Abstract

Apesar dos recentes avanços no tratamento de câncer de cólon humano, a eficácia da quimioterapia contra o cancro do cólon é ainda insatisfatória. No presente estudo, os efeitos de inibição concomitante do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e DNA metiltransferase foram examinados em células de cancro do cólon humano. Foi demonstrado que a decitabina (um inibidor da metiltransferase de ADN) em sinergia com gefitinib (um inibidor de EGFR) para reduzir a viabilidade das células e formação de colónias em células SW1116 e LOVO. No entanto, a combinação dos dois compostos apresentaram uma toxicidade mínima para as células NCM460, uma linha celular epitelial humana normal da mucosa do cólon. A combinação também foi mais eficaz na inibição da /mTOR /S6 cinase AKT. Além disso, a combinação de decitabina com gefitinib marcadamente inibiu a migração de células do cancro do cólon. citotoxicidade induzida por decitabina Além disso, gefitinib sinergicamente aumentada foi devido principalmente a apoptose como mostrado pela rotulagem anexina V, que foi atenuada por Z-VAD-fmk, um inibidor da caspase panela. Concomitantemente, a apoptose das células resultantes da co-tratamento de gefitinib e decitabina foi acompanhada pela indução de Bax, caspase 3 clivada e PARP clivada, juntamente com a redução de Bcl-2 em comparação com o tratamento com qualquer um dos fármacos sozinhos. Curiosamente, o tratamento combinado com estes dois fármacos aumentaram a expressão de XIAP-associado um elemento (XAF1), que desempenham um papel importante na apoptose celular. células cancerosas do cólon Além disso, a depleção pequeno ARN interferente (siRNA) de XAF1 atenuou significativamente a apoptose induzida pela combinação das duas drogas. Nossos achados sugerem que gefitinib em combinação com decitabina exercida apoptose celular aumentada em células de câncer de cólon foram envolvidos na via mediada por mitocondrial e indução da expressão XAF1. Em conclusão, com base nas observações de nosso estudo, sugeriu que a administração combinada destas duas drogas pode ser considerado como um novo esquema terapêutico para o tratamento de câncer de cólon

Citation:. Lou Yf, Zou Zz, Chen Pj , Huang Gb, Li B, Zheng dq, et ai. (2014) Combinação de gefitinib e DNA metilação Inhibitor decitabina Exerce sinérgica Anti-Cancer Atividade em células de cancro do cólon. PLoS ONE 9 (5): e97719. doi: 10.1371 /journal.pone.0097719

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de janeiro de 2014; Aceito: 23 de abril de 2014; Publicado em: 29 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado pelo Fundo South China normal University ciência para Jovens Pesquisadores (Grant No. 13KJ19 com Zheng Zhi-Zou), o Bureau of Dongguan ciência e Tecnologia da cidade 2,010 chave Fundo do projeto (Grant No. 201028 para Xiao-yong Luo). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do cólon é um dos tumores mais comumente ocorrem e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, o que acentua a necessidade de estratégias eficazes para prevenir e tratar esta doença maligna. As terapias disponíveis para o tratamento de cancro do cólon incluem cirurgia, radioterapia, quimioterapia, terapia de imunomodulação, e as terapias orientadas molecularmente tais como anti-vascular receptor do factor de crescimento endotelial (VEGFR) e terapia de receptor do factor de crescimento anti-epidérmico (EGFR) [1], [ ,,,0],2]. Entre estes tratamentos molecularmente segmentados, terapia alvo EGFR como uma das estratégias clínicas importantes tem sido cada vez mais amplamente aplicado em pacientes com cancro do cólon metastático [3].

