Sumário

Os pacientes com cancro do ovário (OC) pode ser tratado com cirurgia, quimioterapia e /ou terapia de radiação, embora nenhuma destas estratégias são muito eficazes. Vários produtos naturais à base de plantas /suplementos dietéticos, incluindo extratos de

Emblica

officinalis

(Amla), demonstraram potentes propriedades anti-neoplásicas. Neste estudo, determinou que Amla extrair (AE) tem efeitos anti-proliferativa em células OC tanto sob

in vitro Comprar e

in vivo

condições. Determinou-se também os efeitos anti-proliferativos um dos componentes de AE, quercetina, em células ° C sob

in vitro

condições. AE não induzir a morte celular por apoptose, mas fez aumentar significativamente a expressão das proteínas autofágicos beclin1 e LC3B-II sob

in vitro

condições. A quercetina também aumentou a expressão das proteínas autofágicos beclin1 e LC3B-II sob

in vitro

condições. AE também reduziu significativamente a expressão de vários genes angiogénicos, incluindo o factor de 1α indutível por hipoxia (HIF-1α) em células OVCAR3. AE agido sinergicamente com a cisplatina para reduzir a proliferação celular e aumentar a expressão das proteínas autofágicos beclin1 e LC3B-II sob

in vitro

condições. AE também teve efeitos anti-proliferativos e induzida a expressão das proteínas autofágicos beclin1 e LC3B-II em tumores de xenoenxerto de ratinho. Além disso, AE reduzida de antigénio das células endoteliais – os vasos sanguíneos positivas CD31 e expressão HIF-1α em tumores do rato de xenotransplante. Juntos, esses estudos indicam que o AE inibe o crescimento celular OC ambos

in vitro

e

in vivo

possivelmente através da inibição da angiogênese e ativação da autofagia no OC. Assim AE pode ser útil como uma alternativa ou abordagem terapêutica adjuvante no combate às OC

Citation:. De A, De A, Papasian C, Hentges S, Banerjee S, Haque I, et al. (2013)

Emblica

officinalis

Extrato Induz Autophagy e cancro do ovário Inibe Humano proliferação celular, angiogênese, o crescimento da mouse heteróloga de tumores. PLoS ONE 8 (8): e72748. doi: 10.1371 /journal.pone.0072748

editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Março, 2013; Aceito: 12 de julho de 2013; Publicação: 15 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 De et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi suportado por um fundo intramural UMKC e um Prémio de Mérito VA Grant (SKB, SB). Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou a participação do manuscrito.

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de ovário (OC) é o segundo mais comum de câncer ginecológico e é a principal causa de. morte por câncer em mulheres nos Estados Unidos [1]. Anualmente, cerca de 22.000 mulheres nos Estados Unidos são diagnosticados com OC, e 15.000 mortes foram atribuídas ao OC só em 2011 [1]. OC é difícil de diagnosticar em seus estágios iniciais (I /II), e muitas vezes não é clinicamente suspeitos até que se espalha e avança para os estágios mais avançados (III /IV). Consequentemente, OC tem um prognóstico ruim, com uma taxa de sobrevivência de cinco anos para todas as fases de ~ 47% [2]. Actualmente, CO pode ser tratado com cirurgia, quimioterapia e radiação, com resultados sub-óptimos, como indicado pela taxa de sobrevivência de cinco anos citados acima. O desenvolvimento de novos fármacos anti-cancerígenos, ou combinações de drogas para o OC não forneceram razão significativa para ser otimista. Desde que as drogas anti-cancro convencionais podem ser altamente tóxicos, de compostos bioactivos derivados de plantas estão a ser investigados mais intensamente como terapias alternativas ou adjuvantes para várias formas de cancro [3]. Evidências recentes sugerem que extractos de plantas têm efeitos anti-tumor /anti-cancro /anti-proliferativa em linhas celulares tumorais humanas em cultura [4-7], e também tem um efeito anti-angiogénico em linhas celulares de cancro [8].

