revelou que ALDH1

de células de alta derivadas de células AMOC-2 e RMG-1 tinham mais elevada do que aqueles crescer taxas de ALDH1

células baixos (Figura 3B).

Um ciclo celular análise ALDH1

células de baixa e de alta ALDH1

foram analisadas por um ensaio de ciclo celular. O gráfico indica as proporções de células em G0 /G1 fase, a fase S e G2 fase /M. análise de crescimento celular B As capacidades de crescimento de ALDH1

células de alta e ALDH1

células baixas foram investigados. Cada valor é o número médio de células ± SD.

tumorigenicidade Superior de ALDH1

altos Células do que a de ALDH1

baixas células

Para resolver o

in vivo

tumorigenicidade de ALDH1

células de baixa altura e ALDH1

de linhas celulares EOC, o transplante de xenoenxerto em NOD /SCID por ALDH1

alto e ALDH1

células de baixa derivadas da AMOC-2 e células RMG-1 foi realizado (Figura 4A, 4B e 4C). Como mostrado na Tabela 1, os tumores foram observados em 5 de 5 ratinhos (10

4 células de injecção), quatro de 5 ratinhos (10

3 células injecção), e 2 de 5 murganhos (10

2 células de injeção ) em que o xenotransplante de ALDH1

células de alta derivadas de células AMOC-2 foi realizada. Por outro lado, os tumores foram observados em apenas 3 dos 5 ratinhos (10

4 células injecção), e 2 de 5 murganhos (10

3 células injecção) em que xenotransplante de ALDH1

células de baixa foi realizada. Além disso, a taxa de crescimento de tumores derivados de AMOC-2 ALDH1

de células de alta foi significativamente mais rápida do que a dos tumores derivados de AMOC-2 ALDH1

células baixos (Figura 4C). Resultados semelhantes foram obtidos para as células RMG-1 (Figura 4B e 4C).

A ALDH1

altas /baixas tumores derivados de células AMOC-2. B ALDH1

altas /baixas tumores derivados de células RMG-1. Imagem: camundongos NOD /SCID que foram injetados com 1,0 × 10

3 ALDH1

células de alta /baixa e em que os tumores observados em ambos os lados de sua parte traseira. imagens histológicas: coloração Hematoxilina-Eosina (H-E, painel esquerdo), de coloração imuno-histoquímica ALDH1 (painel do meio), Ki-67 de coloração imuno-histoquímica (painel direito) de ALDH1

altas /baixas tumores. Ampliação de imagens: × 400. curvas C de crescimento de ALDH1

altas /baixas tumores derivados de AMOC-2 e células RMG-1. Coluna da esquerda: células AMOC-2, 1,0 × 10

3 injeção. coluna do meio: células AMOC-2, 1,0 × 10

2 injeção. coluna da direita: células RMG-1, 1,0 × 10

3 injeção. Cada valor representa o volume tumoral médio ± DP. * Os valores de P. D Imunoreatividade para ALDH1 ou Ki-67 de ALDH1

altas /baixas tumores derivados de AMOC-2 e RMG-1cells Cada valor é a percentagem positiva média ± SD. * P valores.

Aspectos histológicos de tumores derivados de ALDH1

células de alta e ALDH1

células de baixa que foram isoladas de AMOC-2 e RMG-1 células foram investigados ( Figura 4A e 4B). Tumores derivados de AMOC-2 ALDH1

células de alta e AMOC-2 ALDH1

células de baixa mostrou adenocarcinoma pouco diferenciado e não houve diferença significativa. Da mesma forma, tumores derivados de RMG-1 ALDH1

células de alta e RMG-1 ALDH1

células de baixa mostrou pouco diferenciado adenocarcinoma de células claras. a coloração imuno-histoquímica revelou que não havia nenhuma diferença significativa na taxa de ALDH1-positiva entre os tumores derivados de AMOC-2 ALDH1

de células de alta e tumores derivados de AMOC-2 ALDH1

células de baixo, enquanto que o tumor derivado de RMG-1 ALDH1

células de alta mostraram taxas positivas significativas superiores ALDH1 do que a de tumor derivado de RMG-1 ALDH1

células baixas (Figura 4D). Além disso, os tumores derivados de AMOC-2 ALDH1

células de alta e RMG-1 ALDH1

células de alta apresentaram taxas significativamente maiores positivos para Ki-67 (MIB-1) do que aqueles de tumores derivados de AMOC-2 ALDH1

células baixos e RMG-1 ALDH1

células de baixa (Figura 4D).