EGFR é uma glicoproteína transmembranar com um domínio extracelular de ligação ao EGF e uma região intracelular contendo o domínio de cinase de tirosina que regula as vias de sinalização que controlam a proliferação celular, diferenciação, drogas e radiação sensibilidade, e a angiogénese [4]. A expressão de um elevado nível de EGFR tem sido encontrado em vários tipos de cancros humanos, incluindo o cancro do cólon, cancro gástrico, cancro do pulmão, cancro da mama, e carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Superexpressão e ativação constitutiva do EGFR têm sido associados a um mau prognóstico em pacientes com câncer de cólon. Como a ativação do EGFR está correlacionada com a progressão do cancro do cólon, o EGFR tem sido alvo dos esforços de desenvolvimento de drogas anticâncer. Estas estratégias de segmentação de EGFR incluem o uso de anticorpos monoclonais tais como cetuximab, e inibidores moleculares pequenos tirosina-cinase (TKI), tais como gefitinib e erlotinib. Gefitinib é uma anilinoquinazolina sintético oralmente activo e selectivo de EGFR-TKI que bloqueia a via de transdução de sinal envolvida na proliferação e sobrevivência de células cancerosas. Num cenário clínico, a tratamento com gefitinib foi aprovado para vários tipos de cancro, incluindo o cancro do cólon [11]. No entanto, a experiência clínica emergente tem desanimadoramente revelaram que, apesar de alguns gefitinib que demonstram actividade anti-tumor no cancro do cólon, há um elevado nível de

de novo

resistência a tal tratamento [12]. Assim, os esforços estão em curso para o desenvolvimento de regimes anti-cancro do cólon que combinam gefitinib com outras drogas.

modificações Epigenetic, principalmente a metilação do DNA e histonas acetilação, são agora reconhecidos como os principais mecanismos que contribuem para fenótipos de tumor malignas [13]. Como consequência, vários fármacos que afectam as vias epigenética ter sido aprovado para o tratamento do cancro e mais estão actualmente em ensaios clínicos [14], [15]. Notavelmente, a reversibilidade das modificações epigenéticas por inibidores de pequenas moléculas significa que não os efeitos de destino deve ser mínima e reversíveis com a interrupção do tratamento. Recentemente, os inibidores da DNA metiltransferase estão em um estágio mais avançado de desenvolvimento clínico do que os inibidores de desacetilases de histonas ou metiltransferases histonas, tendo sido extensivamente testado em fase I-III de ensaios clínicos [16]. A decitabina inibidor da metiltransferase de ADN arquétipo (isto é, 5-aza-2′-desoxicitidina), um análogo de desoxirribose 5-azacitidina, é actualmente usado para tratar a síndrome mielodisplásica (SMD), e está sob investigação para o tratamento de leucemia mielóide aguda (LMA) e outro tipo de cancro sólido [17], [18]. Além disso, a decitabina e ácido suberanilohidrox�ico (SAHA, um inibidor da histona deacetilase) cooperar para sensibilizar células cancerígenas do cólon para Fas apoptose induzida pelo ligando [19].

Atualmente, grandes esforços têm sido feitos para desenvolver algumas terapias anticâncer com base em as pequenas moléculas que visam especificamente a proteína demetilante DNA ou EGFR, que, não muito informações se sabe sobre os efeitos combinados de inibidores de EGFR e agentes Desmetilantes em câncer de cólon. Estudos anteriores mostraram gefitinib poderia diminuir a resistência à quimioterapia por inibição transportadores transmembranares da família ABC, incluindo a P-glicoproteina (P-gp), a proteína de resistência a múltiplas drogas 1 (MRP1) e a proteína de resistência do cancro da mama (BCRP) [20]. Com base nessas premissas, decidimos determinar se a combinação de gefitinib e decitabina tem atividade sinérgica em células de câncer de cólon.

No estudo atual, nós fornecemos dados pré-clínicos que mostraram que a combinação de gefitinib e decitabina foi sinérgico na inibição da proliferação celular, migração e indução de apoptose em células de cancro de cólon humano em cultura. Além disso, desde que as evidências de que gefitinib combinados com decitabina regulada apoptose das células estavam envolvidos na via mediada por mitocondrial e indução da expressão XAF1. Tomados em conjunto, estes dados acumulando podem orientar o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer de cólon.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e Reagentes e Drogas Tratamento

