Abstract

Os níveis elevados do imunorregulatório citocinas TGF-β1 em câncer e infecção pelo HIV têm sido associados à supressão de respostas imunitárias protectoras. A regulação da transcrição do TGF-β1 é complexa e ainda não completamente compreendidos. Descrevemos aqui pela primeira vez que o factor de transcrição Gli2 regula a expressão de TGF-β1 em CD4 humano

+ células T.

In silico

rastreio revelou cinco locais putativos novos GLI obrigatório em

TGF-β1

promotor humano. Pelo menos dois desses sites dentro do humano

TGF-β1

promotor são regulados pelo ativador Gli2 como knockdown de

Gli2

em regulamentar CD4

+ CD25

oi células T, produtores elevados de TGF-β1, diminuiu significativamente

TGF-β1

transcrição. Além disso, naïve CD4

+ células T, os baixos produtores de TGF-β1, aumento do seu nível basal de

TGF-β1

mRNA após infecção lentiviral com Gli2. A regulação da transcrição da

TGF-β1

por Gli2 é uma nova extensão para o Sonic Hedgehog (SHH) e

TGF-β1

cross-regulação e podem fornecer informações sobre a elevação prejudicial de TGF-β1 levando a patogênese do câncer e infecção pelo HIV

Citation:. Furler RL, Uittenbogaart CH (2012) Gli2 Regula TGF-β1 em CD4 humano

+ células T: Implicações no cancro e HIV patogênese. PLoS ONE 7 (7): e40874. doi: 10.1371 /journal.pone.0040874

editor: Derya Unutmaz, Universidade de Nova Iorque, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de julho de 2011; Aceito: 18 de junho de 2012; Publicado: 31 Julho, 2012 |

Direitos de autor: © Furler, Uittenbogaart. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde AI-081636 e AI-028697 (University of California Los Angeles, Center for AIDS Research), a Seed Grant Jonsson Comprehensive Cancer Center, e um Prêmio Stein Oppenheimer Endowment. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

factor de crescimento transformante β1 (TGF-β1) é uma citocina pleiotrópica que regula a resposta imunitária em muitas doenças incluindo cancro e infecção por HIV e desempenha um papel importante na prevenção da patogénese [1] – [5]. Ele é produzido por diversos tipos de células, incluindo células CD4

+ CD25

oi células T reguladoras, macrófagos, assim como pelos fibroblastos. TGF-β1 diminui a proliferação de linfócitos T e B, funções efectoras de muitas células do sistema imune e induz as células T reguladoras periféricos [6]. Embora o TGF-β1 é crítica ao longo do desenvolvimento mamífero e para evitar a activação aberrante do sistema imunológico do hospedeiro, a expressão elevada de TGF-β1 pode amortecer as respostas imunitárias protectoras para tumores e infecções.

alta produção aberrante de TGF-β1 pela células malignas foi demonstrado que o aumento de metástases, bem como para impedir uma resposta imune do hospedeiro de protecção para tumores [7]. Na infecção crónica pelo HIV, o TGF-β1 é elevado em vários compartimentos, incluindo tecidos linfóides, sangue, fluido cerebrospinal e [8] – [10]. Aumento dos níveis de TGF-β1 pode induzir o desenvolvimento de induzido (i) Treg observada na infecção pelo HIV crónica [11], [12], e pode contribuir para a disfunção do sistema imunitário durante a fase final de doença. A proteína Tat de HIV-1 induz a TGF-β1 em leucócitos humanos [13] – [15], condrócitos [16], e também em CD2 de murino

+ células T de um modelo de ratinho transgénico Tat-[17]. Os mecanismos de indução induzida por tumor e Tat mediada por TGF-β1 são desconhecidos. Câncer e AIDS são apenas duas das muitas doenças em que TGF-β1 desempenha um papel na patogênese.

A expressão de TGF-β1 ativo é fortemente regulada na transcrição, translacional, e os níveis de pós-traducionais. Embora a expressão TGF-β1 tem sido um foco de intensa investigação, ainda estamos longe de compreender regulamentação complexa desta citocina.

in silico

análise da região promotora de TGF-β1 indica vários sítios de ligação putativos de factores de transcrição conhecidos. Alguns destes factores de transcrição, tal como SP-1 e Zf9, foram anteriormente encontrado para mediar

TGF-β1

transcrição, mas estes factores não são suficientes para induzir a expressão de ARNm [18], [19]. Por isso, investigamos o que outros fatores de transcrição induzir mRNA TGF-β1.

