Abstract

LCRMP-1, um romance isoforma de CRMP-1, pode promover a migração de células cancerosas, invasão e associado com mau resultado clínico em pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas-(NSCLC). No entanto, os mecanismos regulatórios subjacentes do LCRMP-1 em capacidade de invasão de células de câncer ainda permanecem obscuros. Aqui, nós relatamos que GSK3β pode fosforilar LCRMP-1 a Thr-628 em sequências de consenso e isso fosforilação é crucial para a função de LCRMP-1 para promover a formação filopódios, migração e invasão em células cancerosas. Impedimento de Thr-628 fosforilação atenua os efeitos estimulantes de LCRMP-1 em filopódios formando, habilidades migração e invasão de células cancerosas; simultaneamente, GSK3β cinase morta diminui regulação da LCRMP-1 na invasão de células de cancro. Além disso, também descobrimos que os pacientes com expressão GSK3β baixo nível Ser-9-fosforilada e de alto nível de expressão LCRMP-1 têm sobrevida global pior do que aqueles com alto nível inativos expressões GSK3β e LCRMP-1 expressões de baixo nível (P 0,0001). Colectivamente, estes resultados demonstram que a fosforilação GSK3β dependente de LCRMP-1 fornece um mecanismo importante para a regulação da LCRMP-1 na invasão da célula cancerosa e evolução clínica

Citation:. Wang WL, Hong TM, Chang YL, Wu CT, Pan SH, Yang PC (2012) a fosforilação de LCRMP-1 por GSK3β promove a formação Filopoda, Habilidades migração e invasão em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 7 (2): e31689. doi: 10.1371 /journal.pone.0031689

Autor: Adam I. Marcus, da Universidade Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de dezembro de 2011; Aceito: 11 de janeiro de 2012; Publicação: 21 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência (NSC 98-2628-B-002-086-MY3, NSC100-3112-B-006-005 e NSC100-2321-B-002-071). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Metástase contribui para o fracasso do tratamento e morte na maioria dos doentes com cancro [1]. A capacidade de células cancerígenas para metástase progressiva é controlado por processos celulares complexos, envolvendo alterações do microambiente, aumentando a capacidade de migração de células ou invasão, múltiplos acontecimentos genéticos e factores reguladores. Até agora, muitos indutores mestre e eliminadores de metástase de câncer foi identificado a ser envolvidos nestes processos, e revelando, assim, vias reguladoras a montante destas proteínas pode facilitar que descreve mecanismos moleculares detalhados para a metástase do câncer [2].

O glicogênio -sintase-quinase-3β (GSK3β) é conhecida como uma serina /treonina quinase multitarefas que controlar inúmeros processos celulares, incluindo metabolismo do glicogénio, a diferenciação celular, a apoptose, o rearranjo do citoesqueleto, a regulação do ciclo celular, e a proliferação das células [3], [4]. GSK3β regula uma ampla gama de substratos através da fosforilação em motivos de consenso óptimas (Ser /Thr-X-X-X-Ser /Thr, em que X é representativo de qualquer aminoácido) [3], [5]. Normalmente, os substratos mais comuns de GSK3β precisa de uma escorva quinase específica para aumentar a eficiência da primeira fosforilação nos resíduos de serina ou de treonina que perto dos quatro resíduos de local de fosforilação GSK3β no terminal carboxilo. Por exemplo, a caseína-quinase 1 primos anteriores p-catenina a GSK3β fosforilação [6], e de caseína-quinase 2 é uma escorva cinase da sintase do glicogénio [7].

1-proteína mediadora da resposta colapsina (CRMP-1) suprime a extensão do cone de crescimento neuronal durante o desenvolvimento, e também é conhecido como um supressor de invasão do cancro [8], [9]. Recentemente, identificamos um romance isoforma de CRMP-1, a forma longa CRMP-1 (LCRMP-1) [10]. LCRMP-1 podem promover a formação de filopódios, a migração de células cancerosas, invasão através funcionalmente contra CRMP-1, e sua expressão se correlaciona com mau resultado clínico em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC-). LCRMP-1 e CRMP-1 portos sequências C-terminal idêntico de exão-exão 2 a-14; No entanto, N- terminal do exão 1-sequência de LCRMP-1 é diferente com a de CRMP-1 [11]. Entre a família CRMP humano, sequência de aminoácidos de CRMP-2 é de 78% e 76% de identidade com CRMP-1 e CRMP-3, respectivamente [12]. Anteriormente, CRMP-2 foi avaliado para ser fosforilada por GSK3β em Thr-514, e associado com prejudicando polarização neuronal [13]. Notavelmente, CRMP-1 e CRMP-3 mostrou GSK3β fosforilação motivos de consenso altamente semelhantes com CRMP-2 [14]. Consistente com CRMP-1, LCRMP-1 também contêm mesmo motivo para GSK3β fosforilação.