As linhas celulares derivadas de cancro do cólon SW1116 e LOVO foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em meio DMEM (GIBCO; Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS) (GIBCO; Life Technologies, Carlsbad, CA) a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. As células foram cultivadas em monocamada e passados ​​rotineiramente 2-3 vezes por semana. decitabina e gefitinib foram adquiridos a Selleck Chemicals LLC (Houston TX, EUA). MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio], dimetil sulfóxido (DMSO), Z-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (Z-VAD-FMK), necrostatin-1 , necrostatin-5 foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, EUA). Para o tratamento de drogas, decitabina, gefitinib, z-VAD-fmk, necrostatin-1, e necrostatin-5 foram dissolvidos em DMSO, respectivamente, armazenaram-se aliquotas a -80 ° C. As soluções de reserva foram diluídas para as concentrações finais pretendidas com meio de cultura imediatamente antes da utilização. Antes do tratamento com a droga, as células foram incubadas durante pelo menos 12 h e depois substituído com meio contendo droga; As células tratadas com DMSO foram utilizados como um controlo simulado.

A viabilidade celular, sobrevivência clonogénica celular e apoptose Ensaios

A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTT padrão. Resumidamente, as células foram plaqueadas a uma densidade de 0,5-1 × 10

4 culas por po em placas de 96 poços e incubadas durante 12 h numa co 5%

2 atmosfera a 37 ° C antes de tratamento exposto a drogas. Os meios foram então removidos, e as células foram tratadas com a decitabina e /ou gefitinib. Depois as células foram incubadas durante 48 h, 100 mL de soluções de MTT (2 mg /mL) foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada durante mais 4 h a 37 ° C. Os cristais de formazano formados foram dissolvidos em DMSO (200 uL por poço) com agitação constante durante 5 min. A absorvância da solução foi então medida utilizando um leitor de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA) a 495 nm. Este ensaio foi realizado em triplicado

Para as experiências de sobrevivência de células clonogénicas, as células ligadas da mesma placa de cultura de 10 centímetros que foram tripsinizadas com 1 ml de tripsina-EDTA. (Gibco; Life Technologies, Carlsbad, CA) e inactivada com meios contendo 10% de FBS. As células foram contadas utilizando um hemocitómetro e plaqueadas a uma densidade baixa (1000 por poço em seis placa poço). Após 24 h, as drogas foram adicionadas a concentração indicada durante 24 h. Após a remoção fármacos, as células foram deixadas a proliferar numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2, ambiente de 37 ° C durante 15 dias em meio fresco. As células foram fixadas em etanol a 70% e coradas com violeta de cristal de 0,005% (Sigma, St. Louis, MO, EUA) para análise de sobrevivência de células clonogénicas, como previamente descrito [21]. O unidades formadoras de colónias com mais de 100 células foram contadas utilizando um microscópio de luz.

Medição de apoptose foi realizada por anexina V-FITC (isotiocianato de fluoresceína) /PI (iodeto de propidio) análise como descrito anteriormente [22]. Resumidamente, as células foram semeadas e tratadas com as drogas durante 48 h. Depois, as células foram lavadas duas vezes com PBS e 1 x 10

6 as células foram ressuspensas em 1 mL de 1 × tampão de ligação a Anexina V. Células que sofrem morte celular apoptótica foram analisados ​​pela contagem das células que coraram positivas para a Anexina V-FITC e negativamente para PI, e fase tardia da apoptose como anexina V-FITC e PI positiva usando fluxo FACS Calibur citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA , EUA).

Índice combinação

para o tratamento combinado de decitabina e gefitinib, os dados do ensaio de MTT foram convertidos em fracção de crescimento afectados pela droga indivíduo ou as células tratadas de combinação em comparação com células não tratadas e analisados ​​usando o software CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, MO, EUA) para determinar se a combinação era sinérgica. Este programa baseia-se na equação Chou-Talalay [23], que calcula um índice de combinação (IC). A equação geral para o isobolograma clássico é dada por: CI = (D)

1 /(Dx)

1 + (D)

2 /(Dx)

2. Onde Dx indica a dose de um composto sozinho necessária para produzir um efeito, (D)

1 e (D)

2 são as doses de compostos 1 e 2, respectivamente, necessárias para produzir o mesmo efeito em combinação. A partir desta análise, os efeitos combinados dos dois compostos podem ser resumidas da seguinte forma: CI 1, CI = 1, CI 1 indicam sinérgico, aditivo e antagónicos efeitos, respectivamente

Western Análise Blot

.