Encontramos seis locais putativos de ligação (cinco anteriormente não declarada) para os fatores humanos GLI transcrição por

in silico

análise do humano

TGF-β1

promotor. O factor de transcrição Gli2 é um dos principais efectores a jusante da via de Hedgehog Sonic (SHH), que se demonstrou desempenhar um papel na função do sistema imune adaptativo [20], [21]. A via SHH modula a ativação [22], a proliferação [23], [24], e regulação de citocinas [25] em CD4

células + T. Dado que existem várias interações entre o TGF-β1 e as vias SHH (Tabela 1), nós nos concentramos em regulação do TGF-β1 por membros da família da via SHH, proteínas ou seja, GLI, no sistema imunológico.

fornecer provas de que, pelo menos, dois dos seis locais de ligação putativos GLI são necessários para a regulação da transcrição mediada por Gli2 do

TGF-β1

promotor humano. Pelo menos um destes dois sítios deve ser funcional para observar regulação TGF-β1 por Gli2. Além disso, ao derrubar

Gli2

em humanos CD4

+ CD25

oi Treg, mostramos que Gli2 é necessária para a expressão TGF-β1. A regulação da transcrição da

TGF-β1

por Gli2 ainda não foi descrito e aumenta a nossa compreensão das complexidades da

TGF-β1

regulamentação.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o uso de células mononucleares do sangue periférico anônimos para a obtenção de células T e a linha de células 293T epitelial foi revisto pela UCLA Institutional Review Board (IRB), que concluiu que essa atividade não envolve seres humanos e, portanto, não necessitam de revisão IRB ou certificação.

In Silico Triagem

a triagem para locais putativos de ligação GLI no ser humano

TGF-β1

promotores foi feita por

in silico

análise utilizando o MatInspector programa de software (https://www.genomatix.de). Uma gama de vinte quilobases que rodeiam o primeiro humano

TGF-β1

promotor foram utilizadas para pesquisar locais de ligação do factor de transcrição putativo. Todos os seis locais de ligação putativos GLI dentro do primeiro quilobases de

TGF-β1

promotor # 1 (cinco potenciais locais) ou promotor # 2 (um local potencial) tinha uma pontuação de semelhança matriz igual a ou maior do que 0,8. locais de ligação encontrados dentro primeira região promotora proximal são novos e são o foco deste estudo

luciferase Promotor Estudos

O humano

TGF-p1

construções repórter promotor-luciferase, phTG5 e phTG1, foram gentilmente cedidas por S. J. Kim [18]. A construção phTG5 de tipo selvagem foi mutado no putatitve GLI locais de ligação (local A, B, ou A e B) utilizando mutagénese dirigida ao local (SÍTIO A: 5′-CAGCCCCCCCATGCC-3 ‘5’-CAGCaaCaaaATGC-3′, site B: 5′-GAGCCCGCCCACGCGA-3 ‘5’-GAGCaaGaaaACGCGA-3′, bases mutadas em letra minúscula). A construção phTG1 de tipo selvagem foi mutado no sítio putativo de ligação GLI E utilizando mutagénese dirigida ao local (local do E: bases 5′-CCCACCACCCACGAA-3 ‘para 5’CCaAaaAaaaACGAA-3’, mutado em letra minúscula). O promotor de tipo selvagem, os promotores mutantes, ou um controlo pGL3 vazio-vector foram individualmente co-transfectadas com o vector de pGLI2ΔN activador constitutivo (gentilmente fornecida por E. Roessler [26]) ou pcDNA3 de controlo com Lipofectamine 2000 usando procedimentos padrão para células 293T, uma linha celular epitelial humana contendo adeno e sequências de ADN virais SV-40, obtido a partir da American Type Culture Collection (ATCC). O plasmídeo contém um gene pGLI2ΔN Gli2 constitutivamente activo devido a um truncamento no terminal amino. O domínio do terminal amino do gene Gli2 humana tem uma função de repressor, e pode ser removido foi mostrada para aumentar a transcrição de genes alvo a jusante, tais como GLI1 [26]. A linha celular 293T foi escolhido por causa da sua eficiência de transfecção e expressão de baixos níveis GLI1, que é a leitura para a activação Gli2. expressão de luciferase foi medida às 48 horas pós-transfecção

isolamento de células, cultura, Estimulação

Naïve CD4 + células T

, expressando CD4, CD31, CD45RA e CD62L, foram purificados e isolados a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), utilizando selecção negativa. CD4