Desde LCRMP-1 e CRMP-1 tem a função oposta sobre a migração câncer e invasão, se a função de LCRMP-1 pode ser regulamentada por GSK3β deve ser mais estudada. No presente relatório, investigamos possível regulamentação da GSK3β em LCRMP-1. Aqui, demonstramos que pode fosforilar GSK3β LCRMP-1 e modulam a formação de filopodia, migração e invasão de células de cancro. Nós ainda confirmar o site GSK3β fosforilada em LCRMP-1, investigar a sua função para a invasão celular e avaliar a sua significativa clínica em pacientes com NSCLC.

Resultados

GSK3β pode fosforilar LCRMP-1 a Thr- 628

Para prever se as sequências de fosforilação de consenso clássicos GSK3β são existiam em LCRMP-1, primeiro alinhadas as sequências proteicas entre CRMP-2, CRMP-1, e LCRMP-1 (Fig. 1A). Estudos anteriores demonstraram que Cdk5 é uma quinase que fosforila escorva CRMP-2 a Ser-522, a seguir com a fosforilação de CRMP-2 na Thr-514 por GSK3β e resultando na regulação funcional de polarização neuronal [13]. Portanto, verificou-se que as sequências de proteínas de LCRMP-1 continha altamente consistentes com Cdk5 e GSK3β motivo de fosforilação, assim, especulamos que o principal local de fosforilação potencial de LCRMP-1 está localizado na Thr-628 (Fig. 1A). Para examinar se LCRMP-1 pode ser fosforilada por GSK3β, células HEK293T foram co-transfectadas com o tipo selvagem da Bandeira-Tagged LCRMP-1 (WT) na presença de vector vazio, do tipo selvagem GSK3β (WT), constitutivamente activa GSK3β (CA) ou GSK3β cinase-dead (KD). Expressão de GSK3β (CA) foi obviamente mais detectado desvios de mobilidade (pontas de seta) de LCRMP-1 (WT) do que GSK3β (WT) (Fig. 1B, pista 2 e 3). No entanto, lento-migração bandas superiores foram completamente desaparecido em células que expressam forma deficientes em quinase de GSK3β (KD) (Fig. 1B, pista 4). Estes resultados sugerem que LCRMP-1 é um substrato do GSK3β e bandas lentamente migrando foram causados ​​por sua fosforilação

in vivo

.

análise (A) Sequência de proteína mostrou o potencial local de consenso de LCRMP- 1 para a fosforilação por GSK3β. As sequências de proteínas estão alinhados entre CRMP2, CRMP-1, e LCRMP-1. Os números representam sítios ácidos aminados e sublinhado mostra um sítio de fosforilação potencial para Cdk5. (B) GSK3β fosforila LCRMP-1 (WT)

in vivo

. células HEK293T foram co-transfectadas com marcada com Flag LCRMP-1 e a actividade distinta da Bandeira-tagged GSK3β (WT, CA e forma KD). Igual quantidade de plasmídeos foram transfectados em cada condição utilizando vectores vazios. As células foram lisadas 30 h pós-transfecção e extractos de proteína foram analisados ​​por imunotransferência com anticorpos anti-FLAG. (C) GSK3β fosforila LCRMP-1 (WT) na Thr-628

in vivo

. CL1-0 células foram co-transfectadas quer Flag-tag LCRMP-1 (WT) ou LCRMP-1 (T628A, T628D) mutantes na presença ou ausência de actividade distinta de GSK3β Bandeira-etiquetado (CA e KD forma). vectores vazios foram usadas para suplemento para igual quantidade de plasmídeos no ensaio de transfecção. Os lisados ​​celulares foram colhidas 48 h pós-transfecção e analisados ​​por imunotransf erência com anticorpos anti-FLAG e anti-β-actina.

