Abstract

O câncer oral é a quarta causa mais comum de morte por câncer em homens de Taiwan. Indirubin-3′-monoxima (I3M), um inibidor da quinase dependente de ciclina potente, tem efeitos terapêuticos em outras células cancerosas. Neste estudo, realizou-se

in vitro

ensaios para testar a viabilidade celular, progressão do ciclo celular, apoptose, migração e invasão celular neste tipo de câncer. Além disso, utilizando um modelo animal tumorigênico oral, examinamos gene alvo e expressão da proteína usando tempo real qPCR, immunoblotting e coloração imuno-histoquímica. Os nossos resultados demonstram que I3M tem um efeito anti-proliferativo em ambas as linhas celulares de cancro orais Cal-27 e HSC-3 e que o tratamento de Cal-27 e HSC 3-células com resultados I3M em apoptose através da activação de citocromo

C

. Além disso, I3M interrompe o ciclo celular em células Cal-27 de um modo dependente da dose por células prender na fase G2 /M. Nós também descobrimos que suprime I3M migração e invasão em CAL-27 células por inibição da expressão da quinase de adesão focal, inibidor de plasminogénio de tipo uroquinase, e metaloproteinase de matriz 9. Por outro lado, identificou-se a survivina como uma proteína alvo em I3M-tratados células cancerosas orais . Usando um modelo de ratinho por via oral do cancro, nós demonstramos que a aplicação tópica de um gel adesivo composto por I3M e poli (álcool vinílico) (I3M /PVA) tem efeitos anti-tumorigénica dependente da dose. Após o tratamento, a expressão da proteína e ARNm de survivina foi regulada negativamente em tecidos cancerosos. Além disso, os níveis de survivina de plasma foram também reduzidos nos ratinhos tratados com I3M. Estes resultados sugerem que a aplicação tópica de I3M, uma droga sintetizada a partir de indirubin, que é encontrado em Qing-Dai – tem potencial terapêutico para o tratamento de câncer bucal

Citation: Lo WY, Chang NW (2013) An indirubin Derivative. , indirubin-3′-monoxime Suprime Oral Cancer Tumorigênese através da regulação negativa do Survivina. PLoS ONE 8 (8): e70198. doi: 10.1371 /journal.pone.0070198

editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de maio de 2013; Aceito: 16 de junho de 2013; Publicação: 13 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lo, Chang. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores também gostaria de agradecer ao Conselho Nacional de Ciência (NSC96-2320-B-039-024, NSC 97-2320-B-039-016-MY3), O Departamento de Saúde de Taiwan, China Medical University Hospital Cancer Research Center of Excellence ( DOH102-TD-C-111-005) e da China Medical University Hospital (DMR-96-043) para apoiar este trabalho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células escamosas oral (CCEO) é responsável por aproximadamente 90% das neoplasias malignas orais. Aproximadamente 274.000 novos casos são diagnosticados anualmente em todo o mundo, e apesar de métodos diagnósticos e terapêuticos melhorados, os pacientes só têm uma taxa de sobrevivência de 50% em 5 anos [1]. Fumar, mascar betel-quid, uso de álcool e de tabaco sem fumaça produtos constituem os principais factores de risco para o cancro oral. opções atuais de tratamento para o cancro oral incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia, embora a taxa de sobrevivência de 5 anos para o câncer bucal continua a ser um dos mais baixos entre as neoplasias malignas comuns [2]. O câncer de boca é o sexto tipo de câncer mais comum em Taiwan e a quarta causa mais comum de morte por câncer entre os homens de Taiwan desde 2006 [3]. Portanto, a identificação de novos agentes e novos alvos para o tratamento de cancro oral, necessários para melhorar a gestão clínica da doença.

danggui longo Hui Wan é um composto da medicina tradicional chinesa, que é utilizado para tratar leucemia mielocítica crónica [4], e o ingrediente activo parece ser Qing Dai (