+ CD25

células T reguladoras hi foram enriquecidas a partir de sangue humano utilizando kits RosetteSep e Robosep de Tecnologias Stem Cell. As células primárias foram cultivadas em meio livre de soro que consiste de Meio de Dulbecco Modificado por Iscove suplementado com BSA deslipidado (Sigma-Aldrich) a 1100 ug /ml, transferrina humana (Sigma-Aldrich) a 85,5 ug /ml, glutamina 2 mM e penicilina /estreptomicina a 25 U /25 ng /mL. Todas as condições de estimulação de células T primárias foram realizadas com aCD3 /αCD28-revestido M-450 a partir de grânulos de Invitrogen. superfície celular e intracelulares imunofenótipos foram validados por citometria de fluxo como descrito anteriormente [27]. Para a detecção de FoxP3 intracelular, as células foram coradas pela primeira vez para marcadores de superfície celular, fixadas e permeabilizadas com eBioscience recomendado tampões seguindo as instruções do fabricante, em seguida, incubadas com 450 anticorpos monoclonais conjugados com FITC ou eFluor contra FoxP3 (eBioscience, clone PCH101).

siRNA Knockdown

Knockdown de

Gli2

em células T reguladoras humanas primárias foi feito usando ACCELL siRNA projetado e validado por ThermoFisher /Dharmacon. Um siARN não-direccionamento foi utilizado como um controlo negativo. Um siARN controlo positivo para GAPDH foi usada para verificar a knockdown. Knockdown de Gli2 foi feito usando um siRNA comercialmente disponíveis e validados de Dharmacon (A-006468-14 – Sequência alvo – 5 ‘GGUUUGAAUCUGAAUGCUA 3’). Um controle negativo independente e separada utilizando um mexidos

Gli2

sequência siRNA (5’AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 ‘) foi usado para sanar os efeitos fora do alvo.

Gli2

knockdown foi verificada através da avaliação

GLI1

expressão de mRNA após a estimulação. GLI1 foi previamente mostrado para ser transciptionally regulada por Gli2 e é o controlo positivo para

Gli2

knockdown.

purificada CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ células T reguladoras foram incubadas com o siRNA e ACCELL meio isento de soro (Dharmacon) durante 72 horas antes da estimulação com aCD3 /αCD28 grânulos revestidos. Vinte e quatro horas após a estimulação, as células foram recolhidas para medir

TGF-p 1

níveis de ARNm por RT-PCR. os níveis de TGF-p 1 foram normalizados para

18S rRNA

e em comparação com células não estimuladas.

RT-PCR

Taqman Gene Expression primer /conjuntos de sondas para

TGF-β1 , GLI1

, 18S rRNA, e

GAPDH

da Applied Biosystems Inc. foram usadas para medir os níveis de transcritos em várias condições. A expressão de

TGF-β1, GLI1

, e

GAPDH

foram normalizados para níveis 18S rRNA e expressão relativa entre as condições foi calculado para avaliar a regulação positiva /regulação negativa da transcrição.

Lentivirus Infecções

o

GLI2ΔN

transgene foi colocado em uma terceira geração HIV-1 vector na UCLA Vector core. A maior parte da sequência codificadora virai de HIV foi removido e substituído pelo transgene. As LTR foram modificados para serem “auto-inactivação,” e a transcrição do genoma do vector nas células de empacotamento foi conduzido por um não-HIV promotor. O vírus foi feito usando células 293T que foram co-transfectadas com o plasmídeo vector e três outros plasmídeos que codificam a) as enzimas virais e proteínas estruturais, excepto Env, B) Ap, que está envolvida no transporte do ARN do VIH, e C) glicoproteína VSV, o que é um envelope pan-trópico que permite a entrada do vírus em quase todo o tipo de célula. Naive CD4