A seguir, para determinar se GSK3β fosforila LCRMP-1 na Thr-628

in vivo

, a não fosforilado LCRMP-1 mutante foi gerado através da substituição de Thr-628 a Ala (T628A). CL1-0 células foram co-transfectadas com LCRMP-1 (WT) ou um LCRMP-1 (T628A) mutante não fosforilado na presença quer de vector vazio, GSK3β (CA), ou GSK3β (KD). Consistente com as observações anteriores, GSK3β (CA) e GSK3β (KD) foram provou exibir desvio de bandas e deslocamento não-banda (pontas de seta) de LCRMP-1, respectivamente (Fig. 1C, a pista 2 e 3). Notavelmente, LCRMP-1 (T628A) era resistente à actividade GSK3β (CA) e as bandas foram deslocadas quase aboliu (Fig. 1C, pista 4). Este resultado foi semelhante para as condições de LCRMP-1 (WT) mais GSK3β (KD) (Fig. 1C, pista 3 e 4), e após confirmação de que, de facto GSK3β fosforilada LCRMP-1 nos resíduos de Thr-628. Colectivamente, todos estes resultados indicaram que LCRMP-1 foi especificamente fosforilada em Thr-628 por GSK3β

In vivo

.

Thr-628 fosforilação de LCRMP-1 é necessário para a invasão de células de cancro, migração e formação de filopódios

em nossos relatórios atuais, nós descobrimos que o tipo selvagem LCRMP-1 melhora a formação filopódios, e promove a migração e invasão celular em linhas celulares de cancro do pulmão humanos não invasivos [10]. Desde LCRMP-1 pode ser fosforilada em Thr-628 por GSK3β, nós próxima questionado se a função de LCRMP-1 pode ser regulada por esta fosforilação. Para resolver isso, geramos uma série de lentivírus que expressam GFP (controle), não-marcado LCRMP-1 (WT), LCRMP-1 (T628A), ou LCRMP-1 (T628D), e traduzidas-los em baixo-invasivo CL1 -0 cancro do pulmão células que expressam baixo nível de endógena LCRMP-1 [11]. Expressão das proteínas de tipo selvagem ou mutante LCRMP-1 foi confirmada por imunotransferência utilizando anti-análise LCRMP 1-anticorpos (Fig. 2a). Estas células foram então usadas para analisar a capacidade de invasão de células. Como esperado, LCRMP-1 (WT) superexpressão contribuído para um aumento da capacidade de invasão de células comparado com o controlo de GFP (Fig. 2B). invasão de células No entanto, T628A mutante não fosforilado de LCRMP-1 foi muito diminuída (Fig. 2B). Por outro lado a capacidade de invasão, fosfo-mímica LCRMP-1 (T628D), o que era esperado para imitar a forma fosforilada, visualizado aumentada semelhante à de tipo selvagem LCRMP-1 (WT). Para explorar ainda mais o efeito de Thr-628 fosforilação de LCRMP-1 expressão na motilidade celular CL1-0, foi realizado ensaio de microscopia de lapso de tempo de vídeo para monitorar mover faixas de pelo menos 10 células individuais durante um período de 20 horas. Lentivírus transduzidas células expressando GFP-CL1-0 LCRMP-1 (WT) ou GFP-LCRMP-1 (T628D) aumentou tanto a velocidade de distância de migração e de migração em relação ao vector de GFP (Fig. 2C, D, e E). No entanto, a GFP-LCRMP-1 (T628A) mostrou compressão acentuada da distância e da velocidade de migração (Fig. 2C, D, e E). Estes resultados sugerem que a fosforilação de LCRMP-1 a Thr-628 é um pré-requisito para invasão celular e migração celular.

(A) níveis de exógena não marcado LCRMP-1 (WT) expressão da proteína, LCRMP-1 (T628A ), e LCRMP-1 (T628D) são confirmados por immunoblotting. Depois de 48 horas após a infecção lentivírus, as células que expressam estavelmente foram CL1-0 de tipo selvagem e mutante LCRMP-1. Lentivírus expressando GFP serviram como controle. Os lisados ​​celulares foram colhidas, seguido de avaliação com imunotransferência utilizando-LCRMP-1 e anticorpo anti anticorpos anti-p-actina. (B) não fosforilado LCRMP-1 (T628A) mutante diminui a actividade de invasão celular. A capacidade invasiva destas células foi determinada com o ensaio de invasão câmaras de Boyden modificada