As células foram lisadas em gelo durante 30 min em tampão de lise (Tris-HCl a 50, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de SDS, 0,5% de ácido desoxicólico, 0,02% de azida de sódio, 1% de NP-40, 2,0 mg /ml de aprotinina, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM). Os lisados ​​foram centrifugados a 12000 rpm durante 30 min a 4 ° C. A concentração de proteína foi determinada pelo método de corante de Bradford. Quantidades iguais (30 a 60 ug) de extracto de células foram submetidas a electroforese em 6-12,5% de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para membranas de PVDF (Millipore, Darmstadt, Alemanha) por blotting anticorpo. As membranas foram bloqueadas e depois incubadas com p-mTOR (Ser2448), mTOR, AKT1, PARP p-AKT (Ser473), p-S6K, S6K, Bax, Bcl-2, caspase 3 clivada (Asp175), clivado (Asp214) e anticorpos de actina (todos da sinalização celular Technologies, Massachusetts, EUA). E os anticorpos XAF1, XIAP foram adquiridos a Abcam (Cambridge, R.U.). Subsequentemente, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP (Proteína Tech Group, Chicago, IL), à temperatura ambiente durante 1 h. A detecção foi realizada com o kit ECL (GE Healthcare; Munique, Alemanha)., De acordo com as instruções do fabricante

Ensaio de Actividade de Caspase

ensaios fluorométricos de actividade de caspase foram realizadas usando o substrato Ac -DEVD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) para a caspase 3 e Ac-IETD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) para a caspase 8. Resumidamente, as células foram lisadas em tampão de lise (10 mM de HEPES, 142 mM KCl, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, 0,2% de NP-40 e pH 7,2) com DTT 10 mM. A seguir à incubação durante 30 min em gelo, as amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm durante 30 min a 4 ° C e o teor de proteína no sobrenadante foi determinada pelo método de corante de Bradford. Alíquotas de 10 mg volume de ensaio /100 mL foram incubadas com 140 mM de tetrapéptido site-specific substratos Ac-DEVD-AMC para a caspase 3 e Ac-IETD-AMC para a caspase 8 num tampão de ensaio de caspase (HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, 1 mM de EDTA, 0,01% (w /v) de CHAPS, 10% (w /v) de sacarose e o pH 7.2) com DTT 10 mM durante 30 min. A libertação do grupo fluorogénico AMC foi determinada a 37 ° C num VersaFluor Fluorómetro (Bio-Rad, Hercules, CA) com excitação a 380 nm e emissão a 440 nm.

RNA de interferência

pequeno ARN interferente (siRNA) para a expressão do gene XAF1-regulação para baixo foi feito por transfecção de oligonucleótidos de ARN com lipofectamina 2000 (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Um dia antes da transfecção, as células SW1116 e LOVO foram plaqueadas numa placa de cultura de 35 mm em meio RPMI-1640 completo. Após as células atingiram 50% -60% de confluência, elas foram transfectadas com ARNsi como previamente descrito [24]. Resumidamente, as células foram colocadas em 1 mL de siRNA mistura com 100 nM de ARNsi e 5 uL de lipofectamina 2000. Após 8 h de transfeco, 1 mL de meio RPMI-1640 completo foi adicionado, e as experiências foram realizadas 48 horas após a transfecção. Os níveis de proteína foram analisados ​​por Western blot. O controle negativo (NC) siRNA e siRNA contra XAF1 foram sintetizados por Shanghai GenePharma Co. Para XAF1: 5’AUGUUGUCCAGACUCAGAG-3 ‘[25];

Extração de RNA total e em tempo real quantitativa transcrição reversa PCR

o ARN total foi extraído com Reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi preparado a partir de ARN total utilizando iniciadores aleatórios (Promega, Madison, EUA) e o kit de Omniscript RT (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). Os níveis relativos de ARNm foram determinados por reversa em tempo real quantitativa de transcrição-PCR (RT-PCR) utilizando um Eppendorf Mastercycler Realplex (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) e kit de Quantitect SYBR Green PCR (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). XAF1 sequências de iniciadores utilizados foram os seguintes: 5′-ATGGAAGGAGACTTCTCGGT-3 ‘e 5′-TTGCTGAGCTGCATGTCCAG-3’ [26]. Actina (BioVision, Palo Alto, CA, EUA) foram utilizados níveis de mRNA para a normalização.

