Abstract

α-Tomatina, um glycoalkaloid tomate, tem sido relatada a possuir antibiótico propriedades contra patógenos humanos. No entanto, o mecanismo da sua acção contra a leucemia permanece obscura. Neste estudo, o potencial terapêutico da α-tomatina contra células leucémicas foi avaliada

in vitro

e

in vivo

. A viabilidade celular experimentos mostraram que α-tomatina tinha efeitos citotóxicos significativos nas linhas celulares de cancro de leucemia humana HL60 e K562, e as células foram consideradas na fase de iodeto negativo Anexina V-positiva /propídio de morte celular. Além disso, α-tomatina induzida tanto HL60 e K562 apoptose celular numa célula e cycle- modo independente de caspases. α-Tomatina exposição levou a uma perda do potencial de membrana mitocondrial e esta constatação é consistente com o observado na activação da proteínas Bak e Mcl-1 forma curta (Mcl-1S). A exposição a ácido a-tomatina também provocou a libertação do factor de indução de apoptose (AIF) a partir das mitocôndrias para o núcleo e regulados negativamente a expressão de survivina. Além disso, α-tomatina inibiu significativamente o crescimento do tumor de xenoenxerto de células HL60, sem causar a perda de peso corporal em ratinhos imunodef iciência combinada grave (SCID). teste de imuno-histoquímica mostrou que o crescimento do tumor reduzido nos ratos tratados com α-tomatina foi um resultado do aumento da apoptose, o que foi associado com o aumento da translocação de FIA ​​no núcleo e a diminuição da expressão de survivina

ex vivo

. Estes resultados sugerem que α-tomatina pode ser um candidato para o tratamento da leucemia

Citation:. Chao MW, Chen CH, Chang YL, Teng CM, Pan SL (2012) α-Tomatina-Mediated actividade anti-cancro

In Vitro

e

In Vivo

através de celular Cycle- e Pathways Caspase-Independent. PLoS ONE 7 (9): e44093. doi: 10.1371 /journal.pone.0044093

editor: Ferenc Gallyas, Universidade de Pecs Medical School, Hungria

Recebido: 13 de fevereiro de 2012; Aceito: 30 de julho de 2012; Publicação: 06 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Chao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan (NSC 99-2320-B400-008-MY3) e (NSC 99-2628-B002-024-MY3). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

α-Tomatina é um glycoalkaloid encontrada no tomate (

esculentum

). Ele foi isolado pela primeira vez por Fontaine

et ai

, e verificou-se ser abundante em tomates verdes imaturos (500 mg α-tomatina /kg de frutos frescos) [1]; No entanto, é em grande parte degradada como tomates amadurecem (5 mg /kg) [2]. Os efeitos antibióticos e imunológicas de α-tomatina foram relatados [3], [4]. α-Tomatina também exibiu actividade anti-apoptótica proliferativa e através de inactivação da phosphoinostide 3-quinase (PI3K) /Akt, ou factor nuclear (NF) activação -κB em linhas celulares de tumores sólidos, tais como células do fígado, do cólon, do pulmão e do cancro [1], [5], [6]. No entanto, o papel de α-tomatina em células leucémicas permanece desconhecida.

leucemia, que é a neoplasia hematológica comum, que é um tumor maligno que afecta as células precursoras do sangue na medula óssea. células sanguíneas imaturas ou incompletamente diferenciadas acumulam na medula óssea e substituir as células sanguíneas normais. Nos últimos anos, as taxas de incidência e de mortalidade por leucemia têm aumentado e quimioterapia tem sido a principal estratégia adotada para o tratamento e cura de leucemia. No entanto, o tratamento mais eficaz e definitiva para a leucemia foi o transplante de medula óssea. No entanto, devido à elevada taxa de recorrência de leucemia, a baixa taxa de sucesso do transplante de medula óssea, a falta de opções de quimioterapia altamente selectivos, e os efeitos adversos graves de ambas as abordagens de tratamento, os investigadores continuam a procurar e desenvolver drogas que sejam mais selectivos e menos tóxicos para o tratamento eficaz de leucemia [7].