Identificação de ALDH1

células elevados em amostras primárias EOC

Para detectar ALDH1

células de alta em cancro do ovário primária, foram analisados ​​onze materiais clínicos utilizando o ensaio ALDEFLUOR (5 casos de células de cancro do ovário sólidos e 6 casos de ascite maligna de casos de cancro do ovário, resumidos na Tabela 2). células epiteliais CD326-positivas foram identificadas em tecidos de cancro do ovário sólidos, e as taxas positivas variou de 8,1% a 81,0% (Figura 5A, painéis superiores). ALDH1

células elevados foram detectados em 4 dos 5 casos, ALDH1 e

taxas elevadas de células positivas variou de 0,9% a 12,0% (Figura 5A, painéis inferiores). Além disso, ALDH1

células elevados foram detectados em células CD326-positiva derivadas a partir de ascites de cancro do ovário em 4 dos 6 casos, e as taxas positivas de ALDH1

de células de alta variou de 1,7% a 4,2% (Figura 5B). Portanto, a atividade ALDH1 determinada utilizando o ensaio ALDEFLUOR pode ser uma abordagem útil para isolamento de CSCs /CICs de células de cancro do ovário primárias.

A análise de células de cancro do ovário Painel superior sólida primária mostra a coloração CD326. Percentagem indicad taxa positiva para CD326 células. painel inferior mostra ensaio ALDEFLUOR de células CD326-positivos. Esquerda: No.1 Paciente, caso de estágio Ic adenocarcinoma de células claras. Direita: No.3 Paciente, caso de estágio Ic endometrioid adenocarcinoma. B Análise de células cancerosas primárias de ascite seleção CD326-positive foi feito antes da análise ALDEFLUOR. Esquerda: No.4 Paciente, caso do estágio IIIc adenocarcinoma seroso. Direita: No.6 Paciente, caso de células claras fase III-B e adenocarcinoma endometrioid. CD326: molécula de adesão celular epitelial (EpCAM). APC: aloficocianina área. pontuações por cento em caixas indicam relações CD326-positivos ou ALDH1-atividade.

Associação de alta Expressão Nível de ALDH1 está com mau prognóstico

Um total de 123 câncer epitelial de ovário os tecidos foram corados com imuno-histoquimicamente anticorpo anti-ALDH1 (Tabela 3, Figura 6A). As medianas das taxas ALDH1-positivos em casos de adenocarcinoma seroso e casos de adenocarcinoma de células claras foram de 20% e 15%, respectivamente. Por isso, dividiu os casos em dois grupos, ALDH1

alta do grupo e ALDH1

baixo grupo, de acordo com as medianas. Como mostrado na Tabela 3, não houve correlação significativa do nível de expressão de ALDH1 com a idade ou com cada estádio clínico FIGO. nível de expressão alta de ALDH1 não mostrou correlação significativa com estágios avançados (fase III + IV), factor T ou metástases em linfonodos em ambos os casos de adenocarcinoma seroso e casos de adenocarcinoma de células claras. O teste de log-rank revelou que maior nível de ALDH1 expressão está associada a pior prognóstico, com uma diferença significativa no sistema operacional de pacientes com adenocarcinoma seroso (P = 0,006) e OS de pacientes com adenocarcinoma de células claras (P = 0,047) do que os menos nível de expressão de ALDH1 (Figura 6B). nível de expressão mais elevado de ALDH1 mostrou uma tendência para PFS mais curtos do que o de menor nível de ALDH1 expressão, mas as diferenças não foram significativas (adenocarcinoma seroso: P = 0,062; adenocarcinoma de células claras: P = 0,058).

A coloração HE e ALDH1 coloração imuno-histoquímica de adenocarcinoma seroso do ovário primário (esquerda) e adenocarcinoma de células claras ovariana primária (direita) superior painel da esquerda: coloração HE de ALDH1

alto espécime. Superior painel direito: ALDH1 coloração imuno-histoquímica de ALDH1

alto espécime. Painel inferior esquerdo: H-E coloração de ALDH1

baixos espécime. Painel inferior direito: coloração imuno-histoquímica ALDH1 de ALDH1

baixos espécime. Ampliação de imagens: × 400. B teste de Log-rank para ALDH1

altas /baixas grupos de adenocarcinoma seroso do ovário e os pacientes de adenocarcinoma de células claras. adenocarcinoma seroso: 62 casos /clear adenocarcinoma de células: 37 casos. Casos no grupo ALDH1

alta são casos com taxa positiva para ALDH1 de mais de 20% para os casos de adenocarcinoma seroso e 15% para os casos de adenocarcinoma de células claras. Esquerda: coluna: sobrevida livre de progressão (PFS). coluna da direita: a sobrevida global (OS). * P valores.