Estatísticas

Todos os experimentos foram repetidos três vezes e foram expressos como média ± SD.

valores P

foram calculados utilizando o teste e t de Student

P

valor 0,05 foi considerado significativo. A análise estatística foi analisada utilizando o programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) software (versão 16.0).

Resultados

sinérgicos antineoplásicos efeitos induzidos pela decitabina e Gefitinib em células cancerígenas do cólon

para determinar os efeitos do tratamento de combinação de decitabina inibidor da DNA metiltransferase e gefitinib inibidor de EGFR sobre a viabilidade celular de tumor do cólon humano, SW1116 [27] e células LOVO [28] realização de tipo selvagem

gene de EGFR foram expostas a

diferentes concentrações de decitabina ou gefitinib isoladamente ou em combinação para até 48 h, seguido pela determinação da viabilidade celular utilizando o ensaio de MTT. Como mostrado na Fig. 1A e B, a decitabina ou gefitinib isoladamente causou uma inibição dependente da concentração da viabilidade celular com IC

50 valores de 24,2 uM (decitabina) e 4,71 uM (gefitinib) em células SW1116 e IC

50 valores de 21,9 uM ( decitabina) e 5.33 uM (gefitinib) em células LOVO. Além disso, a Fig. 1A e B mostram que a combinação de decitabina e gefitinib teve um efeito inibidor mais forte sobre a viabilidade celular de células SW1116 e LOVO do que cada composto individualmente. Além disso, a Fig. 1A indicaram que o tratamento de células SW1116 com concentrações fixas de decitabina diminuiu o IC

50 valores de gefitinib de 4,71 uM (na ausência de decitabina) a 1,25 uM (na presença de 5 uM decitabina) e 0,19 m (na presença de 10 uM decitabina). Da mesma forma, o tratamento de células LOVO com concentrações fixas de decitabina diminuiu o IC

50 valores de gefitinib de 5,33 uM (na ausência de decitabina) a 0,63 uM (na presença de 10 uM decitabina) e 0,12 uM (na presença 20 uM de decitabina) (Fig. 1B).

(a) e (B) células SW1116 e LOVO foram cultivadas em condições de controlo (DMSO) ou na presença das concentrações indicadas de decitabina (DAC) e gefitinib (GEF), sozinho ou em combinação, durante 48 h, e, em seguida avaliadas quanto a viabilidade por ensaio MTT. Os resultados são médias das avaliações duplicadas de um em cada três experimentos independentes. (C) e (D), as células SW1116 e células LOVO foram plaqueadas, tratada, e processado como em A e B. A curva de dose-resposta de cada fármaco foi determinada e o índice de combinação (IC) de valores para as proporções de concentração de DAC /(2,5 GEF :1 em células SW1116, 2:01 em células LOVO) foram calculados de acordo com o método de Chou-Talalay no ponto de tempo de 48 h, com a resposta biológica a ser expressa como a fracção de células afectadas. símbolo de retângulo e símbolo de losango designar o valor CI para cada fracção afectada (efeito). CI 1, CI = 1, CI 1 indicam sinérgico, aditivo e antagónicos efeitos, respectivamente. O efeito varia de 0 (nenhuma inibição) para 1 (inibição completa). Os dados são representativos de três experiências independentes. (E) Influência de células SW1116 e células LOVO sobre o número de células formadoras de colónias, tal como avaliado por um ensaio clonogénico. Para o ensaio de formação de colónia, o ensaio clonogénico foi feito como descrito em materiais e métodos. Colunas, com média de três determinações; Barras, DP. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. **,