In vitro

. Percentagem de capacidade invasiva foi normalizado ao controle GFP. Os dados foram expressos como média ± SEM para três experiências independentes (n = 3). (C) não fosforilado LCRMP-1 (T628A) mutantes muito reprimidas faixas de migração celular. parcelas do tracto mostrou células expressando GFP CL1-0, GFP-LCRMP-1 (WT), a GFP-LCRMP-1 (T628A), GFP-LCRMP-1 (T628D), respectivamente. Mover faixas de pelo menos 10 células representativas no ponto de início tudo pronto para ‘0,0’ durante um período de 20 horas (linhas diferentes) mostrou a motilidade representativos de células. barra de escala, 100 mm. (D, E) distância total de migração (D) e da velocidade de migração de células (E) foram quantificadas a partir de células de ensaio de acompanhamento durante 20 horas. Os dados foram apresentados como média ± SEM.

Em seguida, examinamos mais profundamente os efeitos de GSK3β sobre LCRMP-1 formação filopódios induzido. CL1-0 células foram transitoriamente transfectadas com GFP controlo, GFP-LCRMP-1 (WT), a GFP-LCRMP-1 (T628A), ou GFP-LCRMP-1 (T628D) e a seguir através de coloração com a actina utilizando faloidina com rodamina conjugada. Consistente com os nossos relatórios atuais, a análise de imunofluorescência revelou que o número de filopódios que induzidas pela expressão ectópica GFP-LCRMP-1 (WT) em células CL1-0 eram mais do que isso por controlo do vector GFP. Por outro lado, os números de formação de filopodia, obviamente, foram atenuados em células que expressam GFP mutante não fosforilado-LCRMP-1 (T628A) (Fig 3A;. 3B, p 0,0001). Além disso, a GFP-LCRMP-1 (T628D) também foi induzida mais filopios que semelhante a GFP-LCRMP-1 (WT), (Figura 3A;. 3B, p 0,0001). Estes dados indicam que a fosforilação de LCRMP-1 a Thr-628 é fundamental para a formação filopódios.

(A) não fosforilado LCRMP-1 (T628A) mutante prejudica a formação filopódios. células CL1-0 foram transitoriamente transfectadas com GFP-tagged LCRMP-1 (WT), LCRMP-1 (T628A) e LCRMP-1 (T628D). Ao fim de 24 horas após a transfecção, as células foram fixadas, permeabilizadas e depois imunomarcadas com faloidina conjugada com rodamina (vermelho) para a actina e DAPI (azul) para a visualização de núcleos. imunofluorescência imagens representativas foram visualizadas usando o microscópio de fluorescência. Barra de escala, 10 | im. Inserções mostram ampliações mais elevadas (400 ×). (B) Número de filopios foram contadas com, pelo menos, seis células por grupo. Os dados foram apresentados como média ± SEM.

GSK3β fosforila LCRMP-1 e modula a invasão da célula cancerosa

Para detectar ainda mais os efeitos de GSK3β sobre LCRMP-1 (WT) câncer induzido invasão celular, lentivírus expressando controle GFP, GSK3β (WT), GSK3β (CA), ou GSK3β (KD) foram infectados in /LCRMP-1 células superexpressão CL1-0 (linhas 1015 e 1003) que foram mostrados anteriormente para induzir fortemente celular invasividade [10]. Consistente com as nossas descobertas anteriores (Fig. 1B e C), análise de imunotransferência mostrou que GSK3β (AC) induzida LCRMP-1 com banda deslocada em comparação com o controlo de GFP (Figura 4A, pista 1 e 3;. Pista 5 e 7), mas um banda não deslocadas, foi observada em GSK3β (KD) (Fig. 4A, pista 4 e pista 8). Com base nas condições acima referidas, os resultados do ensaio de invasão também foram mostrado que GSK3β (CA) -introduced CL1-0 /LCRMP-1 As células (1015) pode promover a invasão celular em comparação com células de controlo (Fig. 4B). No entanto, GSK3β (KD) células -introduced resultou numa diminuição na capacidade de invasão (Fig. 4B). Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que GSK3β pode modular a actividade LCRMP-1 através de uma forma dependente da fosforilação para controlar a invasão de células de cancro.