Amla (

Emblica

officinalis

) é uma planta fruited que tenha sido reconhecido por seu valor medicinal, e tem sido usado desde os tempos antigos no sistema tradicional indiano de medicina ‘Ayurveda’ para o tratamento de várias doenças, incluindo câncer [9-11]. O fruto da planta Amla contém 11 conhecido componentes medicinalmente relevantes, tais como o ácido gálico, ácido elágico, 1-O-galloyl-beta-D-glucose, 3,6-di-O-galloyl-D-glucose, ácido chebulinic, quercetina , ácido chebulagic, corilagina, 1,6-di-O-gallolyl glicose beta D, ácido 3-ethylgallic, isostrictiniin e ácido ascórbico [9]. Os ramos desta planta contêm sete compostos bioactivos – geranina, phyllanemblinins C e E, prodelphinidin B1, (2) epigalocatequina-3-O-galato, (S) -eriodictyol 7- [6-O- (E) -p-coumaroyl ] -BD-glucósido [12]. De entre este conjunto de compostos, o ácido gálico, ácido elágico, 1-O-galloyl-beta-D-glucose, ácido chebulinic, quercetina, ácido chebulagic, corilagina, ácido ascórbico, e geranina demonstraram propriedades anti-cancerígenas fortes individualmente, e estes podem ajudar a explicar as propriedades anti-câncer de todo extrato de Amla (AE) [9,13]. AE foi demonstrado inibir a proliferação de uma variedade de células cancerosas in

in vitro

, incluindo células OC, e também tem demonstrado efeitos anti-proliferativos

In vivo

[9-11]. Recentemente triphala, um remédio herbal contendo AE, também demonstrou propriedades anti-angiogênese [8].

Devido ao valor potencial de AE ​​como uma terapia anti-câncer, particularmente para OC, investigamos o anti- efeitos proliferativos e anti-tumorigênicos de AE ​​em linhagens de células do ovário e

in vitro Comprar e em um rato modelo de xenotransplante. Nós também investigaram o efeito de AE ​​na angiogénese tumoral em células em cultura e num modelo de murganho de xenoenxerto. Observou-se que AE não induzir a morte celular por apoptose, mas fez aumentar significativamente a expressão da proteína autophagic em cultura de tecido e o modelo de xenoenxerto de ratinho. Observamos, também, que a AE agido sinergicamente com a cisplatina para reduzir a proliferação celular e aumentar a expressão de beclin1 e LC3B-II sob

in vitro

condições.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os animais foram mantidos de acordo com as diretrizes padrão de associação americana para a Acreditação de Laboratório animal Care. O estudo foi aprovado pelo Institutional

Animal Care e Use Committee of the City VA Medical Center Kansas (Kansas City, MO).

cultura de células e reagentes

OVCAR3, SW626 e células da placenta humanos normais (HS 799 pl) foram obtidas da American Type Culture Collection. Dulbeccos meio de Eagle modificado (DMEM) e tripsina foram adquiridos a partir de Sigma, St. Louis, MO. células OVCAR3 e SW626 foram mantidas em DMEM com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone Laboratories, Logan, UT) e antibióticos, a 37

OC em um 5% de CO

2 ambiente. Todas as células utilizadas neste estudo estavam dentro de 10 passagens após o recebimento ou a recuperação (~ 2 e 1/2 meses de cultivo). AE para tratamento foi preparada a partir de comprimidos disponíveis comercialmente (Himalaya, EUA, Houston, TX, contendo 250 mg de Amla fruta e 350 mg de pó de caule Amla). Uma solução de estoque de EA foi preparada pela pesagem das comprimidos Amla, triturando-os, e a dissolução do pó em água estéril livre de endotoxina a 10 mg /ml. A solução foi filtrada através de uma membrana de acetato de celulose e 0,02 uM utilizado para tratar a cultura em diferentes concentrações.