naturalis do Indigo

), que contém altos níveis de corante índigo. Além disso, a actividade anti-leucémica deste ingrediente tem sido atribuída ao indirubin índigo isómero de cor vermelha. Indirubin e os seus derivados inibem fortemente o crescimento de várias células cancerosas humanas, principalmente por meio de paragem do ciclo celular (em G2 /M ou fase G1) seguido por apoptose [5], [6]. Foi determinado que os derivados de indirubin são fortes inibidores de cinases dependentes de ciclina (CDKs), glicogénio sintase-quinase-3β [7], c-Src quinase e STAT3 sinalização [8], [9]. Considerando indirubin si tem baixa solubilidade, a baixa taxa de absorção e toxicidade gastrointestinal significativa, sintética indirubin-3′-monoxime (I3M) tem melhores propriedades farmacológicas e toxicidade reduzida. Além disso, em comparação com indirubin, I3M inibe muitas proteínas quinases adicionais, bem como a sinalização STAT3, e tem sido mostrado ter efeitos anti-proliferativos em células do músculo liso vascular [10] – [12]. Recentemente, indirubin-3′-oxima também têm sido relatados induz disfunção mitocondrial e provoca a inibição do crescimento e a paragem do ciclo celular em células de neuroblastoma humano [13]. Portanto, I3M é considerado um dos derivados indirubin mais potentes para o tratamento do cancro.

Survivina é um determinante crítico para a sobrevivência de células, e que funciona tanto por regulação da divisão celular e inibir a apoptose [14]. Como um membro do inibidor de apoptose (IAP) da família de proteínas, survivina foi originalmente caracterizada como um inibidor da caspase física, proporcionando um passo citoprotector a jusante do receptor de morte e a apoptose mitocondrial [15]. No entanto, sabe-se agora que o inibidor de X-ligada da proteína apoptose (XIAP) é o único inibidor fisiológico verdadeiro das caspases 3, 7 e 9 [16]. Apesar da falta de motivos estruturais que medeiam a ligação da caspase, a survivina pode inibir de caspase activa 9 através da cooperação com a proteína X-interagindo vírus da hepatite B [17]. Além disso, a associação de survivina com XIAP leva a uma inibição sinergística da caspase 9 activação [18]. Muitos estudos têm demonstrado que a survivina é sobre-expressa em vários cancros humanos e está associado com prognóstico pobre [19]. Mais especificamente, a expressão survivin está correlacionada com mau prognóstico e chemoresistance no câncer oral [20] – [22]. Além disso, a inibição da survivina em diferentes tipos de câncer de cabeça e pescoço aumenta significativamente as actividades anti-tumorigênicos de vários agentes citotóxicos e terapias específicas [23].

Com base estudos anteriores, teve como objetivo estudar o papel da survivina em relação ao tratamento I3M no câncer oral. Neste estudo, foi demonstrado que I3M tem várias actividades anti-tumorigénicas e que pode inibir a proliferação celular, migração e invasão, enquanto, ao mesmo tempo que promove a apoptose em células de cancro oral. Utilizando imunotransf erência e análise de qPCR em tempo real, descobrimos que a expressão de survivina foi regulada negativamente na linha celular de cancro Cal-27 a seguir ao tratamento I3M, identificando a survivina como um mediador potencial da actividade anti-tumorigénica de I3M. Finalmente, verificou-se que I3M inibe a expressão survivin e exibe atividade anti-tumorigénico em um modelo oral, rato tumorigênese. Nossos resultados sugerem que I3M suprime tumorigênese câncer bucal por mediar a actividade de survivina.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

O protocolo utilizado para a camundongos experimental foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da China Medical University (aprovação IACUC não. CMU-99-26-N). Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais (Declaração de Aprovação Use Protocolo Animal, No. 98-33-N), aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da China Medical University (Taichung, Taiwan).

Reagentes e de cultura de células

indirubin, I3M, sulfóxido de dimetilo (DMSO), azul de tiazolilo brometo de tetrazólio (MTT), azul de tripano, Triton X-100, e penicilina /estreptomicina foram comprados na Sigma Chemical ( St. Louis, MO, EUA).

a linha de células de câncer de boca humana Cal-27 e a linha de células HSC-3 foram adquiridos da coleção Bioresource e Centro de Pesquisa (BCRC), Pesquisa da Indústria Instituto de Alimentação e Desenvolvimento (FIRDI) (Hsinchu, Taiwan). As células foram plaqueadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM; Gibco) e DME /F-12 (Gibco) suplementado com 10% FBS, 100 unidades /mL de penicilina, 100 ng /mL de estreptomicina e 1% de glutamina, a 37 ° C [24 ], [25].