+ células T foram infectadas com 100 de p24 ng por milhão de células em meio isento de soro durante 96 horas. Isolou-se ARN para a determinação de alterações na expressão genética através de RT-PCR. um lentivírus contendo GFP foi usado como um negativo controle e também para medir a eficiência de infecção.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP)

análise chip foi feito para determinar se Gli2 liga-se ao

promotor TGF-β1

. CD4 Regulatory

+ CD25

oi células T foram negativamente isolado como descrito acima. As células foram estimuladas com aCD3 grânulos /αCD28-revestidas durante a noite. O kit Gli2 ExactaChIP (R D Systems) foi utilizada para a imunoprecipitação da cromatina. As células foram fixadas, lisadas, e sonicada antes da incubação com qualquer αGLI2-revestidos ou de controlo de pérolas de agarose αIgG-revestido. PCR foi feito seguindo chip para avaliar GLI ligação ao promotor de

TGF-β1

. Gli2 putativo local de ligação “E” (Figura 1) foi detectado utilizando iniciadores desenhados (5′-CTGGGGTCAGCTCTGACAGT-3 ‘e 5′-CAGTTGGCGAGAACAGTTGG-3’; 290 pb) do fragmento. O

Bcl2 e região promotora foi detectado como um controle de ligação GLI positiva usando primers do kit ExactaChIP. Uma região de 238 pb do

IL-10

promotor que não continha local de ligação putativo Gli2 foi medida como um controlo negativo (5′-TGATTTCCTGGGGAGAACAG-3 ‘e 5′-CCCACCCCCTCATTTTTACT-3’).

Existem dois relataram os promotores no

TGF-β1

gene humano.

In silico

análise do humano

TGF-β1

regiões promotoras proximais usando o programa de software Genomatix revelou cinco sítios de ligação putativos GLI não identificadas anteriormente (A a E) em uma região altamente conservada do genoma humano. Local F no segundo promotor tenha sido previamente identificados e estudados [28]. Locais A e B (que se sobrepõe com o C), tudo se encontram dentro da construção repórter de luciferase phTG5 utilizada nos estudos de mutagénese promotor. Site E está presente no construto phTG1. posições de pares de bases aproximados de potencial de locais de ligação GLI são mostrados em relação aos dois locais de início da transcrição relatados para o ser humano

TGF-β1

gene.

Co-imunoprecipitação

Co-immunopreciptation foi realizada para avaliar a ligação de Gli2 humano para o HIV-1 Tat. transfecções duplas foram feitas em células 293T utilizando três conjuntos diferentes de plasmídeos: (GLI2-6xMYC + HIV-1 Tat-FLAG), (GLI2-6xMYC + pcDNA3 de controlo), (HIV-1 Tat-FLAG + controlo pcDNA3). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lisadas e as proteínas libertadas foram recolhidas para co-IP (Kit Pierce Co-IP a partir de Thermo Scientific). A resina de agarose foi revestido com uma de três anticorpos: anticorpo Sigma F1804 M2 anti-FLAG (Tat para se ligar a talão), anticorpo 71D10 anti-myc CST (Gli2 para se ligar ao grânulo), ou um anticorpo de controlo de isotipo. Seguindo co-IP, as eluições foram executados em um gel de SDS-PAGE seguido por Western Blotting.

Estatísticas

Todas as análises foram realizadas pelo Instituto UCLA AIDS Bioestatística núcleo ou com GraphPad Prism 5 Software . As variáveis ​​foram expressos como médias com erro padrão da média. ANOVA e bicaudal de Wilcoxon rank sum, emparelhado quando for o caso, foram usados ​​para analisar as diferenças entre as populações. Um valor de p menor ou igual a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Six putativo GLI Sites de ligação se encontram dentro da Human

TGF-β1

Promotores

através de

in silico

análise utilizando MatInspector (https://www.genomatix.de) encontramos seis locais putativos GLI ligação dentro do dois relataram

TGF-β1 humano

promotores, incluindo uma relatado anteriormente site dentro do segundo promotor [28], além de cinco locais que foram previamente não identificado. Ambos os programas de software Genomatix e UCSC genoma (www.genome.ucsc.edu) indicam um elevado grau de conservação da sequência em torno do