Tratamento

10.000 células OVCAR3 ou SW626 foram plaqueadas em poços individuais de placas de 24 poços em 1 ml de meio contendo soro bovino fetal a 10% e incubou-se a 37

OC durante 24 h antes do início das experiências. Após a colocação inicial, o meio foi substituído com 1 ml de DMEM contendo soro (10%) e AE (0-400 ug /mL; em triplicado) para vários pontos temporais (6-96 horas) a 37

OC. O

In vitro

controlo (0 ug /ml de AE) receberam veículo (água) a um volume igual à concentração mais elevada de AE ​​utilizado. Nós também tratada células OVCAR3 com diferentes doses de quercetina (5-100 ug /mL; em quadruplicado) para vários pontos temporais (6-96 horas) a 37

OC.

in vitro

controle (0 ug /ml de quercetina) receberam veículo (DMSO; 4 ul, que é equivalente ao volume de 100 ug /ml de quercetina)

A proliferação celular

a proliferação celular foi avaliada através de ensaios de [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio] (MTT)) como descrito anteriormente [14] com modificações [15]. células OVCAR3 e SW626 foram cultivadas em placas de 24 poços contendo DMEM e FBS a 10%. Após o tratamento, o MTT (0,1 mg /poço) foi adicionado às células, seguido por incubação durante 4 h a 37

OC. Os cristais de formazano formados foram solubilizadas por incubação das células com 1 ml de álcool isopropílico que dissolveu o produto formazon azul que ocorreram durante a incubação com MTT. A densidade óptica foi medida a 560 nm num espectrofotómetro. O número de células funcionalmente activas (isto é, valores de densidade óptica) foi calculada para as comparações entre grupos de controlo e tratados

ADN fragmentação

O ADN foi preparado a partir de culturas tratadas e não tratadas, tal como descrito anteriormente [16. ]. Resumidamente, após o tratamento as células foram lisadas em 100 ul de tampão de lise (Tris 100 mM, pH 8,0, EDTA 20 mM, SDS a 0,5%) tratadas com 50 ug /ml de ARNase isenta de ADNase a 37

° C durante 30 min e 100 ug /ml de proteinase K durante 2 h a 50

OC. O DNA foi então extraído com fenol-clorofórmio e de clorofórmio e precipitado em 3 volumes de etanol. O DNA (1 ug /pista) foi sujeito a electroforese em géis de agarose a 1%. padrões de peso molecular foram executados simultaneamente. Os géis foram corados com brometo de etídio e fotografados utilizando um Chemidox (BioRad, Hercules, CA).

Extração de RNA

O ARN total foi extraído a partir de células OVCAR3 utilizando o método de extracção de Trizol. quantidade e qualidade mRNA foram determinadas medindo a sua absorvância na Genesys 6 Digitalização UV /VIS Scanning espectrofotômetro e também usando chip de RNA Experion (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

Gene matriz

a expressão diferencial de genes reguladores da angiogénese foi analisada utilizando oligo GEArray fornecida pelo fabricante (SA Bioscience Corporation, Frederick, MD, EUA). Em resumo, 3 ug ARN total foi transcrito de modo reverso em ADNc sondas de biotina-16-dUTP-rotulado com o método TrueLabeling-AMP utilizando 16 ul de polimerase de ARN 2,5X, 2 ul de 10 mM de UTP biotinilado, ARN-polimerase de 2 ul. As membranas SuperArray (SST-026) foram pré-hibridados a 60

OC durante 2 horas. A hibridação das sondas de cDNA marcado com biotina para as membranas foi realizada a 60

OC durante a noite com agitação lenta. As membranas hibridadas foram lavadas em tampão de solução salina de citrato de sódio (uma vez em 2 x SSC, 1% de SCS e uma vez em 0,1 x SSC, SDS a 0,5%). As membranas foram incubadas com estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina, e em seguida com o substrato quimioluminescente CDP-Star. Imagens das membranas foram adquiridos utilizando o sistema Chemidoc XRS (BioRad) e os conjuntos de dados foram exportados para GEArray Analyzer, o software desenvolvido pela SA Bioscience e analisados. O nível de expressão relativa de cada gene foi determinada por comparação da intensidade de sinal de cada gene na matriz após correcção para o fundo e normalização.