(A) expressa Lentivírus controlo GFP, myc-tagged GSK3β (WT), GSK3β ( CA), ou GSK3β (KD) em células superexpressão CL1-0 /LCRMP-1 (WT) (1015 e 1003). Depois de 48 horas após a infecção, as células foram lisadas e sujeitas a análise de imunotransferência com o uso de anti-Flag, anti-myc, e os anticorpos anti-p-actina. (B) A atividade GSK3β afeta a invasão de células de câncer induzido LCRMP-1-. CL1-0 /LCRMP-1 células superexpressão (1015) foram infectados com GSK3β lentivírus expressando controle GFP, myc-marcado (CA) ou GSK3β (KD). Depois de 48 horas após a infecção, as células foram submetidas ao ensaio de invasão câmaras de Boyden modificada

In vitro

. A normalização ao controle GFP serviu como percentual da capacidade invasiva.

Baixa expressão de GSK3β inativo e alta expressão de LCRMP-1 se correlacionam com a sobrevivência geral pobres em pacientes com NSCLC

Embora nossos resultados de forma consistente sugeriram que a função de LCRMP-1 poderia ser regulada por GSK3β fosforilação, tais estudos não refletem totalmente malignidade clínica. Assim, nós estendemos nossa análise examinando forma inativa GSK3β e LCRMP-1 níveis de expressão de proteínas em amostras tumorais de 142 pacientes com NSCLC. As características clínicas destes pacientes estão resumidas na Tabela 1. As secções em série de cada amostra foram coradas com anticorpos contra LCRMP-1 e Ser-9-fosforilada GSK3β que indicado o estado da forma inactiva GSK3β devido à activação mediada por AKT que resulta em supressão da actividade GSK3β através de fosforilação na Ser-9 [15]. Os nossos resultados mostraram coloração típica de LCRMP-1 e Ser-9-fosforilada GSK3β na amostra do paciente (Fig. 5A). Consistente com os nossos relatórios anteriores, de alto nível LCRMP-1 tiveram sobrevida global significativamente fraca em comparação com baixo nível LCRMP-1 em pacientes com NSCLC [10], [11]. Notavelmente, a análise do efeito combinado de ambas as proteínas em prognósticos dos pacientes revelou que os pacientes com a expressão de baixo nível da forma inactiva GSK3β e expressão de alto nível de LCRMP-1 tinham a sobrevivência global mais pobre do que aqueles com a expressão de alto nível da forma inactiva GSK3β e baixo nível LCRMP-1 expressão (Fig. 5B, p 0,00001). análise multivariada Cox de riscos proporcionais de regressão, com um modelo de seleção por etapas, estavam presentes para avaliar as associações de vários fatores prognósticos independentes com a sobrevida do paciente (Tabela 2). Estes resultados sugerem que a actividade elevada GSK3β e de alto nível LCRMP-1, possivelmente, imitando o estado fosforilado de LCRMP-1, estão associados com o aumento da capacidade de invasão do cancro e sobrevivência global mais pobre.

(A) Os padrões de expressão de proteína típica fosforilada GSK3β e LCRMP-1 foram detectados por imuno-histoquímica utilizando anti-fosfo-GSK3β (Ser9) e-LCRMP-1 anti anticorpos (C2) em dissecações seriadas de amostras de tumor primário de 142 pacientes com NSCLC submetidos a ressecções cirúrgicas. Os resultados são mostrados + e – indica a tumores com e sem sobre-expressão com a proteína indicada, respectivamente. As barras de escala, de 100? M. p-GSK3β foi representada a fosforilada GSK3β. (B) Análise de Kaplan-Meier de sobrevida global em 142 pacientes com NSCLC com p-GSK3β

– LCRMP-1

-, p-GSK3β

– LCRMP-1

+, p-GSK3β

+ – LCRMP-1

-, e p-GSK3β

+ – LCRMP-1

+.

valores

P foram realizadas por meio de testes de log-rank de 2 lados.

Discussão

Nosso estudo investigou principalmente o mecanismo de regulação de pós -Tradução modificação associado com a migração de células de cancro e invasividade de LCRMP-1. Aqui, mostramos que a fosforilação dependente de GSK3β-LCRMP-1 regula positivamente a formação de filopodia, migração e invasão de células de cancro. Com base nos motivos de consenso GSK3β fosforilado, Thr-628 resíduos de aminoácidos de LCRMP-1 é o sítio de fosforilação mestre para GSK3β (Fig. 1). Uma substituição de Thr-628 para Ala na LCRMP-1 levou a impedir a formação de filopodia, migração e invasão de células de cancro, ao passo que uma substituição de Thr-628 para Asp restaurado grandemente a sua função (Fig. 2 e 3). Consistente com estas observações, a expressão ectópica de GSK3β cinase morta diminuída capacidade invasiva induzida LCRMP-1 (Fig. 4). Além disso, os doentes com NSCLC clínicos com baixo nível de LCRMP 1-expressão inactivo GSK3β e de alto nível de proteína está associada à sobrevivência global pobres do que aqueles com expressão e de baixo nível LCRMP-1 expressão de alto nível da forma inactiva GSK3β (Fig. 5B) . Assim, nossos resultados fornecem evidências para apoiar o mecanismo crucial de fosforilação GSK3β dependente para controlar a formação mediada LCRMP-1-filopódios, migração e habilidades invasivos em células cancerosas.