a apoptose é um tipo de morte celular programada e da cascata apoptótica pode ser iniciado por duas vias principais, intrínsecas e extrínsecas vias [8]. A via intrínseca, também chamado via mitocondrial, pode desencadear citocromo

C

libertação das mitocôndrias. A via extrínseca, também chamada a via do receptor de morte, é activada por receptores de morte após ligação do ligando. ativação da caspase é uma característica comum das duas principais vias apoptóticas. No entanto, a morte celular independente de caspase tem sido relatada, a qual é definida como a morte de células que não envolve a activação de caspase [9], [10]. Recentemente, para além das proteínas mitocondriais conhecidos, que está associada com a activação de caspase, algumas proteínas mitocondriais foram encontrados para activar a morte celular independente de caspase, incluindo o factor de indução de apoptose (AIF), a endonuclease G (Endo L), e HtrA2 ( Omi)

Survivina é um membro do bi-funcional do inibidor da família de proteínas de apoptose (IAP) que medeia a sobrevivência e controlos de células progressão do ciclo celular [11] -. [13]. Não é encontrada em tecidos diferenciados normais, mas é geralmente sobre-expresso em tecidos de cancro humano, especialmente em tecidos de leucemia [14] – [16]. Quando as células são expostas a estímulos, tais como Fas /CD95, radiação ou quimioterapia, a survivina pode protegê-los contra a morte celular. Além disso, a survivina pode inibir directamente caspase-9 e caspase-3 e -7 indirectamente através da ligação a Smac /Diablo [17]. Em adição ao seu papel na via dependente de caspase, survivina foi reportado para afectar a via independente de caspase através da supressão de libertação FIA, o qual proporciona uma via alternativa para a sobrevivência celular [12]. expressão survivin também é regulada para cima no G

2 /M fase de células em proliferação [18]. Ele é um membro do complexo de passageiros cromossoma e desempenha um importante papel na divisão celular. Além disso, muitos outros factores, tais como Wnt /β-catenina, citocinas, AKT, e de NF-kB têm sido relatados para sobre-regular a expressão de survivina independente do ciclo celular [12].

O objectivo deste estudo foi o de investigar os mecanismos moleculares subjacentes à actividade de α-tomatina, que foi isolado a partir de tomate, e para determinar o seu possível papel no tratamento da leucemia. Nossos resultados mostram que α-tomatina possui atividade anti-câncer, tanto

in vitro

e

in vivo

. α-Tomatina exposição induzida morte celular de leucemia independente da progressão do ciclo celular e a activação de caspase. No entanto, ele causou Bak e Mcl-1s de ativação e, posteriormente, perda de potencial de membrana, provocando liberação FIA. Ele também inibiu a expressão de survivina, tanto

in vitro

e

in vivo

. Estes achados sugerem que α-tomatina pode ser uma droga candidato promissor para o tratamento de leucemia.

Materiais e Métodos

Materiais

α-Tomatina foi comprado de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., e dissolvidos em DMSO (dimetilsulf óxido), em seguida, mantida a -20 ° C. Meio RPMI 1640, soro fetal de bovino (FBS), penicilina /estreptomicina foram comprados na Life Technologies (Grand Island, NY, EUA). A doxorrubicina, Z-VAD-FMK, rodamina 123, 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5 -diphenyltetrazolium, iodeto de propídio e todos os outros reagentes químicos utilizados neste estudo foram adquiridos da Sigma Chemical ( St. Louis, MO, EUA). Anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit e anticorpos contra a caspase-6 e caspase-7 foram adquiridos a BD Bioscience (San José, CA, EUA). Anticorpo contra a caspase-3 foi adquirido a Imgenex (San Diego, CA, EUA). Os anticorpos contra a caspase-8, a survivina, FIA, e Bid foram adquiridos a partir de Cell Signaling (Beverly, MA). Anticorpo contra a actina foi adquirido de Millipore (Billerica, MA, EUA). Anticorpo contra a caspase-9 foi adquirido da Epitomics (Burlingame, CA, EUA). α-tubulina, poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), Mcl-1, Bcl-2, Bak, Bcl-XL, conjugado com HRP anti-ratinho e anti-coelho foram adquiridos a partir de Santa Cruz (CA, EUA).