Os estudos in vivo de tumores

ratinhos nus com oito semanas de idade (nu /nu genótipo, Harlan Laboratories (Madison, WI) foram mantidos com água e comida

ad libitum

em um ambiente livre de patógenos com 12 h de luz e 12 h ciclo escuro em uma instalação de cuidados de animais em Kansas City VA Medical Center. cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as Diretrizes aprovadas do Comité de Conservação e Uso do animal de Kansas City VA Medical Center. OVCAR3 células (5X10

4) com Matrigel foram injectadas subcutaneamente no flanco direito traseiro de cada ratinho (4-5 ratinhos por grupo). o crescimento do tumor foi monitorizado após o 2

ND dia da injecção e continuou-se a 24 dias. comprimento e largura do tumor foram medidos utilizando um compasso e o volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula :. o volume do tumor = comprimento x largura x largura 0,5

Seis dias após a injecção, os ratos foram alimentados por via oral com 10% de sacarose (controlo) ou 10% de sacarose com AE por dia (100 mg /kg de peso corporal.). A dose de 100 mg /kg de peso corporal foi escolhido com base em um estudo preliminar que esta dose mostrou um efeito óptimo sobre a inibição do crescimento do tumor. Após 18 dias de tratamento, AE, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram removidos e fixados em formaldeído a 4% tamponado para um estudo mais aprofundado.

A imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada em 4% de formalina fixada em parafina-embedded secções de tecido de acordo com os nossos métodos anteriores [17,18]. Resumidamente, as secções de tecido foram fixadas em formaldeído a 4% tamponada e desparafinados em xileno, re-hidratadas em descendente concentrações de álcool, lavadas com PBS e bloqueadas com soro de bloqueio (Immpress-Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 20 minutos. As secções foram incubadas com beclin1, LC3B-II (Cell Signaling, Boston, MA), CD31, Ki67 (Abcam, Cambridge, MA) ou HIF-1α (Novus Biologicals, Littleton CO) anticorpo (1: 500 para todos os anticorpos) durante a noite em câmara úmida a 4

OC. A imunorreatividade foi detectada usando anticorpos secundários conjugados com estreptavidina (Immpress-Vector Laboratories) e as secções foram contrastadas com hematoxilina. As secções foram fotografadas com um fotomicroscópio digitais Leica. Para a quantificação de microvasos, as secções de tecido foram analisadas em ampliação de 50x e vasos CD31-positivas foram contadas. Quatro áreas de cada uma das 3 secções por tumor foram analisados.

células OVCAR3 foram fixados em formol 4% tamponada e lavadas em PBS. Após bloqueamento em soro de bloqueio, as células foram incubadas com beclin1, LC3B-II ou HIF-1α (1: 200) de anticorpos durante a noite a 4

OC. As células foram lavadas e a imunorreactividade foi detectada como descrito acima. O número de células imunocoradas e células totais foram contados e foi calculada a percentagem de células com imunomarcação.

Western Blot

As transferências de Western foram realizados como previamente descrito [19]. Resumidamente, a proteína foi extraída quer a partir de OVCAR3, SW626 células ou de tumores e a concentração de proteína foi medida pelo método de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Cada amostra (50 ug) foi executada sobre um gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida de SDS-sódio. A proteína foi transferida para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi incubada com o bloqueio de soro (Thermoscientific, Pittsburgh, PA) durante 1 h à temperatura ambiente, seguido por incubação durante a noite a 4

OC com anticorpo de Bax, Bcl-2, caspase 3, caspase 3, caspase 7, beclin1 ou LC3B -II (1: 1000, Cell Signaling) ou HIF-1α (1: 1000, Abcam). Após lavagem com tampão Tris-NaCl-Tween 20, a membrana foi incubada com os anticorpos secundários (1: 10000, Abcam) à temperatura ambiente durante 1 h. A imunorreactividade foi detectada usando quimioluminescência aumentada (Thermoscientic).