A análise da sequência indicou que não tem um Cdk5 ( priming local quinase) fosforilação em ambos LCRMP-1 e CRMP-1 (Fig. 1A). Após a fosforilação na Ser-636 por CDK5 GSK3β por sua vez fosforila a Ser-632 e Thr-628 sequencialmente. Portanto, GSK3β pode induzir bandas mais lento de migração em LCRMP-1 incluindo tanto Ser-632 e fosforilação Thr-628 em células, e as bandas induzidas por GSK3β constitutivamente ativa eram mais ativos do que a de tipo selvagem GSK3β (Fig. 1B). Na análise detalhada, descobrimos que LCRMP-1 mutante, T628A, poderia bloquear a maioria dos GSK3β fosforilação bandas que migram induzidas (Fig. 1C). Isto pode indicar que a Thr-628 de LCRMP-1 pode ser o sítio de fosforilação dominante e importante para GSK3β fosforilação. No entanto, não poderia excluir a possibilidade de que constitutivamente ativa GSK3β pode fosforilar outros locais de LCRMP-1.

O processo de invasão tumoral é principalmente através de alternâncias da matriz extracelular, incluindo a polimerização de actina e formação de filopódios [16]. Os nossos resultados revelam que o bloqueio da fosforilação mediada por GSK3β de LCRMP-1 na Thr-628 conduz a uma regressão da formação de filopodia. Um relatório anterior foi descrito que a GSK-3 fosforilação para Paxillin é necessária para o rearranjo do citoesqueleto [17]. Assim, especula-se que GSK3β pode promover positivamente regulação do citoesqueleto de actina e invasão tumoral. Em contraste com o papel positivamente, GSK3β também é relatado para desempenhar as suas funções supressivos para os seus substratos [18]. GSK3β fosforilação para alguns factores de transcrição nucleares, tais como β-catenina e caracol, gatilho degradação proteossómica, seguindo com a supressão sobre a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e invasão tumoral [6], [19] – [21]. GSK3β localiza simultaneamente no citoplasma e núcleo [22], como consistente com os nossos resultados da coloração imuno-histoquímica (Fig. 5A), e LCRMP-1 é uma proteína citosólica estável [10]. Portanto, GSK3β governar a invasão de células é possivelmente dependente da caracterização dos seus substratos proteicos. Alto nível de expressão LCRMP-1 está associado com a sobrevida global e livre de doença baixa comparado com grupo de baixa expressão em pacientes com NSCLC [10], [11]. Assim, LCRMP-1 potencialmente serve como um melhor candidato para identificar pacientes de alto risco. Neste estudo, nós mostramos uma descoberta muito interessante que pacientes com baixo nível fosforilada GSK3β e de alto nível LCRMP-1 expressões tiveram sobrevida global pior do que os outros grupos de catálogo. Centrando-se no baixo nível LCRMP-1 expressão ou a LCRMP-1 grupo expressão de alto nível, poderíamos também constatou que de alto nível de expressão GSK3β fosforilada pode discriminar melhor resultado da expressão de baixo nível fosforilada GSK3β, respectivamente. Os efeitos combinados da inativo GSK3β forma e LCRMP-1 expressão da proteína pode ter implicações clínicas importantes para indicar o subconjunto de alto risco de pacientes com NSCLC como candidatos para terapia adicional adjuvante eficaz. Os resultados sugerem que GSK3β fosforilação de LCRMP-1 está associada com mau resultado clínico. No entanto, ainda têm algumas limitações em nossos experimentos. Embora a referência indicaram que a Ser-9-fosforilada GSK3β pode indicar a situação de forma inactiva GSK3β devido à activação mediada por AKT que resulta na supressão da actividade GSK3β através de fosforilação na Ser-9 [15], se Ser-9 fosforilação de GSK3β inibe a sua capacidade de fosforilar LCRMP-1 ainda não está claro. Para resolver este problema, gerando um LCRMP-1 de anticorpo específico anti-fosfo-Thr-628 para imuno-histoquímica devem ser as questões mais importantes no futuro. Isso pode confirmar o significado clínico da GSK3β fosforilação induzida de LCRMP-1 em pacientes com NSCLC.