As linhas celulares

linha de células K562 de leucemia mielóide crónica humana e a linha de células de leucemia promielocítica aguda HL60 foram obtidos a partir Coleção Bioresource e Centro de Pesquisa. Ambos foram cultivadas em meio RPMI-1640 com 10% de soro fetal de bovino, 100 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina e mantidas em 5% de CO

2 a 37 ° C.

viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. A desidrogenase mitocondrial em células vivas reduz 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazólio brometo, MTT (amarelo) em formazano corantes (roxo). As células K562 (3 × 10

5 /mL) e células HL60 (4 × 10

5 /ml) foram semeadas em placa de 24 poços. As células foram tratadas com α-tomatina, durante 24 h. Após o tratamento com a droga, 100 ul solução de MTT (0,5 mg /ml em PBS) por poço, foi adicionado à placa de 24 poços, e a placa foi incubada a 37 ° C durante 1 h. Finalmente, 100 ul de tampão de extracção (tampão de acetato de sódio 0,1 M) foi adicionado à placa por poço para dissolver os corantes de formazano e a absorvância foi medida a 550 nm por ELISA Reader (Packard, Meriden, CT, EUA).

análise de citometria de fluxo

o fenómeno da apoptose foi detectada por fosfatidilserina (PS) translocação da membrana interior para a superfície exterior da célula. E anexina V marcada se pode ligar a PS para detectar células apoptóticas. Depois as células foram tratadas com α-tomatina durante o tempo, as células foram colhidas e coradas pelo iodeto de propídio (PI, 0,5 ug /mL) e solução de Anexina V-FITC (25 ug /mL) durante 15 min à temperatura ambiente. A percentagem de células apoptóticas foram analisadas por FACScan Citómetro de fluxo e o software CellQuest (Bectan Dickinson). teor de ADN pode ser utilizada para analisar o ciclo celular. A seguir ao tratamento com α-tomatina durante o tempo indicado, as células (5 × 10

5 /ml) foram colhidas e fixadas com 70% (v /v) de etanol arrefecido em gelo a -20 ° C durante 30 minutos pelo menos. As células fixadas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), ressuspendida em 0,2 ml de tampão de extracção de ADN (0,2 M de Na

2HPO

M de tampão citritic 4-0,1, pH 7,8) durante 30 minutos e coradas com PI solução (80 ug /mL de iodeto de propídio, 100 ug /ml de RNase a, e 1% de Triton X-100 em PBS) durante 30 min à temperatura ambiente. Os dados foram analisados ​​por FACScan Citómetro de fluxo e o software CellQuest (Bectman Dickinson).

Medição da membrana mitocondrial potencial

O potencial da membrana mitocondrial foi monitorizada por rodamina 123. Rodamina 123, um tipo de fluorona lipofílico tingir com carregado negativamente, pode ser absorvida selectivamente na membrana mitocondrial. Quando o potencial de membrana mitocondrial é perdido, rodamina 123 não pode ser absorvido em membrana. As células foram tratadas com o α-tomatina durante o tempo indicado. Rodamina 123 (concentração final 10 uM) foi adicionado antes de as células foram colhidas e incubadas durante 30 min a 37 ° C. Em seguida, as células foram finalmente recolhidos, enxaguados com PBS e analisadas por FACScan Citómetro de fluxo e o software CellQuest (Bectman Dickinson).

Western blot análise

Após o tratamento, as células (10

6cells /mL) foram recolhidas. os sedimentos celulares foram lavados duas vezes com PBS, lisadas em tampão de lise gelado (50 mM Tris, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, PMSF 1 mM, 10 ug /ml de aprotinina, 10 ug /ml de leupeptina, orthovandate de sódio 1 mM e NaF 1 mM) durante 30 min e subsequentemente centrifugou-se a 13000 rpm a 4 ° C durante 30 min. Para a extracção de proteínas nucleares, os sedimentos celulares foram lisados ​​em tampão A (10 mM de Hepes, pH 7,9, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM

2, PMSF 0,2 mM, DTT 0,5 mM, dH

2O). Após incubação em gelo durante 15 min, as células foram centrifugadas a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 minutos e, em seguida, as peletes foram lavadas com tampão B (10 mM de Hepes, pH 7,9, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol a 25%, dH