A análise estatística

Os ensaios foram realizados em triplicado e cada experiência foi repetida duas vezes. Todos os dados gráficos são apresentados como média + S.E.M. A significância foi testada usando testes t não pareado, de Student bilateral com variância desigual (Microsoft Excel, Redmond, WA).

p Art 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

AE inibe OVCAR3 e células SW626 proliferação

Para determinar se AE pode afectar a proliferação celular, testou-se o seu efeito em três linhas de células diferentes : 1) uma célula de cancro do ovário (OVCAR3), 2) um adenocarcinoma primário do cólon metástase no ovário (SW626), 3) um células da placenta humanos normais (HS 799). células da placenta normal foram usados ​​para determinar se AE tem qualquer efeito sobre as células não neoplásicas. Além disso, utilizou-se células SW626 para determinar se AE é capaz de inibir tumores que tinham metástase a partir de outros locais para o ovário, e para determinar se os efeitos de AE ​​na OVCAR3 seria duplicado com outras células cancerosas. células OVCAR3 foram tratados com concentrações variáveis ​​de AE ​​(0-1000 ng /ml) durante 24 horas e o número relativo de células foi inferida utilizando ensaios MTT. As baixas concentrações (10-200 ug /ml) de EA não afectou a proliferação celular; No entanto, a proliferação celular foi significativamente inibido em concentrações que variam a partir de AE ​​300-1000 ng /mL (Figura 1A). Foram tratados células da placenta normal (HS 799 pl) com diferentes doses (100-500 ug /ml) de AE ​​de 48 horas para determinar se AE foi geralmente citotóxica, e que determinado AE tinha essencialmente nenhum impacto sobre a sobrevivência das células em qualquer das concentrações testado (Figura 1B). Nós tratada ambas as células SW626 e OVCAR3 em cultura com concentrações crescentes de AE ​​durante vários tempos antes de realizar ensaios MTT. perda rápida da proliferação celular ocorreu em concentrações crescentes de AE ​​em ambos OVCAR3 e SW626 células (Figura 1A, 1C, 1D). Em ambas as linhas celulares, inibição da proliferação de células induzida por AE foi dependente da concentração e do tempo de incubação (Figura 1C, 1D). A menor concentração de AE ​​testada (100 ug /ml) causaram uma inibição significativa (p = 0,001) de células OVCAR3 por 72 horas, e a dose mais elevada (400 ug /ml) potentemente inibida (p = 0,007) o crescimento de células OVCAR3 por 12 horas (Figura 1C). Em células SW626, AE a 100 ug /ml causou uma inibição significativa de 48 horas (p = 0,001), e a dose mais elevada de crescimento foi inibido (p = 0,001) por 6 horas (Figura 1D)

A. Dose efeito dependente da AE sobre a proliferação de células OVCAR3. B. Dose efeito dependente da AE na morte celular em células da placenta normais (HS-799 pl). CD. Dose e do tempo efeitos dependentes de AE ​​na proliferação OVCAR3 (C) e as células SW626 (D). E. Dose efeito dependente da quercetina sobre a proliferação de células OVCAR3. OVCAR3 e células SW626 foram cultivadas e crescidas durante 2 dias em DMEM em presença de soro a 10% tal como descrito em Materiais e Métodos. Após este período, as culturas foram alimentadas com meio contendo 10% de soro e diferentes doses de AE, durante 24 horas, excepto estudo dependente do tempo. Os dados são a média + S.E.M. a partir de 6 observações independentes. *, P . 0,05, significativamente diferente do grupo de controlo tratado com veículo

A quercetina inibe a proliferação celular em células OVCAR3

Depois de determinar que AE dose e dependente do tempo reduziu a proliferação celular em células OVCAR3, testou-se o tratamento das células ° C com diferentes doses (0-100 ug /ml) de quercetina – um dos componentes de AE– poderia reduzir a proliferação celular em células OVCAR3. A menor concentração de quercetina testado (5 ug /ml) causaram uma inibição significativa (p = 0,01) de células OVCAR3 por 48 h, e a dose mais elevada (100 ug /ml) inibiu (p = 0,005) o crescimento de OVCAR3 células por 24 h (Figura 1E).