Além disso, também descobrimos que os pacientes com baixos níveis (n = 73) ou altos níveis (n = 69) de expressão GSK3β Ser-9-fosforilados foram quase iguais em distribuição. As células existem em diferentes níveis reais de GSK3β activo, a menos que as vias de sinalização distintas para inibição GSK3β são disparados simultaneamente, tais como MAPK e fosfatidilinositol-3-OH quinase vias Akt /[20]. Assim, especula-se que medida activado distinta das vias de sinalização para induzir uma inibição de actividade GSK3β pode levar a resultados diferentes para os pacientes com uma LCRMP-expressão. Portanto, investigar mais via de sinalização a montante para a regulação da GSK3β pode fornecer um melhor diagnóstico para pacientes com NSCLC com níveis baixos ou altos níveis de LCRMP-1 expressão.

Em conclusão, mostramos um novo mecanismo regulador para GSK3β para fosforilar um potenciador invasão LCRMP-1 e, portanto, poderia mais aperfeiçoar habilidades de invasão da célula cancerosa. Além disso, LCRMP-1 expressão e Ser-9 fosforilada níveis GSK3β pode ter implicações clínicas na predição evolução dos pacientes com NSCLC.

Materiais e Métodos

Ética declaração

esta investigação foi aprovado pelo Institutional Review Board do National Taiwan University Hospital e obtido termo de consentimento informado por escrito de todos os pacientes participantes envolvidos no nosso estudo.

pacientes e tumor amostras

Lung amostras de tecidos tumorais foram obtidas de pacientes (n = 142) com diagnóstico histológico de CPNPC que tinham sido submetidos a ressecção cirúrgica completa do Hospital Universitário Nacional de Taiwan (Taipei, Taiwan) entre 28 de dezembro de 1995, e 26 de dezembro de 2005. Esta investigação foi aprovada pela revisão Institucional Conselho de Administração da National Taiwan University Hospital. Os doentes recrutados não tinham sido tratados com quimioterapia ou terapia neoadjuvante irradiação. Todos os espécimes foram formalina fixado, seccionado, corado com hematoxilina e eosina, e examinadas por microscopia. estadiamento patológico foi realizada pelo Dr. Yih-Leong Chang (Departamento de Patologia e Instituto de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Nacional de Taiwan) de acordo com o sistema de estadiamento internacional para o cancro do pulmão [23].

A análise imunohistoquímica

coloração imuno-histoquímica de amostras de tecido de tumor de doentes com NSCLC foi realizada como previamente descrito [11]. Em resumo, as secções para análises de LCRMP-1 ou a expressão da proteína fosforilada foram autoclavados GSK3β primeiro no Trilogy Solução (Cell Marque Corp., Rocklin, CA) ou Antigen Retrieval Solution Citra (Biogenex, San Ramon, CA) a 121 ° C durante 10 minutos. As amostras foram, subsequentemente, feito um tratamento de 3% H

2O

2-metanol, a incubação com DakoCytomation dupla EndogenousEnzyme bloco (DakoCytomation, Inc., Carpinteria, CA) durante 10 minutos, V Bloco Ultra (Laboratório de Visão Corporation, Fremont, CA) durante 10 minutos, tampão de anticorpo-diluição (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) durante 10 minutos, e, finalmente, com uma GSK3β (sinalização celular fosforilada, Danvers, MA), anticorpo, durante 6 horas à temperatura ambiente ou um anti-LCRMP-1 anticorpo policlonal (C2; 1:300 diluição) durante a noite a 4 ° C. Detecção da imunocoloração foi determinada utilizando Super Sensitive não-Biotina Polymer Sistema de Detecção de HRP (BioGenex, San Ramon, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

Modificado Boyden invasão câmara de ensaio

câmaras de Boyden modificadas com inserções de policarbonato à membrana (tamanho de poro de 8 um; Falcon, Becton Dickinson) revestidas com 30 ug Matrigel (BD) foram realizados ensaios de invasão celular. 2,5 × 10