TGF-β1

região promotora em mamíferos o que sugere a importância funcional do humano

TGF -β1

promotores. A sequência de ligação de consenso para os factores de transcrio GLI foi identificado como 5′-TGGGTGGTC-3 ‘[29], [30]. Os seis sítios de ligação putativos GLI relatados neste estudo tem um alto grau de semelhança da matriz

43 e estão listados na Figura 1. A abundância de possíveis sítios de ligação GLI dentro dos primeiros mil pares de bases do local de início da transcrição da

TGF-β1

promotor sugere que esta região promotora proximal pode ser regulada pelos fatores de transcrição GLI.

Gli2 Activa o primeiro ser humano

TGF-β1

promotor através de pelo menos dois dos os Sites putativo GLI vinculativos

o local de ligação GLI putativa no segundo promotor de TGF-1 tem sido relatada a ser não-responsivos à estimulação SHH por Eichenmuller

et al.

[28]. No entanto, os cinco locais putativos no primeiro promotor não foram previamente relatado para ser regulada por proteínas GLI. Utilizou-se uma construção repórter contendo os primeiros 500 pares de bases do promotor de TGF-β1 humano que foi colocada a montante do gene da luciferase do pirilampo por Kim

et ai.

(PhTG5) [18]. Este vector de expressão foi co-transfectado para células 293T, juntamente com um activador constitutivo GLI construir pGLI2ΔN [26] ou de um plasmídeo pcDNA3 de controlo para avaliar a regulação mediada por Gli2 do promotor do gene de TGF-β1 humano.

A humano

TGF-β1

região promotora foi colocado num vector de luciferase pGL3-basic. (A) Os três sítios de ligação GLI dentro desta região (Sites A, B, e C) foram mutados separadamente ou em conjunto (WT = tipo selvagem

TGF-β1

promotor phTG5, MUT-A = site A mutação , MUT-B = sites de B /C mutação, MUT-A /B = locais Uma mutação /B /C, pGL3 = vector de controlo). Estas

TGF-β1

promotor: construções de luciferase foram co-transfectados para células 293T com o activador constitutivo GLI (GLI2dN) e normalizada para o controlo negativo (pcDNA3). O activador GLI induziu um aumento de quatro vezes da actividade da luciferase em phTG5 em relação ao controlo. A mutação de ambos sítios de ligação GLI (phTG5AB) anulou esta indução (n = 10, p = 0,0011 *, ** p = 0,0033). (B) O putativo GLI vinculativo Site E foi mutado na phTG1 plasmídeo repórter (WT = tipo selvagem TGF-1 promotor phTG1, MUT-E = local do E mutação, pGL3 = vector de controlo). O activador GLI induziu um aumento de seis vezes da actividade da luciferase em phTG1 em relação ao controlo. A mutação de GLI vinculativo Site E diminuiu esta indução quase duas vezes (n = 12, *** p = 0,0025).

Na sequência de co-transfecção de GLI2ΔN e phTG5 em células 293T, observamos um aumento de aproximadamente 4 vezes da expressão da luciferase sobre os controlos (Figura 2). Dado que as regiões do promotor de phTG5 contém três dos seis locais de ligação putativos GLI (A, B, C), utilizou-se mutagénese dirigida ao local de mutação estes GLI putativo locais de ligação individualmente ou em combinação (denotado phTG5A, phTG5B, e phTG5AB respectivamente ). Embora a mutação de um único local apenas modestamente reduzidos de expressão de luciferase, a mutação de ambos os locais de redução da expressão do gene repórter para baixo para níveis de controlo. Estes resultados indicam que Gli2 pode activar a transcrição em

TGF-β1

promotor humano e que a ligação de pelo menos um destes locais é necessário para que isto ocorra. A mutação no local do E, que fica a montante do sítio de iniciação da transcrição, foi feito para avaliar o seu papel na expressão de TGF-β1 induzida por Gli2. Utilizou-se uma construção repórter de luciferase phTG1 contendo -1362 a 11 bases perto do local de início da transcrição do promotor de TGF-β1 humano [18]. Seguindo mutação do local possível GLI-ligação, a expressão da luciferase foi reduzida de aproximadamente duas vezes a seguir a co-transfecção com o activador Gli2 constitutiva. Outras análises serão necessários para examinar se noutros locais que não os locais de ligação putativo GLI A, B e E também são funcionais.