AE altera a morfologia das células OVCAR3 e SW626

a inibição da proliferação pode alterar o tamanho e a morfologia das células individuais [20]. Portanto, observou-se cuidadosamente a morfologia das células SW626 OVCAR3 e após o tratamento com 0-300 ug /ml de AE. A morfologia das células OVCAR3 tratados com 100 e 200 ug /ml de AE ​​foi indistinguível das células não tratadas depois de 24 horas (Figura 2 A-C), enquanto que o tratamento com 300 ug /ml para 24 horas causou a maioria das células se tornem redondo ( Figura 2D). AE também induziu alterações dependentes da dose na morfologia das células SW626 após 24 horas (Figura 2E-H). Um exame mais minucioso revelou que o tratamento com 300 ug /ml de AE, durante 24 horas induzidas vacúolos citoplasmáticos em ambos OVCAR3 e células SW626 (Figuras 2J, 2N, 2L, 2P). Estas alterações morfológicas sugerem que a morte celular pode estar a ocorrer uma vez que a morte celular, por vezes, é acompanhada pela formação de vacúolo [21]. Outras experiências foram realizadas utilizando 300 mg de concentração /ml de AE.

A-D. efeito dependente da dose de AE ​​na morfologia celular e a densidade de OVCAR3: A = Controlo B = 100 ug /ml de AE, C = 200 ug /ml de AE, D = 300 ug /ml de AE. EH. Dose efeito dependente da AE na morfologia e densidade celular de células SW626. E = Controlo, F = 100 ug /ml de AE, L = 200 ug /ml de AE, H = 300 ug /ml de AE. I-J, H-N. AE aumentado em vacúolos citoplasmáticos OVCAR3. I e H = Controlo, J e N = 300 ug /ml de AE. K-G e O-P. AE aumentado vacúolos citoplasmáticos em SW626. K e S = Controlo, L e P = 300 ug /ml de AE. OVCAR3 e células SW626 foram cultivadas e crescidas durante 2 dias em DMEM em presença de soro a 10% tal como descrito em Materiais e Métodos. Após este período, as culturas foram alimentadas com meio de soro a 10% e diferentes doses de AE, durante 24 horas. Alguns dos vacúolos estão indicados por setas (N e P). Barra = 50 uM.

AE não causar morte celular por apoptose em células OVCAR3 e SW626

Tendo em conta as alterações morfológicas descritos acima, o que sugere que o tratamento de linhas celulares de CO, com 300 /ug ml de morte celular induzida AE, queríamos determinar se o tratamento induziu a apoptose AE destas linhas celulares. Foram utilizadas duas abordagens diferentes para explorar esta possibilidade: 1) Exame de DNA para a fragmentação internucleossômica, um marco da morte celular por apoptose, e; 2) para transferência de Western de proteínas específicas (por exemplo bax, bcl

2, caspase 3, caspase 3 clivada e caspase 7) envolvida na via apoptótica. Para determinar se AE causada fragmentação de ADN internucleosomal, ADN preparado a partir de culturas de controlo e tratados com AE foi fraccionado em géis de 1% de agarose a 24 e 96 horas após a adição de AE ​​(300 ug /ml). Embora a degradação do ADN foi observada nestas preparações, não havia nenhuma fragmentação de ADN aparente mesmo após 96 horas de tratamento (Figura 3A-B), sugerindo que a morte celular não ocorre por apoptose. Para explorar ainda mais o papel potencial de vias apoptóticas em morte de células de AE, Western blots tratada para Bax, Bcl