MTT

a proliferação celular foi avaliada através de um ensaio MTT. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma concentração de 1000 células /poço. Seis poços foram ensaiados para cada tratamento experimental. Depois as células foram tratadas com 0, 5, ou 10 indirubin uM ou I3M (dissolvido em DMSO a 0,1%) durante 0, 24, ou 48 h, 20 pi de MTT (5 mg /ml; Sigma) foi adicionado a cada poço , e as células foram então incubadas durante 3 h. A reacção foi parada por remoção do reagente MTT. DMSO (150 uL) foi então adicionada a cada poço para dissolver os cristais de formazano. A absorvância foi medida a 570 nm. Os efeitos foram também avaliados por contagem de células utilizando um hemocitómetro. Todas as medições foram realizadas em triplicado.

Preparação de fracções subcelulares e imunotransferência de citocromo c

As células foram plaqueadas em placas de 10 cm e tratou-se com I3M de dose variável durante 24 h. Após a incubação, as células foram colhidas, ressuspensas em tampão de extracto celular (HEPES 20 mM (pH 7,5), KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM

2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM e ditiotreitol 1 mM) que contenha mistura de 250 mM de sacarose e inibidores da protease (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha) e homogeneizou-se. Os homogenatos foram centrifugados duas vezes a 1000 ×

g

durante 10 min a 4 ° C para remover núcleos e células inteiras. Os sobrenadantes foram em seguida centrifugadas a 10.000 ×

g

durante 15 min a 4 ° C. Os sobrenadantes das 10.000 ×

g

centrifugação são referidos como a “fracção citosólica.” As amostras de proteína citosólica (30 g) foram separadas em 12% de gel SDS-PAGE e imunomarcadas com anti-citocromo

c

(1:1000) e anti-β-actina (1:1000) anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. O segundo anticorpo marcado com peroxidase de rábano foi incubada com as manchas, seguido de lavagem. sinais quimioluminescentes foram detectados utilizando substratos quimioluminescentes, hemo- SuperSignal Oeste (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante.

Os peletes a partir da primeira mitocondriais 10000 ×

g

centrifugação foram ressuspensos em tampão de extracto celular, contendo 250 sacarose mM para proteger a mitocôndria por 20 ciclos, utilizando um homogeneizador. Os homogenatos foram centrifugados a 750 ×

g Compra de 3 × 10 min a 4 ° C para remover os restos e núcleos. O sobrenadante foi então centrifugado a 15.000 ×

g

durante 20 min; o pelete, que continha “fracção de mitocôndrias”, foi lisada em tampão de lise de SDS; e 30 ug de proteínas mitocondriais foi submetido a análise de imunotransf erência como as descrições acima.

Anexina V /PI coloração

Cal-27 células (10

5) foram semeadas em cada poço de uma placa de 6 poços e tratadas com DMSO ou 10 I3M uM durante 24 h. O kit de Anexina V-FITC Apoptosis Detection (Strong Biotech Corporation, Taiwan) foi usada para determinar a percentagem de células apoptóticas. Resumidamente, as células colhidas foram lavadas com PBS e centrifugado a 200 ×

g

durante 5 min. Os peletes de células foram ressuspensas em tampão de coloração e coradas com anexina V-FITC e PI durante 15 min a 25 ° C de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de células coradas usando estes reagentes pode ser dividido em três populações: as células apoptóticas (marcadas por fluorescência verde), as células mortas (marcadas por fluorescência vermelha ou amarela resultante a partir de uma combinação de fluorescência vermelha e verde), e as células vivas (que mostra pouca ou ausência de fluorescência). As células foram analisadas utilizando um Citómetro Imagem tálus ™ (Invitrogen). O Tali ™ Imagem Citómetro capta 20 imagens de uma amostra manchado, analisa automaticamente as imagens usando contagem de células baseado em imagem digital e algoritmos de detecção de fluorescência, e apresenta uma análise quantitativa precisa de populações de células vivas, mortas e apoptóticos. Todas as medições foram realizadas em triplicado.

ciclo celular análise

células Cal-27 foram tratadas com 0, 2,5, 5 ou 10 uM I3M, e após 24 h, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células foram fixadas durante a noite com etanol frio a 70% e, em seguida, corado com uma solução PI ciclo que consiste de 2 mg /100 ml de PBS CAT PI, 1 x PBS, 10 mg /ml de RNase A, e 5% de Triton X-100. A seguir à incubação durante 30 min à temperatura ambiente no escuro, num FACScan Citómetro de fluxo foi usada para detectar células activadas por fluorescência. Todas as medições foram feitas em triplicado.