Discussão

Neste estudo, foram isoladas de ovário de CSCs /CICs com alta tumorigenicidade pelo ensaio ALDEFLURO. Um ALDH1

alta população poderia ser isolados não apenas de linhas celulares de cancro do ovário, mas também a partir de amostras de cancro do ovário primários. Existem vários métodos de isolamento de CSCs /AIC têm sido relatados. Com efeito, os CSCs ovarianos /AIC Foram isolados com sucesso, utilizando vários métodos, incluindo o ensaio de ALDEFLUOR [25], a população lateral (SP) análise [32], [33], e da utilização de CD133

+ [34], CD44

+ CD24

– [35] e CD24

+. [36] No entanto, existe um relatório mostrando que controversa um marcador CSC /CIC não funciona em alguns tipos de células. [37], [38] Por conseguinte, é essencial para validar a população de células isolada por marcadores CSC /CIC por vários tipos de análise. Neste estudo, confirmamos que o ALDH1

alta população tinha maior tumorigenicidade e maior capacidade de formação de esfera. Estas observações indicam que a ALDH1

células de alta nós utilizados neste estudo são enriquecidos com CSCs /CICS. Houve poucos relatos sobre isolamento de CSCs /CICs a partir de células de câncer de ovário primly. Nós isolado ALDH1

células de alta a partir de 8 de 11 casos primários de câncer de ovário. Nós não poderíamos analisar ALDH1

altas células de cancro do ovário primárias devido à limitação do número de células; no entanto, a nossa abordagem é um método possível e promissora para isolar CSCs /CICs de cancros do ovário primárias.

Os principais subtipos histológicos do EOC são adenocarcinoma seroso, adenocarcinoma de células claras, adenocarcinoma endometrioid e adenocarcinoma mucinoso, e esses subtipos são conhecidos ter características diferentes em factor de risco da carcinogénese, aspectos biológicos moleculares e assim por diante. Mais informações sobre subtipos individuais é necessário para melhorar a sobrevida dos pacientes. adenocarcinoma seroso é o subtipo histológico com pior prognóstico; no entanto, os casos de adenocarcinoma seroso são frequentemente diagnosticados em estágio avançado. adenocarcinoma de células claras está a aumentar gradualmente até quase 12% da EOC em países asiáticos, e comparação dos casos no mesmo estágio de 3 subtipos histológicos (adenocarcinoma de células claras, adenocarcinoma endometrioid e adenocarcinoma mucinoso) revelou que adenocarcinoma de células claras é a pior prognóstico em cada fase. Portanto, adenocarcinoma de células claras é pensado para ser o mais alto grau de EOC, recentemente. [39], [40] casos de adenocarcinoma Serosa foram analisados, principalmente, em estudos anteriores, e tem havido poucos estudos em que foram analisados ​​os casos de adenocarcinoma de células claras. [23] – [25] Neste estudo, foram analisados ​​não só os casos de adenocarcinoma seroso, mas também casos de adenocarcinoma de células claras. Portanto, essas informações vai trazer insights sobre não só para adenocarcinomas serosa, mas também mais adenocarcinomas de células claras mais alto grau.

Nós descobrimos que 4 linhas celulares EOC incluindo 3 linhas de adenocarcinoma de células claras foram positivos para a formação de esfera com 1000 células /bem. Por outro lado, apenas duas linhas de células (AMOC-2 e Es-2) mostrou a formação de esfera em análise esfera única célula. Estes resultados indicam que os CSCs /AIC, que têm a capacidade para formar uma esfera de apenas uma célula, são enriquecidas em ALDH1

de células de alta; no entanto, as proporções de CSCs /CICs não são tão altos, mesmo em ALDH1

altas populações. Este resultado indicou que o ensaio ALDEFLUOR é apenas um marcador substituto para CSCs /CICs e que a combinação de ensaio ALDEFLUOR com outros marcadores pode ser uma abordagem melhor para isolar CSCs /CICs.

Em estudos anteriores sobre coloração imuno-histoquímica, resultados contraditórios sobre a associação de expressão ALDH1 com o prognóstico em EOC foram obtidos. Chang

et al

. relatado que a expressão ALDH1 correlaciona-se com prognóstico favorável no carcinoma do ovário seroso ou não seroso [26], enquanto Deng

et al

. e Wang

et al

.