2O). Finalmente, os sedimentos foram ressuspensos em tampão C (20 mM de Hepes, pH 7,9, NaCl 420 mM, MgCl 1,5 mM

2, EDTA 0,2 mM, glicerol a 25%, PMSF 0,2 mM, DTT 0,5 mM) durante 20 min em gelo e centrifugado a 13000 rpm a 4 ° C durante 30 min. A proteína foi quantificado por Kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). Para a análise de transferência de Western, a proteína foi separada por electroforese e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Em seguida, a bloquear a membrana com leite desnatado durante 1 hora e foram incubados com anticorpo primário em PBS a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte, a membrana foi lavada com PBST (0,1% de Tween 20 em PBS) e incubadas com o anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, a membrana foi lavada novamente com PBST e, finalmente, o sinal foi detectado com um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido).

modelos de tumor de xenoenxerto

Para estimar o

In vivo

actividade antitumoral de α-tomatina, células HL-60 (10

8 células /ml) foram injectados em 20 ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID) por via subcutânea. Quando o tamanho médio do tumor de aproximadamente atingiu 100 mm

3, os ratinhos foram separados em dois grupos (um grupo de 10 ratinhos) e, em seguida, tratada com α-tomatina (5 mg /kg) em 5% de DMSO /5% de Cremophor /90% D5W (glucose a 5%) por via intraperitoneal. Uma vez que o tamanho médio do tumor foi maior do que 2,500 milímetros

3, os ratinhos foram sacrificados. Os tumores foram ressecados, pesados ​​e congelados em formalina para experiências de imuno-histoquímica. O tamanho do tumor foi medido por medição paquímetro (mm) e da esfera fórmula elipsóide (LW

2/2, L: comprimento; W: largura). Todos os procedimentos foram seguidos por National Taiwan University Uso de Animais e do Comité de Gestão.

imuno coloração

parafina-embedded tecidos tumorais de camundongos foram seccionados e desparafinados com xileno. As lâminas foram imersas em diferentes concentrações de álcool (100%, 95%, 75%, 50%, DDH

20) passo a passo para a re-hidratação e depois em 3% H

20

2 para bloquear endógena peroxidase. Para recuperação de antigénios, imergindo as lâminas em ebulição (95-100 ° C) Tampão citrato (pH 6,0) durante 20 min foi necessária. Após lavagem com PBS, as lâminas foram embebidas em solução (3% de BSA) à temperatura ambiente de bloqueio durante 30 minutos. As lâminas foram incubadas com o anticorpo primário diluído, survivina ou AIF (Cell Signaling, Beverly, MA) a 4 ° C durante a noite. Após lavagem com PBS, durante várias vezes, o anticorpo secundário, HRP Polímero Reagente Conjugado (SuperPicture kit de detecção de polímero), foi adicionado durante 10 min e, em seguida, DAB cromogénio durante 5 min. Cada passo de incubação, as lâminas foram seguidos de lavagem com PBS durante 5 min. E, em seguida, solução de hematoxilina de Mayer foi usada para contracoloração. Finalmente, as lâminas tinham de ser desidratados, secos ao ar e montado. Para coloração com hematoxilina e eosina (H E mancha), em breve, as lâminas seccionadas foram colocada em solução de hematoxilina durante 15 minutos, lavou-se com DDQ

2O e depois contra-coradas com eosina durante 5 min. A cor dos núcleos das células era azul e do citoplasma era rosa. Este tipo de coloração pode distinguir os núcleos e citoplasma das células tumorais

A análise estatística

Todos os dados experimentais foram expressos como valores médios ± SEM e avaliados por Bonferroni

t

. – teste. As experiências em animais foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney. A significância estatística foi determinada pelo

P

. 0,05

Resultados

α-Tomatina apoptose induzida em linhas celulares de leucemia HL60 e K562

α-tomatina é composto por tomatina-esteróide como, galactose, glicose, xilose e (Fig. 1A). A citotoxicidade de α-tomatina foi determinado em primeiro lugar com dois tipos diferentes de células leucémicas humanas, K562 (leucemia mielóide crónica humana) e HL60 (leucemia promielocítica aguda humana). ensaio MTT revelou α-tomatina teve fortes efeitos citotóxicos que podem inibir a sobrevivência das células em células HL60 e K562 de um modo dependente da concentração do IC