Naïve humano CD4

+ células T foram isoladas por selecção negativa e infectado com um lentivírus contendo uma construção activador GLI2ΔN ou um controlo de GFP. 72 horas após a infecção, RNA celular foi recolhido para medir

TGF-p 1

transcrições. (A) Relativa

TGF-β1

ARNm foi medido por RT-PCR e normalizada para o rRNA 18S.

TGF-β1

ARNm foi significativamente aumentada (N = 6, * P = 0,0313) em células infectadas com GLI2ΔN em comparação com células de controlo infectadas com GFP. (B) A eficiência da infecção foi medida a 69% usando uma GFP expressando lentivírus controlo. (C D) O fenótipo das células CD4 naïve

+ células T foi maior do que 95% das células no dia 0 foram CD4

+ CD45RA

+ CD45RO

– células T naive. Expressão de GLI2ΔN foi confirmada por Western Blot (inserção).

Gli2 ativado pode melhorar

TGF-β1

Transcrição em Naïve CD4

+ células T

a fim de investigar o efeito dos factores de transcrição GLI em células primárias, que infectado primário naïve CD4

+ células T com vectores lentivirais que contêm a GLI2ΔN activador constitutivo ou um controlo de GFP. Expressão de GLI2ΔN foi confirmada por Western blot (ver inserção na Figura 3). Naïve CD4

células T + não constitutivamente expressam altos níveis de TGF-β1. Mediu-se o nível de

TGF-β1

ARNm por RT-PCR antes e após a infecção com as construções de GLI. Como mostrado na Figura 3A, a sobre-expressão do GLI2ΔN constitutivamente activada na naïve CD4

+ células T aumentou significativamente

TGF-β1

expressão de ARNm (n = 6, p = 0,0313) após estimulação com aCD3 /αCD28- contas revestidas. A sobre-regulação de

GLI1

ARNm, um gene mediada por Gli2 conhecidas, indica que a proteína é GLI2ΔN activadora da transcrição nestas células lentivirally infectadas (dados não mostrados). A eficiência da infecção foi medida através da infecção de

+ células T CD4 + naive com um lentivírus controlo expressando GFP (eficiência de infecção de 69%, a Figura 3B). O fenótipo das células naive foi CD4

+ CD45RA

+ CD45RO

– (Figuras 3C 3D).

CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ Treg foram enriquecidas a partir de PBMC e em seguida incubadas durante 72 horas com não-alvo (NT) ou

Gli2

siRNA. As células foram depois estimuladas (1 oCD3 /αCD28 grânulo: 1 célula) durante um adicional de 24 horas. RT-PCR foi utilizada para medir

TGF-p 1

os níveis de mRNA. Relativa

TGF-β1

ou

GLI1

mRNA foi normalizado para 18S rRNA. (A)

Gli2

knockdown no Treg diminuiu significativamente

TGF-β1

transcrição (n = 7, * p = 0,0189). (B)

GLI1

mRNA também foi medido como um gene regulado por Gli2 controle; mostrando que knockdown de

Gli2

em Treg também diminuiu

GLI1

mRNA (n = 5, ** p = 0,0278). (C) A sequência do

Gli2

siRNA foi mexidos (SCRAM) como um adicional de

Gli2

controle siRNA negativo e não foi significativamente diferente do controle não-alvo.

Regula Gli2

TGF-β1

Transcrição na Primária CD4 humano

+ CD25

oi Treg

Embora a superexpressão de proteínas transgênicas GLI pode modular

TGF-β1

transcrição em naïve CD4

células T +, queríamos avaliar o papel fisiológico da ativação Gli2 em células primárias que expressam elevados níveis de TGF-β1. Estudos anteriores têm usado siRNA para knockdown genes específicos em Treg principal [31], [32]. Knockdown de

Gli2

foi feito usando comercialmente disponível Dharmacon ACCELL siRNA para avaliar a sua função na transcrição TGF-β1 em Treg humana primária.