Migração determinação

células Cal-27 (10

6 células /poço) foram plaqueadas em placas de 6 poços e incubadas durante 24 h. As células foram então “ferida” riscando poços individuais utilizando uma ponta de pipeta. As células foram incubadas com meio DMEM (sem FBS), com ou sem indirubin e I3M (10 uM). As células foram fotografadas por microscopia de contraste de fase (100 vezes). A capacidade migratória das células foi avaliada medindo a largura das feridas. As distâncias de migração das células foram derivadas a partir das diferenças entre as larguras das feridas, a 0, 24, e 48 h.

sistema de cultura Transwell para ensaios de invasão

As capacidades invasivas do cancro células tratadas com ou sem I3M foram examinadas usando o sistema de cultura de membrana Transwell. Resumidamente, utilizou-se membranas Transwell (tamanho de poro de 8 um, 6,5 mm de diâmetro; Corning Costar Corporation) revestidas com Matrigel para os ensaios. As células (1 x 10

4 células) foram semeadas em poços superiores das Transwells pré-revestidas com I3M (0, 2,5, 5 ou 10 uM). Os Transwells inferiores continham o mesmo meio. Após 24 ou 48 h incubações, as células dos poços superiores e as membranas de Matrigel-revestidas foram esfregadas com um Q-tip, fixadas com metanol e coradas com uma solução de Giemsa a 20% (Sigma). As células foram contadas utilizando microscopia de luz (200 x de ampliação). Três experimentos independentes foram realizadas em triplicata

Immunoblotting

Estudos in vitro:.

Após cada tratamento, as células foram isoladas para determinar as proteínas associadas com funções migratórias e invasivos, incluindo P21 (20 kDa) e p53 (53 kDa) (Cell Signaling Technology), survivina (humana, 16 kDa), da metaloproteinase 9 da matriz (MMP-9, 92 kDa) (Thermo Scientific), quinase de adesão focal (FAK, 125 kDa ), u-PA (34 kDa), e p-p38 (Santa Cruz Biotechnology). As amostras foram extraídas a partir de células isoladas (com ou sem tratamento I3M), separados em 12-15% de gel SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF. sinais quimioluminescentes foram detectados como descrito acima para o citocromo

C

. Os sinais foram capturados e quantificada utilizando o Bio Imaging System ChemiGenius (Syngene)

Estudos in vivo:.

As amostras de plasma (40 ug de proteína) foram utilizadas para determinar os níveis de survivina secretadas pela tumores utilizando imunotransferência e um anticorpo survivina (rato) monoclonal como descrito acima. Foi utilizado o Kit Remoção SwellGel® azul Albumina (Pierce) para enriquecer as amostras de plasma.

ensaios bioluminescentes de aaspase-3/7 e -9

Um estudo dependente do tempo de caspase-3 7 /-9 e actividades foi realizado em triplicado utilizando kits de ensaio de caspase-Glo 3/7 e 9 (Promega Corp., Madison, WI, EUA) no branco de 96 poços de microplacas. 10.000 células por poço foi semeada e tratada com 10 uM de I3M durante 12, 24 e 48 horas. Em seguida, a actividade de caspase foi investigada de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, foram adicionados 100 uL do reagente de caspase-Glo e incubou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. As presenças de caspases activas a partir de células apoptóticas vai clivar o tetrapéptido sintético, marcado com aminoluciferin no reagente. O aminoluciferin libertado actua como um substrato para a enzima luciferase, que é medida usando Synergy ™ 2 Multi-Mode leitor de microplacas (Biotek, Winooski, Vermont).

Preparação de indirubin-3′-oxima /poli (vinil álcool) (I3M /PVA) adesiva droga

de PVA (10 g; Sigma) foi suspensa em água destilada quente (100 mL, 90 ° C) e agitada até ficar completamente dissolvida. Depois de o polímero pareceu ser completamente dissolvida, a temperatura e a agitação foi mantida durante mais 4 h para assegurar que os agregados não esteja mais presente. A solução foi arrefecida até à temperatura ambiente, e I3M foi adicionado para se obter 10 e 20 uM I3M /PVA misturas medicamentosas adesiva.