50 de 1,92 e 1,51? M, respectivamente (Fig. 1B). Estes resultados também foram demonstrados em outras linhas de células de leucemia (Fig. S1). No entanto, α-tomatina teve efeito citotóxico bastante fraca na linha de células de linfoma e as células normais (Fig. S1 e S2). Para confirmar o estado do processo de morte celular induzida por α-tomatina, PI e coloração dupla anexina V foram realizados. Como mostrado na Figura 1C, aproximadamente 40% de células HL60 tratadas com α-tomatina durante 12 horas foram coradas por anexina V, o que representou células apoptóticas fase inicial, e 10% das células foram coradas por ambas PI e Anexina V, o que indicou apoptose fase tardia ou necrose. Após o tratamento durante 24 horas, 60% das células estavam na fase precoce de apoptose e 20% das células estavam em fase tardia. Estes resultados indicam que α-tomatina poderiam inibir o crescimento celular e induzir a apoptose em linhas celulares HL60 e K562.

(a) a estrutura química de α-tomatina. (B) As células foram tratadas com ou sem α-tomatina, durante 24 h, e a viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio de actividade de redução de MTT mitocondrial. Os dados são expressos como o meio ± SEM de, pelo menos, três determinações. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***

P Art 0,001 comparado com o controle. (C) citometria de fluxo das membranas plasmáticas com dupla marcação anexina V-FITC /PI. As células foram incubadas com DMSO durante 12 horas, ou na presença de 5 uM α-tomatina durante 12 e 24 h. Nas experiências seguintes, 0,1% de DMSO foi usado como controle. células não danificadas foram coradas negativo em anexina V-FITC /PI (quadrante inferior esquerdo). Após a incubação com 5 uM de α-tomatina durante 12 horas, houve um número significativo de células apoptóticas que coraram positivamente com Anexina V-FITC e negativamente com PI (quadrante inferior direito). Os dados são expressos a partir de pelo menos três determinações separadas.

α-Tomatina não afetou o ciclo celular de distribuição

A análise da distribuição de fases do ciclo celular pode ajudar a avaliar o mecanismo de α-tomatina de açao; para observar a distribuição do ciclo celular, tanto para células HL60 e K562 linhas celulares, α-tomatina foi utilizado a 10 uM para 12, 24, e 48 h. Não há mudanças de fase do ciclo celular óbvias foram observadas no que diz respeito à exposição, dependente do tempo para ácido a-tomatina (Fig. 2A e 2B). Estas descobertas sugerem que a fase do ciclo celular para as linhas de células HL60 e K562 não foi alterada depois de tratamento α-tomatina. Em outras linhas de células de leucemia, α-tomatina também não tem influência sobre a distribuição do ciclo celular (Fig. S3). De acordo com estudos anteriores, a acumulação do ciclo celular em G foi observada

Fase 2 /M com paclitaxel [19]. O paclitaxel foi utilizado como um controlo positivo. A citometria de fluxo mostrou que a proporção de células em G

0 /L

1 fase diminuiu e sub-L

uma população aumentou após o tratamento das células com paclitaxel numa dose de 10 uM. Após o tratamento durante 24 horas, em comparação com as células do grupo de controlo, o número de células na sub-L

uma fase de aumento de aproximadamente 15 vezes (Fig. 2A). Estes achados sugerem que α-tomatina não afectou a distribuição do ciclo celular das células de leucemia humanas estudadas.

(A) A pista superior mostra células HL60 que foram tratados com α-tomatina (10 uM) para a indicada Tempo; a distribuição do ciclo celular foi avaliada por análise de citometria de fluxo FACScan. A pista inferior, células HL60 tratadas com paclitaxel (10 uM) durante o tempo indicado, serviu como um controlo positivo. (B) As células K562 foram tratadas com α-tomatina (10 uM) durante o tempo indicado. Os dados são expressos a partir de, pelo menos, três determinações separadas.