P Art 0,01, ***,

P Art 0,001, em comparação com células tratadas com DAC. ##,

P Art 0,01, ###,

P

. 0,001, em comparação com células tratadas com GEF

Estes dados sugerem que a dois compostos, a decitabina e gefitinib, pode sinergizar para inibir a viabilidade das células em células do cancro do cólon. Para confirmar este sinergismo, que trataram células com uma combinação dos dois agentes numa razão constante de um para o outro e utilizado software CalcuSyn para calcular o índice de combinação (Cl) seguindo o método de Chou e Talalay, tal como descrito em Métodos. FIG. 1C e D revelou uma sinergia significativa entre os dois agentes (CI 1) em células SW1116 e LOVO. Além disso, por ensaio de sobrevivência de células clonogénicas, verificou-se que a decitabina e gefitinib exerceu efeitos sinérgicos para inibir a actividade de clonogénico SW1116 e células LOVO (fig. 1e). Além disso, as poucas células sobreviventes decitabina mais gefitinib gerado colónias que eram muito menor em tamanho do que os gerados por células sobreviventes qualquer um destes agentes por si só (dados não mostrados). Notavelmente, quando utilizados em conjunto, o tratamento de células NCM460, um cólon humano normal da mucosa linha celular epitelial, com decitabina e gefitinib mostrou um efeito maior do que quando cada composto foi utilizado individualmente, mas os efeitos são menos do que aditivo sugerindo antagonismo (Fig. S1A e B ). Além disso, a combinação de baixa concentração de decitabina (2,5 uM) e gefitinib (1 uM para células LOVO e 0,5 uM para células SW1116) migração de células de forma eficiente revogada de maneira sinérgica (Fig. S2A). Enquanto isso, foi detectada a viabilidade celular das células de cancro do cólon tratadas utilizando os dois agentes sozinhos ou em combinação (Fig. S2B), e verificou que a combinação de baixa concentração de decitabina e gefitinib não diminuiu significativamente a viabilidade celular. Estes resultados indicaram que a redução das células a migração causada por as duas drogas não estava envolvido na inibição da viabilidade celular.

A decitabina e Gefitinib Combinação de tratamento é mais eficaz na inibição de AKT e mTOR vias de sinalização em células cancerígenas do cólon

a decitabina e gefitinib inibiu significativamente o crescimento de dois tipos de células cancerígenas do cólon, em comparação com o tratamento com qualquer dos agentes isolados. Como AKT e vias de sinalização mTOR desempenhar um papel fundamental no crescimento celular e apoptose celular, foram determinados os efeitos de decitabina e gefitinib na activação destas vias. Calculou-se os valores de CI para encontrar ainda que a combinação de 10 uM decitabina com 5 uM de gefitinib em células SW1116 ou 4 mm de gefitinib em células LOVO foi o mais eficaz. células SW1116 e LOVO foram tratados com a decitabina e gefitinib isoladamente ou em combinação. Após 48 h, as células foram processadas por Western blot como descrito em Métodos. Como mostrado na Fig. 2A e B, a decitabina (10 uM) não pode conduzir a alterações significativas na actividade de AKT, ou de mTOR, tal como avaliado por Western blot para a fosforilação de AKT, mTOR e S6K. Além disso, observou-se reduções mínimas de fosforilação de AKT, mTOR e S6K com 5 mM gefitinib em SW1116 e 4 M em células LOVO. No entanto, a combinação das duas drogas completamente revogada actividades AKT e mTOR em SW1116 e células LOVO (Fig. 2A e B).

(A) e células SW1116 e LOVO (B) foram plaqueadas, tratou-se durante 48 h com decitabina (DAC) e gefitinib (GEF), quer isoladamente ou em combinação, e os níveis de AKT, mTOR, S6K expressão e fosforilação foram determinados por análise de Western blot, conforme descrito em Métodos. Expressão de β-actina serviu como um controlo de carregamento. Os dados são representativos de três experiências independentes.

decitabina Melhora sinergicamente apoptose em células de cancro do cólon induzida por Gefitinib