Desenvolvimento do 4-nitroquinolina 1-óxido de (4-NQO) induzida modelo de ratinho tumorigénico bucal

Foram avaliadas a atividade anti-tumorigénico do I3M utilizando um modelo tumorigênico oral em homens de seis semanas de idade camundongos C57BL /6JNarl (peso corporal: 21,6 ± 1,2 g). Para induzir a formação óptima de CCEs por via oral, que included0.2 mg /ml de 4-NQO e 0,5 mg /mL de arecolina em água de beber dos animais durante 8 semanas como a anteriormente publicada [26]. Os ratos (n = 240) foram randomizados para um dos quatro grupos: grupo em branco (n = 60) recebeu apenas água potável; grupo transportador (n = 60), 10 I3M uM (n = 60) e 20 I3M uM (n = 60) os grupos receberam ambos 4-NQO (200 ug /mL) e a arecolina (500 ug /mL) para desenvolver o animal CEB modelos. Na sequência do estudo anterior, sua água potável foi trocado a cada semana, e os ratos foram permitido o acesso à água em todos os momentos durante arecoline tratamento /4-NQO, antes do início dos tratamentos I3M. Seguindo o protocolo do tumor por indução, que durou 8 semanas, [24], as linguetas e as áreas bucais dos ratinhos foram manchadas com PVA sozinho (grupo transportador) ou com 10 ou 20 I3M uM /PVA a cada 2 dias durante 20 semanas ( 0,1 mg /g de peso corporal do rato), que foi iniciada após week8 (Figura S1, Figura 1 e 2). Os tratamentos tópicos foram iniciadas em 08:00 e foram concluídas no prazo de uma hora. Os ratos tratados foram proibidos de acesso à água potável e comida até 00:00 Todos os ratinhos foram pesados ​​a cada 4 semanas. Os ratinhos (n = 10) foram sacrificados todos os meses de cada grupo após 8 semanas; seguinte CO

2 tratamento, uma média de 0,9-1,3 ml de sangue do coração foi coletado de cada rato, e as suas línguas foram excisadas inteira (com tumores), fixo, embutido, e seccionados por hematoxilina e eosina.

(A) Os efeitos inibitórios da indirubin e I3M sobre Cal-27 e a proliferação de células HSC-3. As células foram tratadas durante 24 ou 48 horas com várias concentrações de indirubin ou I3M. A proliferação celular foi analisada pelo ensaio de MTT (em cima) e contagem de células utilizando um hemocitómetro (parte inferior). Os dados são apresentados como a média ± S. D. valores; asteriscos denotam uma diferença estatisticamente significativa (

P Art 0,05). (B) As células Cal-27 (10

5) foram tratadas com 10? M I3M durante 24 h, e a percentagem de células apoptóticas foi determinada utilizando o kit de V-FITC de detecção da apoptose Anexina. Os dados são apresentados como a média ± S.D. valores (n = 3); asteriscos denotam uma diferença estatisticamente significativa (

P Art 0,05) entre o tratamento I3M e grupos de controle. (C) As imunotransferências de extractos de proteína (30 ug) isolado a partir das fracções citosólicas e mitocôndrias de CAL-27 células tratadas com 0, 2,5, 5 ou 10 uM I3M durante 24 h. Os resultados apresentados são representativos de seis experiências independentes.

células (A) Cal-27 foram tratadas com I3M (0, 2,5, 5 ou 10 uM) durante 24 h. Após o tratamento, as células foram colhidas, fixadas com metanol, coradas com iodeto de propidio, e analisados ​​utilizando citometria de fluxo. Os dados para cada amostra representa a percentagem de células encontradas na fase G0 /G1, S e G2 /M fases do ciclo celular. (C) Imunotransferência mostrando a expressão de proteínas relacionadas com o ciclo celular em células Cal-27 tratadas com I3M. Os lisados ​​celulares totais foram preparados 24 h após tratamento com I3M (0, 2,5, 5 ou 10 uM). A expressão de p53 e p21 foi determinada utilizando imunotransferência.

β -actina foi utilizada como controlo de carga neste estudo. As experiências foram repetidas três vezes com resultados semelhantes.

em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR em tempo real)

O ARN total foi extraído a partir de células utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen) . O ARN foi transcrito reverso-III usando o First Strand Synthesis System SuperScript (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. PCR em tempo real quantitativo foi realizado utilizando uma máquina de LightCycler 480 e o SYBR Green I Mestre Kit (Roche Diagnostics) [27]. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S1.