α-Tomatina morte celular induzida independente da activação de caspase

activação de caspase desempenham um papel importante em ambas as vias intrínsecas e extrínsecas apoptóticas. Entre todas as caspases, a activação de caspases-3, 6, e 7-se pensa ser o mais importante na via de apoptose. Portanto, para confirmar o papel da caspase-3 a células HL60 e células K562 foram tratadas com α-tomatina em diferentes concentrações. Os resultados mostraram que a caspase-3 não está activada por α-tomatina (Fig. 3A e 3C). No entanto, o paclitaxel (3 fiM), usado como um controlo positivo, activado da caspase-3. Para além da caspase-3, caspase-6, -7, -8, -9 e eram aparentemente inalterada após o tratamento α-tomatina, mesmo após a exposição a uma alta concentração de α-tomatina (5 uM), durante 24 h (Fig. 3A e 3C). A fim de confirmar que toda a activação de caspase foi envolvida em vias de morte celular induzida por α-tomatina, um inibidor da caspase panela, z-VAD-fmk, foi usada para as experiências de confirmação. ensaio MTT mostrou que a co-tratamento de células HL60 e células K562 com z-VAD-fmk e α-tomatina não reverteu a morte celular induzida por tomatina α (Fig. 3B e 3D). Além disso, estes resultados semelhantes também foram exibidos em outras linhas de células de leucemia (Fig. S4). Estes resultados sugerem que a apoptose celular induzida α-tomatina é independente da activação de caspase nas linhas celulares de leucemia.

(A) As células HL60 foram tratadas com α-tomatina (5 uM), ou o paclitaxel (3 uM) para 24 HR e caspase-3, -6, -7, -8, -9 e activações foram detectados. As proteínas foram separadas e avaliadas utilizando análise de Western blot. O paclitaxel (3 uM) foi usada como um controlo positivo. (B) As células HL60 foram pré-tratadas com 100 uM de Z-VAD-fmk, durante 30 min e depois tratou-se com α-tomatina (5 uM), durante 24 h. A citotoxicidade foi determinada pelo ensaio de MTT. (C) As células K562 foram tratadas com α-tomatina (5 uM) e caspase-3, -6, -7, -8, -9 e activações foram detectados. (D) As células K562 foram pré-tratadas com 100 uM de Z-VAD-fmk, durante 30 min e depois tratou-se com α-tomatina (5 uM), durante 24 h.

α-Tomatina afectou o potencial de membrana mitocondrial e proteínas relacionadas

Como as mitocôndrias desempenham um papel importante em ambas as vias intrínsecas e extrínsecas da apoptose, potencial de membrana mitocondrial foi medido. As células HL60 e K562 foram expostos à ct-tomatina a uma concentração de 5 mM para os tempos indicados (1, 2, 4, 8, e 12 h) e tratadas com rodamina 123, durante 30 min; e, em seguida, as células foram analisadas por citometria de fluxo. As Figuras 4A e 4B mostram um fenómeno de desvio de bandas observado após incubação durante 1 e 2 horas no HL60 e K562 linhas de células, respectivamente; estes fenómenos alterou significativamente a 4 horas. O acima mencionados indicam que α-tomatina afectou o potencial de membrana mitocondrial. Não só nas células HL60 e K562, α-tomatina também causou membrana mitocondrial potencial perda de outras células leucémicas (Fig. S5).

O potencial da membrana mitocondrial foi quantificada por análise de citometria de fluxo com rodamina 123. O ( a) e B) HL60 linhas de células K562 (foram tratadas com 10? M de rodamina 123 e incubou-se a 37 ° C durante 30 minutos na presença de 5 uM α-tomatina. O eixo horizontal mostra a intensidade de fluorescência relativa e o eixo vertical indica o número de células. A curva verde indica que o controle. A curva azul indica as células α-tratados com tomatina. Um deslocamento da curva de verde para azul da curva indica uma perda de potencial de membrana mitocondrial. Os dados são expressos a partir de, pelo menos, três determinações separadas.