Para determinar se os efeitos citotóxicos de gefitinib combinados com decitabina foram devido à indução de apoptose, as células SW1116 e LOVO foram tratados com os dois compostos, isoladamente ou em combinação, durante 48 h e em seguida a célula a apoptose foi determinada por anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) a coloração e análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 3A e C, o tratamento com gefitinib (2 uM ou 5 uM) ou decitabina (10 uM) sozinho não teve efeitos fracos sobre a apoptose em células SW1116. No entanto, houve uma taxa de apoptose significativamente maior encontrados após tratamento com a combinação de tratamento com gefitinib e decitabina (Fig. 3A e C). Resultados semelhantes foram observados em células LOVO (Fig. 3B e C). Além disso, a apoptose de células foi medido através da detecção de populações sub-G1 com coloração de PI e analisa a citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. S3, as percentagens de populações sub-G1 induzidas pelos tratamentos com a combinação de dois fármacos foram maiores do que os induzidos pelos fármacos individualmente.

(A) e (B), SW1116 e células LOVO foram cultivadas em condições de controlo ( DMSO) ou na presença das concentrações indicadas de decitabina (DAC) e gefitinib (GEF), sozinho ou em combinação, durante 48 h. E, em seguida, as células foram coradas com iodeto de anexina V-FITC e de propídio (PI) e analisadas por citometria de fluxo. Este experimento foi realizado em triplicado e diagramas representativos dos ensaios de anexina V-FITC são mostrados. (C) A medição quantitativa do fluxo de anexina V-FITC citometria análises mostraram positivos células apoptóticas em resposta a DAC e GEF, sozinho ou em combinação. Colunas, quer dizer; Barras, DP. **,

P Art 0,01, ***,

P Art 0,001, em comparação com células tratadas com DAC. ##,

P Art 0,01, ###,

P Art 0,001, em comparação com células tratadas com GEF. (D) e células SW1116 e LOVO (E) foram pré-tratadas com 10 uM de Z-VAD-fmk (zVAD) ou 20 pM necrostatin-1 (Nec1) ou necrostatin-5 (Nec5) durante 1 h, seguida por tratamento com o As concentrações indicadas de DAC e GEF, sozinho ou em combinação, para mais 48 h. E, em seguida, as células apoptóticas foram determinados por anexina V-FITC /coloração de PI e análise de citometria de fluxo. Esta experiência foi repetida três vezes. Colunas, quer dizer; Barras, DP. **,

P

. 0,01

Para determinar se ou não gefitinib mais decitabina causada cascata das caspases, foi utilizado o pan inibidor da caspase z-VAD-fmk (10 mM) para pré-tratar as células SW1116 ou LOVO antes do tratamento de gefitinib mais decitabina. Como mostrado na Fig. 3D e E, z-VAD-fmk poderia notavelmente conter a apoptose celular induzida por gefitinib mais decitabina. No entanto, a apoptose celular desencadeada por os dois compostos em combinação não pode ser bloqueada por uma nova classe necrostatin-1 ou necrostatin-5, de pequenas moléculas inibidoras potentes da necrose celular. Estes resultados revelaram que a via apoptótica estava envolvido na morte celular induzida por gefitinib combinado com decitabina, em células de câncer de cólon.

decitabina e Gefitinib Terapia combinada altera os níveis de expressão de fatores regulatórios apoptose em células cancerígenas do cólon

Uma vez que a apoptose é fortemente regulada por membros pro- e anti-apoptóticas da família de proteínas Bcl-2, os factores pró-apoptóticos BAX, BID e BIM, bem como as proteínas anti-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-XL foram estudados em SW1116 e LOVO células após o tratamento com a decitabina ou gefitinib ou sua combinação por análise de Western blot. células SW1116 e LOVO que respondem a decitabina mais gefitinib manifestada maiores quantidades de BAX pró-apoptótica, assim como redução significativa nos níveis de proteína anti-apoptótica de Bcl-2 (Fig. 4A e B). No entanto, os dois compostos em combinação não conseguiu afectar os níveis de outros membros da família de proteínas Bcl-2, incluindo as proteínas pró-apoptóticas BID e BIM assim como a proteína anti-apoptótica de Bcl-XL (dados não mostrados) de expressão.