A análise imunohistoquímica

As amostras de tecido foram fixadas em paraformaldeído a 4% (Merck) a 4 ° C. Após uma breve lavagem com PBS, as amostras foram transferidas para 30% de sacarose em PBS 0,01 M para crioprotecção. Nós pré-incubadas (2h, 25 ° C) as secções 8-um, com soro de cavalo a 10% e 0,3% de Triton X-100 em PBS para impedir a ligação não específica. As secções foram incubadas com anticorpos específicos, incluindo primários policlonais de coelho anti-COX2 (1:200; Abcam), anticorpo policlonal de coelho anti-survivina (1:50, Novus Biologicals), e TUNEL (1:100 QIA33; Calbiochem, Merck) para 1 h a 37 ° C, seguido por incubação durante a noite a 4 ° C. Os cortes foram subsequentemente incubadas (2 h, 25 ° C) com um anticorpo secundário conjugado com biotina (1:200; Vector), seguido por incubação com um complexo de peroxidase avidina-rábano (ABC-Elite)

. a análise estatística

Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Todos os dados são apresentados como a média ± S.D. valores. Student

t

-test foi utilizado para analisar diferenças entre os grupos tratados e não tratados. Os dados foram analisados ​​usando o programa de software SPSS 12.0.

P

-Valores. 0,05 foram considerados a ser significativo

Resultados

I3M inibe a proliferação de células de câncer oral e induz a apoptose

Indigo, indirubin e I3M foram testados para a actividade do crescimento de inibição utilizando as linhas celulares de cancro orais CAL-27 e HSC-3, e a concentração inibitória de 50% foram determinados (

50 IC) valores para estas três substâncias seguintes 24 h de tratamento de drogas (Tabela S2). I3M era claramente mais activo em comparação com índigo ou indirubin em ambas as linhas celulares. Em seguida, examinou os efeitos anti-proliferativos de diferentes concentrações de indirubin e I3M em HSC-3 e células Cal-27 (Fig. 1A). Os ensaios mostraram que ambos MTT 5 e 10 uM indirubin não teve efeitos anti-proliferativos óbvias em qualquer uma das linhas de células após 48 horas de tratamento. Em contraste, 10 ^ M I3M provocou efeitos anti-proliferativos significativos em células HSC-3, após 48 h, e ambos uM I3M 5 e 10 exerceu efeitos anti-proliferativos em células Cal-27. As fases iniciais de apoptose foram quantificados utilizando FITC-anexina V conjugada e analisadas com um citómetro tálus ™ Imagem. Em células Cal-27, 38,5% das células foram positivas para anexina V após 24 horas de tratamento com I3M (10 uM) em comparação com apenas 5% das células no grupo de controlo (Fig. 1B). Após 24 h de tratamento I3M, a dose-dependente crescente de imunotransferência foi evidente nas fracções citosólicas de citocromo

C

(Fig. 1B).

I3M induz a paragem do ciclo celular em grande parte, na G2 /fase M e aumenta p53 e p21

expressão WAF1

para determinar se I3M induz Cal-27 de paragem do ciclo celular, utilizou-se citometria de fluxo para analisar como concentrações crescentes de I3M afectar a progressão do ciclo celular. O tratamento com I3M ao longo de 24 h aumentou a proporção de Cal-27 restantes células na fase G2 /M, de um modo dependente da dose. Especificamente, a percentagem de células /M-fase G2 aumentou de 36,6% para 53,9%, em resposta a I3M 10 uM. Além disso, observou-se um aumento na percentagem de células /G1 de fase G0 de 11,4% para 21,4% (Fig. 2A). Sabe-se que a p53 suprime o crescimento do tumor por meio de paragem do ciclo celular ou desencadeando a apoptose. Portanto, utilizou-se imunotransferência para determinar se o tratamento I3M modula os níveis de expressão de p53. Após 24 h de tratamento com diferentes concentrações de I3M, CAL-27 células exibiram aumentos dependentes da dose na expressão de p53, com aumentos concomitantes em p21

expressão da proteína WAF1, bem como, o que sugere que um dos mecanismos através dos quais I3M exerce o seu anti efeitos -proliferative poderia ser mediada por p53 (Fig. 2B).

I3M inibe a migração de células cancerosas e invasão

Para examinar se I3M inibe a invasão celular Cal-27, foi realizada uma ferida ensaio de cura . Como mostrado na Fig. 3A, as distâncias de migração foram diminuiu significativamente em células tratadas com I3M 10 mM em comparação com o grupo controle e indirubin. Em seguida, realizou-se uma Matrigel Transwell Ensaio para determinar se I3M também afeta invasão celular. Verificou-se que uma dose de 10