Em estudos anteriores, a família Bcl-2 foi demonstrado desempenhar um papel crucial na mitocôndria, incluindo mediação da membrana mitocondrial potencial [20]. Por isso, nós investigamos se α-tomatina mudanças no potencial da membrana mitocondrial devido aos efeitos da expressão de proteína da família Bcl-2 induzida. Nas células HL60 e K562, a proteína de Mcl-1 de forma longa (Mcl-1 L), que medeia a inibição da apoptose das células, não foi regulada por α-tomatina; No entanto, a expressão de Mcl-1 (forma curta Mcl-1S), que induz a apoptose de células, aumentaram após o tratamento (Fig. 5A e 5B). No entanto, como mostrado nas Figuras 5A e 5B, não se verificaram alterações nos Bcl-2 e proteína em níveis Lance a células HL60 e células K562. Estes achados sugerem Bak e Mcl-1 desempenharam papéis importantes na apoptose induzida por α-tomatina em células de leucemia humana.

(A) α-tomatina induzidas MCL-1s e Bak up-regulamentação (pró-apoptótica), mas não afectou os níveis de proteína Bcl-2 de lances e nas células HL60. (B) Nas células K562, α-tomatina aumentou significativamente a activação de Bak e supra-regulados Mcl-1S; no entanto α-tomatina não influenciou expressões proteína Bcl-2 e lance. Ambas as linhas celulares foram tratadas com 5 uM α-tomatina durante os intervalos indicados. Os dados são expressos a partir de pelo menos três determinações separadas.

induzida α-Tomatina translocação nuclear FIA e expressão survivin inibido

resultados anteriores e os dados aqui apresentados revelam que α-tomatina induzida morte celular independente da activação de caspase [21] e o potencial de membrana mitocondrial afectada. Além disso, tem sido relatado que a permeabilidade da membrana mitocondrial é também regulada por FIA. Assim, a morte celular, induzida por AIF, que evita a activação de caspase, pode ser envolvida na via de apoptose celular induzida por α-tomatina. A Figura 6A e 6B mostram α-tomatina induzida por translocação nuclear de FIA ​​em ambas as linhas celulares de um modo dependente do tempo.

(A), HL60 e (B) células K562 foram tratadas com e sem α-tomatina ( 5? M) durante 12 h, 18 h, 24 h e 30 h. As células foram, em seguida, fraccionado em componentes nucleares, e as expressões proteína de AIF e nucleolina (controlo de carga nuclear) foram avaliados por análise de Western blot. (C) As células K562 HL60 (D) e foram tratados com α-tomatina nas concentrações e tempo indicados. A survivina e os níveis de proteína actina foram detectadas por análise Western Blot. Os dados são expressos a partir de, pelo menos, três determinações separadas.

De acordo com Carter

et ai.

, Muitos tipos de linhas celulares de leucemia estão associados com a inibição de survivina que promove a morte celular independente de célula a progressão do ciclo [22]. Além disso, a survivina foi mostrado para suprimir FIA translocação para o citoplasma das mitocôndrias que poderiam induzir a via apoptótica independente de caspase [12]. Investigou-se se poderia α-tomatina directamente infra-regular o nível de proteína de survivina que leva à morte celular. Com efeito, a expressão de survivina foi regulada para baixo em ambas as linhas celulares e outras linhas de células de leucemia em uma forma sua concentração e do tempo-dependente (Fig. 6C e 6D e S6). Estes resultados indicam que os FIA translocação e survivin inibição estavam envolvidos na morte celular independente de caspase α-mediada por tomatina.

A actividade antitumoral e expressão da FIA e survivin com α-tomatina

in vivo

Para determinar a eficácia antitumoral de α-tomatina em

vivo

, SCID foram injectados por via subcutânea com células HL60 em seu flanco direito. Quando o volume do tumor atingiu 100 mm

3, os ratos foram divididos em dois grupos: um controlo (veículo) e os grupos de tratamento α-tomatina (5 mg /kg, i.p., a cada dois dias). O experimento foi interrompido quando o volume médio de tumores atingiram 2.500 mm