células SW1116 e LOVO foram plaqueadas, tratou-se durante 48 (DAC) e gefitinib (GEF), quer isoladamente ou em combinação. (A) e (B) os níveis de expressão de clivada da caspase-3 clivada, PARP-, XAF1, XIAP, Bax, Bcl-2 foram determinados por análise de Western blot, conforme descrito em Métodos. Expressão de β-actina serviu como um controlo de carregamento. Os dados são representativos de três experiências independentes. (C) e (D) A actividade da caspase 3 foi quantificada tal como descrito em Métodos. Esta experiência foi repetida três vezes. Colunas, quer dizer; Barras, DP. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001. (E) e (F) A actividade da caspase 8 foi quantificada tal como descrito em Métodos. Esta experiência foi repetida três vezes. Colunas, quer dizer; Barras, DP. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; ***,

P

. 0,001

inibidor da proteína de apoptose (IAP) é uma família de proteínas agindo através da inibição da atividade da caspase. O IAP ligada ao X (XIAP), um membro do IAP e XIAP-associado fator 1 (XAF1) foram examinados em células cancerígenas do cólon estimulados com decitabina juntamente com gefitinib. FIG. 4A e B indicam que não há mudanças nos níveis de proteína XIAP foram encontrados em células SW1116 e LOVO tratados por decitabina e gefitinib isoladamente ou em combinação. Nomeadamente, o tratamento combinado com ambos os fármacos aumentaram extraordinariamente a expressão de XAF1 em comparação com tratamento com agente único (Fig. 4A e B).

Para testar a capacidade de gefitinib combinado com decitabina para activar as caspases, caspase 3 clivada e clivada PARP foram estudados em células SW1116 e LOVO após o tratamento com gefitinib ou decitabina ou sua combinação por análise de Western blot. aumento significativo nos valores tanto de caspase 3 clivada e PARP clivada foram observados em células de cancro de cólon tratadas com duas drogas em combinação em comparação com o tratamento com agentes únicos (fig. 4A e B). Além disso, as células de cancro do cólon tratadas com os dois compostos foram analisados ​​para a caspase 3, caspase 8 e actividades de clivagem do substrato fluorogénico. Como mostrado na Fig. 4C e D, células cancerígenas do cólon tratadas com dois compostos em combinação apresentaram aumento significativo na actividade de caspase 3. Além disso, a decitabina mais gefitinib exercida caspase 3 induções de actividade dependente do tempo em células SW1116 e LOVO (Fig. 4C e D). Em contraste, nenhuma alteração foi encontrada em caspase 8 atividades (Fig. 4E e F).

XAF1 desempenha um papel crítico na Cellular apoptose desencadeada pela decitabina Combinado com gefitinib

Os dados mostrados acima indicado decitabina que combinado com gefitinib aumentou os níveis XAF1 em células SW1116 e LOVO. Em seguida, perguntou se as duas drogas em combinação poderia aumentar os níveis de mRNA XAF1 em células cancerígenas do cólon. Como mostrado na Fig. 5A e B, os níveis de ARNm XAF1 foram aumentadas significativamente por decitabina mais gefitinib. Além disso, células de cancro do cólon foram tratadas com os dois fármacos em combinação para intervalos de tempo diferentes. Nós mostramos que os níveis de proteína e ARNm XAF1 foram aumentados em mais decitabina gefitinib de uma forma dependente do tempo (Fig. 5C, D, E e F).

células SW1116 e LOVO (B) (A) e estavam tratadas durante 48 h com as concentrações indicadas de decitabina (DAC) e gefitinib (GEF), quer isoladamente ou em combinação. Os níveis de expressão de mRNA XAF1 foram determinadas por PCR em tempo real quantitativa. Expressão de β-actina serviu como controlo. Os dados são representativos de três experiências independentes. Colunas, quer dizer; Barras, DP. **,

P Art 0,01; **,

P Art 0,001. (C) e (D), SW1116 e células LOVO foram tratados durante os intervalos de tempo indicados com as concentrações indicadas de DAC e GEF em combinação. Os níveis de expressão XAF1 foram determinados por análise de Western blot, conforme descrito em Métodos. Expressão de β-actina serviu como um controlo de carregamento. Os dados são representativos de três experiências independentes. Como mostrado na Fig.