Gli2

siRNA knockdown no ensino primário humano CD4

+ CD25

oi Treg estimulados com oCD3 /αCD28 esferas revestidas diminuiu a expressão de

TGF-β1

mRNA por aproximadamente 5 vezes ( Figura 4A, p = 0,0189). Para avaliar a actividade knockdown de Gli2,

GLI1

expressão de ARNm foi medido por RT-PCR.

GLI1

transcrição do gene é um alvo a jusante conhecidos do fator de transcrição ativado Gli2. A expressão diminuída de

GLI1

mRNA apoia o knockdown mediado por siRNA de

Gli2

(Figura 4B, p = 0,0278). Um controle negativo independente e separada utilizando um mexidos

Gli2

sequência siRNA (5’AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 ‘) foi usado para sanar os efeitos fora do alvo (Figura 4C). Estes resultados indicam que Gli2 é importante na regulação

TGF-β1

transcrição in Treg humana primária. O Treg classificadas foram CD3

+ CD8

-CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ células T. A pureza do Treg foi mais do que 85% (Figura 4D).

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) foi feito para avaliar a ligação de Gli2 ao

TGF-β1

promotor humano. Primária humana CD4 regulamentar

+ CD25

oi células T foram negativamente isolados e estimulados com oCD3 /contas αCD28-revestidas durante a noite. O PCR foi feito para avaliar Gli2 ligação. ADN total foi utilizado como um controlo positivo para a PCR. Gli2 ligado ao

promotor TGF-β1 Restaurant at ‘Site E’ no

TGF-β1

promotor humano. Gli2 não se liga a uma região não-alvo no ser humano

IL-10

promotor (pista 8).

Gli2 se liga ao Human

TGF-β1

promotor

a cromatina imunoprecipitação (CHIP) foi feito para avaliar a ligação de Gli2 ao

TGF-β1

promotor humano. Primária humana CD4 regulamentar

+ CD25

oi células T foram negativamente isolados e estimulados com oCD3 /contas αCD28-revestidas durante a noite. O Treg estimulados foram incubados com esferas de agarose revestidas com anticorpos de controlo ou αGLI2 αIgG. Como mostrado na Figura 5, Gli2 ligado ao

TGF-β1

promotor. A ligação Gli2 foi mostrado ser a ‘Site E’ (Figura 5)

TGF-β1

promotor humano. No entanto Gli2 não se liga a uma região não-segmentação no humano

IL-10

promotor (pista 8).

Co-imunoprecipitação foi usada para testar a ligação de HIV-1 Tat Gli2 humano. transfections duplos foram realizados em células 293T (combinações de plasmídeos mostrado à direita) para expressar a Tat-FLAG e proteínas GLI2-6xMYC (pcDNA3 = vazio vetor de controle). Grânulos (A) foram revestidas com anticorpo anti-FLAG e incubada com lisados ​​celulares de transf ecções # 1-3 mostrados no lado direito. Após os passos de lavagem e de eluição, a proteína ligada foi corrida num gel de SDS-PAGE seguido por Western blotting para avaliar Gli2 ligação. O anticorpo anti-myc foi usada para confirmar a ligação de Gli2 para Tat quando Tat foi ligado ao cordão. (B) As esferas foram revestidas com anticorpo anti-myc e incubada com lisados ​​celulares de transf ecções # 1-3 mostrados no lado direito. Após os passos de lavagem e de eluição, a proteína ligada foi corrida num gel de SDS-PAGE e Western Blotting foi feito para olhar para a ligação do HIV-1 Tat. Bandas desenvolvido a aproximadamente 27 kDa. anticorpo anti-bandeira foi usada para confirmar a ligação de Tat para Gli2 quando Gli2 estava ligado ao cordão.

HIV-1 Tat Vinculado ao Gli2

Aumento plasma e líquido cefalorraquidiano ( CSF), os níveis de citocinas imunossupressoras como TGF-β1 são encontrados durante o HIV-1 a progressão da doença [8] – [10], que conduz a um aumento na iTreg [11], [12]. O HIV-1 e proteína virai transactivadora Tat tem sido implicado como o indutor do TGF-β1 em ambos

in vitro, bem como

In vivo

modelos [13] – [17]. Embora Tat tem sido demonstrado que o aumento de TGF-β1, o mecanismo subjacente transcricional ainda não foi claramente definido.