3. A Figura 7A mostra que α-tomatina inibiu o crescimento do tumor e estava associada com a falta de perda de peso nos ratinhos tratados. Os tumores foram ressecados; uma parte dos tumores ressecados foram fixados em formalina e embebidos em parafina para análise imuno-histoquímica, e a outra parte foi triturado e, em seguida, imersas em tampão de lise. coloração imuno-histoquímica foi realizada para estimar as expressões da FIA e survivin,

ex vivo

. Hematoxilina e eosina (H E) de coloração foi usado para observar a aparência das células, com as porções azuis e vermelhos representam o núcleo da célula e no citoplasma, respectivamente. Os núcleos diminuiu nas células de tumor dos ratinhos tratados com α-tomatina (Fig. 7B). Os resultados de coloração imuno-histoquímica utilizada para avaliar os níveis de expressão de survivina AIF e mostraram que, em comparação com os ratos tratados com veículo, os ratinhos tratados com α-tomatina mostraram um aumento da expressão FIA e reduziram os níveis de survivina (Fig. 7B). Além disso, a análise de Western blot foi usado para medir uma porção do tecido tumoral do solo para as expressões de AIF e survivina. A Figura 7C mostra que, consistente com os efeitos observados de α-tomatina

ex vivo

, o nível de proteína FIA foi aumentada e survivina foi diminuída nos ratos tratados com α-tomatina. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que α-tomatina, tanto

in vitro

e

in vivo

, o crescimento de células de leucemia inibido pela inibição survivina e indução FIA sugerindo que α-tomatina pode ser um candidato para tratamento da leucemia eficaz.

células HL-60 foram ectopicamente implantados em ratinhos SCID e, quando o tamanho do tumor atingiu 100 mm

3, os ratinhos foram injectados com /kg (q2d, ip) doses de 5 mg de α -tomatine. (A) Efeitos de α-tomatina no volume do tumor e os pesos corporais dos ratinhos foram estudados. As curvas de crescimento são as médias dos tamanhos dos tumores medidos para cada grupo (n = 5). (B) Os tumores foram então excisados ​​e processados ​​para coloração imuno-histoquímica. As pistas superiores (a.c.e.g e i) são o controle, e as pistas para baixo (b.d.f.h e j) são o grupo tratado, com α-tomatina (5 mg /kg). a, b: hematoxilina e eosina; c, d, e, f coloração para FIA (marrom); g, h, i e j para a coloração de survivina (castanho). c, d, g e h são inferiores a 200 × ampliação; a, b, E, F e J estão sob 1000 × ampliação. (C) análise de transferência de Western foi realizada para expressões AIF e survivina em conjunto com a actina como um controlo de carga de tumor seleccionados aleatoriamente em cada um dos controle e 5 mg /kg a-tomatina grupos de tratamento.

Discussão

α-Tomatina é uma saponina principal encontrada no tomate, e estudos recentes têm mostrado que tem actividade anti-tumoral em células de tumor sólido [1], [5], [6]. No entanto, o mecanismo molecular da actividade α-tomatina não foi determinada em células leucémicas. No presente estudo, α-tomatina foi encontrado para inibir a sobrevivência de células leucémicas de um modo dependente da concentração (Fig. 1B e S1). A inibição da sobrevivência das células pode ser atribuída à inibição do crescimento celular ou a citotoxicidade das células. Por isso, a distribuição do ciclo celular foi investigada após o tratamento com α-tomatina. Os resultados mostraram que α-tomatina não afectou a progressão do ciclo celular nas linhas de células de leucemia avaliados (Fig. 2 e S3). No entanto, iodeto de propídio (PI) e anexina V coloração revelou que α-tomatina promoveu-leucémica apoptose de células a partir do início às fases finais (Fig. 1C). Além disso, o tratamento α-tomatina resultou em alterações na expressão da família de proteínas de BCL-2 (Fig. 5). perturbação mitocondrial significativo (Fig. 4 e S5) foi observada, e posteriormente desencadeado FIA translocação para o núcleo e inibe a expressão de survivina que conduz à apoptose de células leucémicas (Fig. 6 e S6).

Os resultados deste estudo mostrou nenhuma alteração-α-tomatina relacionados na distribuição do ciclo celular, mesmo a uma concentração elevada α-tomatina (10 uM). No entanto, os resultados da coloração dupla PI-anexina V sugerido que a apoptose observada foi causada por α-tomatina.