4 células em suspensão em meio RPMI contendo 10% de NuSerum (Invitrogen, Eugene, OR) foram plaqueadas nas câmaras superiores e 1 ml de meio, adicionou-se a cobrir as câmaras inferiores. Após 24 horas de incubação a 37 ° C, as células foram fixadas com metanol a temperatura ambiente durante 10 minutos. Após a fixação, as amostras foram coradas com uma solução /ml 50? G de iodeto de propídio (Sigma, St. Louis, MO) à temperatura ambiente durante 30 minutos. Cada membrana foi fotografado e contado o número de células sob um microscópio com uma ampliação de × 50, usando o pacote de software de estação de imagens analítica (Imaging Research Inc., St. Catharines, ON, Canadá). Cada experiência foi ensaiada em triplicado.

Imunofluorescência coloração para a observação da formação de filopodia

transfectadas ou células infectadas com lentivírus foram fixadas com paraformaldeído a 3,7% frio, lavou-se com PBS, seguido de permeabilização com 0,1% Triton X-100. As células foram então coradas com faloidina conjugada com rodamina (vermelho, Molecular Probes, Eugene, OR). As células foram montadas em lâminas de microscópio com reagente Antifade ProLong® ouro com DAPI (Molecular Probes) e, em seguida examinados e fotografados usando LSM digitalização a laser 700 microscópio confocal de Carl Zeiss.

análise de migração celular

faixas de células que migram em movimento foram realizadas por microscopia de lapso de tempo de vídeo, como descrito anteriormente [24]. Em resumo, as células foram mantidas em meio de crescimento a 37 ° C /5% de CO

2 e imagens de lapso de tempo foram observados sob um microscópio AF 6000 LX (Meyer Instruments, Inc.) Para o período de tempo de 20 horas. As imagens foram tiradas com uma câmera CoolSnap HQ CCD (Roper Scientific, NJ) em intervalos de 5 minutos e processado por MetaMorph 5.0 software (Universal Imaging, Downingtown, PA).

Cultura de células e transfecção

As linhas de células de adenocarcinoma de pulmão humano (células CL1-0) foram isolados a partir de um paciente do sexo masculino de 64 anos de idade com um adenocarcinoma pouco diferenciado e selecionados em nosso laboratório pela invasão in vitro Transwell para obter 5 sublinhas com capacidade de invasão progressiva, com genotípica semelhante fundo (designado CL1-1, CL1-2, CL1-3, CL1-4, e CL1-5) como anteriormente descrito [25]. linhas de células HEK293T foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, EUA). As células HEK293T CL1-0 e foram cultivadas em meio RPMI e DMEM contendo 10% de FBS e 2 mM de L-glutamina (todos da Invitrogen, Eugene, OR) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2- 95% de ar, respectivamente. Todas as linhas celulares neste estudo foram testados com condições isentas de micoplasma. Todas as experiências de transfecção foram realizadas com Lipofectamina ou reagentes Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

As sequências de proteínas de alinhamento e os plasmídeos

sequências de aminoácidos de alinhamento CRMP-2, 1-CRMP e LCRMP-1 são baseados em seu número de adesão banco Gene NP_001377, NP_001304, e NP_001014809, respectivamente. O LCRMP-1 de expressão do plasmídeo pCMV-Tag2A-LCRMP-1 (WT) e pEGFP-LCRMP-1 (WT) foram descritos como anteriormente [10]. mutantes de substituição de amino-ácido de LCRMP-1 foram gerados por mutagénese dirigida baseada em PCR com um kit QuikChange (Stratagene, Santa Clara, CA), e verificado por sequenciação de ADN. FLAG-marcado GSK3β (WT, CA e forma KD) plasmídeos de expressão foram subclonados a partir de pCMV-5A-GSK3β (WT, CA e forma KD, um presente de M.-C. Hung) em pFLAG -CMV-5a vetor (Sigma) .

anticorpos

os anticorpos primários para imunotransferência foram como se segue: anticorpo monoclonal anti-Flag (M2, Sigma), anti-myc (9E11; Millipore, Billerica, MA), anti-β-actina (Sigma) e anticorpo policlonal anti-LCRMP-1. anticorpos secundários a cabra conjugado com HRP anti-ratinho e de cabra anti-coelho foram adquiridos a partir de (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA):

produção e transdução Lentivírus

GFP, não marcado LCRMP-1. (WT, T628A e T628D), e-myc marcado GSK3β (WT, CA e forma KD) foram construídos por clonagem sua cDNA em pTYEF lentiviral vector.