Uma vez que descobrimos que Gli2 regula TGF-β1 ao nível da transcrição, foi testado se liga o HIV-1 Tat para Gli2 humana e pode, assim, aumentar ou estabilizar a transcrição de TGF-β1 usando co-immunopreciptation (co-IP) para avaliar a ligação de Gli2 humano para o HIV-1 Tat. transfections duplos foram realizados em células 293T com três diferentes conjuntos de plasmídeos: (GLI2-6xMYC + HIV-1 Tat-bandeira), (GLI2-6xMYC + pcDNA3 controle), (controlo pcDNA3 HIV-1 Tat-FLAG +). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lisadas e as proteínas libertadas foram recolhidas para co-IP (Kit Pierce Co-IP a partir de Thermo Scientific). A resina de agarose foi revestido com uma de três anticorpos: anticorpo Sigma F1804 M2 anti-FLAG (Tat para se ligar a talão), anticorpo 71D10 anti-myc CST (Gli2 para se ligar ao grânulo), ou um anticorpo de controlo de isotipo. Após co-IP, as eluições foram corridas num gel de SDS-PAGE seguido por Western Blotting. Como mostrado na Figura 6, o HIV-1 Tat ligou-se especificamente a Gli2 que foi ligado a um grânulo. A reacção inversa também mostrou especificidade, o que indica que estas duas proteínas pode, de facto interagir. A ligação de HIV-1 Tat para Gli2 sugere um potencial mecanismo para a indução de TGF-β1 em VIH-1. Outras experiências vai precisar de ser feito para testar a sinergia funcional do HIV-1 Tat e Gli2 de afectar a transcrição no promotor de TGF-β1.

Discussão

Os nossos resultados mostram que o factor de transcrição Gli2 desempenha um papel previamente desconhecido, mas importante na regulação transcricional complexo de

TGF-β1.

Através

in silico

análise de despistagem que revelou seis locais de ligação GLI potenciais no promotor TGF-β1 humano , cinco das quais eram desconhecidas. Usando a análise mutacional do humano

TGF-β1

promotor, descobrimos que aumenta Gli2

TGF-β1

transcrição em pelo menos três dos cinco sítios de ligação putativos GLI (Sites A, B, e). Além disso, nossos resultados mostram que a infecção da principal naïve CD4

células + T (TGF-β1 baixo células que expressam) com um constitutivamente ativos aprimora Gli2 lentivírus

TGF-β1

transcrição. Além disso, siRNA knockdown de

Gli2

em humanos primária CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ Treg (alta TGF-β1 células que expressam) diminuiu significativamente

TGF-β1

transcrição . Mostramos também pelo chip que Gli2 se liga diretamente ao “Site E” no promotor

TGF-β1

. Este mecanismo de regulação TGF-β1 mediada por Gli2 recém-identificados podem ter implicações em doenças como câncer e AIDS, onde altos níveis de TGF-β1 contribuir para a patogênese.

Embora o papel da regulação GLI-mediada da

TGF-β1

transcrição não tenha sido previamente mostrado, existe evidência indirecta para este mecanismo. Eichenmuller

et al.

Descobriu que

Ptch1

camundongos knockout, que têm ativação constitutiva da via SHH, tem mais de 400 vezes maiores níveis de

TGF-β1

mRNA transcrições [28]. Embora os investigadores concluíram que o sítio de ligação putativo GLI no segundo promotor não era responsivo a GLI1, eles não investigou o papel de Gli2 na regulação dos cinco locais de ligação putativos GLI que descobrimos no primeiro promotor TGF-β1.

Além disso, vários relatórios de enfatizar a relação estreita entre o TGF-β1 e famílias SHH /GLI [33], [34]. Liu

et ai.

Relataram a interacção entre a molécula via SHH Gli3 e as proteínas (factores SMAD via de TGF-β1 transcrição) [35]. Além disso Dennler

et ai.

Relatado que Gli2 e GLI1 poderia ser induzida por meio de um mecanismo mediado por SMAD [36]. Os genes da superfamília TGF-β

BMP-2, 4

,

7

todos têm elementos GLI-responsivos em seus promotores [37] – [39]. Lin

et al., Achou um elemento SHH-reactivo na região promotora 5 ‘a montante do

TGF-β2

[40].