2, caspase 3, caspase 3 clivada e caspase 7 foram realizados. Em células OVCAR3, tratamento AE reduzida a expressão da Bax, Bcl

2 e clivada da caspase 3 (Figura 3C, 3E e 3I), e não alterou a expressão de caspase 3 ou caspase 7 proteínas (Figura 3G e 3K). Em células SW626, o tratamento AE não alterou a expressão de Bax, Bcl

2, caspase3, ou caspase7 (Figuras 3D e 3F, 3H e 3L) e reduziu a expressão da caspase 3 clivada (Figura 3J). Coletivamente, os resultados suportam a conclusão de que as vias apopotic não são ativados em AE tratada linhas celulares OC.

A-B. Fotografias representativas de fragmentação do DNA em células OVCAR3 (A) e células SW626 (B). células OVCAR3 e SW626 foram tratadas com 300 ug /ml de AE ​​como descrito em Materiais e Métodos. Após o tratamento, o ADN foi extraído e sujeito a electroforese em 1% de gel de agarose. O tamanho de pares de bases dos marcadores de peso molecular (pista) está indicada ao lado do gel. O número do lado direito indica o comprimento em nucleótidos para várias das bandas. C24 = Controle de 24 horas, C96 = Controle de 96 horas, T24 = AE 24 tratamento hora, T96 = AE 96 tratamento hora, + C = Controlo positivo, S = DNA tamanho padrão. C-G. Expressão das proteínas apoptóticas após o tratamento AE (300 ug /ml) em células OVCAR3 e SW626. Fotografias representativas de Western blot de Bax (C, D), Bcl

2 (E, F), caspase 3 (G, H), clivado da caspase 3 (i, j), Caspase 7 (k, l) em OVCAR3 (C, e, G, I, K) e SW626 (D, F, H, J, L) após o tratamento de células de AE ​​são mostradas na parte superior. β-actina foi detectado como um controlo para cada mancha. O histograma correspondente a cada fotografia representa a razão de análise densitométrica de cada banda com a respectiva banda β-actina. A cultura foi tratada com 0 ou 300 ug /ml de AE ​​de 24 horas. Após o tratamento, a proteína a partir de células OVCAR3 e SW626 foi extraída e 30 ug de proteínas foram submetidas a electroforese em SDS-PAGE. A proteína foi então transferida para uma membrana de nitrocelulose e imunotrans contra anticorpos relacionados com apoptose – Bax, Bcl

2, caspase 3, caspase 3 clivada ou caspase 7. Os valores são médias ± S.E.M. de 4 experiências independentes. *, P 0,05, em comparação com o grupo controle

AE induz autofagia em OVCAR3 e SW626 células

recentes

in vivo

e

in vitro.

evidência sugere que um número de fármacos exercem os seus efeitos anti-cancerígenos, pelo menos parcialmente, através dos seus efeitos sobre a autofagia [22,23]. Os estudos acima sugerem que as vias apopotic não foram ativados por tratamento AE, então optamos para determinar se a autofagia foi ativado em células OC tratados AE. Especificamente, tratada OVCAR3 e células SW626 com AE para determinar os efeitos na expressão de beclin1 proteins- autofágicos e LC3B-II, utilizando técnicas de imunocitoquímica e immunoblotting. A imunorreactividade para ambos os beclin1 e LC3B-II estava presente em não tratada OVCAR3 e células SW626 (Figura 4-A, B, E, F). A intensidade da imunocoloração e o número de células imunopositivas, no entanto, foram aumentadas por tratamento AE [Figura 4 A-H]. A análise Western blot foi consistente com os resultados da coloração imunológica, o que demonstra que o tratamento aumentou a expressão de EA de beclin1 e LC3B-II em ambos OVCAR3 e células SW626 (Figura 4 I-P). Estes dados sugerem que a autofagia é activada em células tratadas AE. Nós também estudada a expressão das proteínas autofágicos beclin1 e LC3B-II após tratamento quercetina (5 ug /ml para 48 horas) em células OVCAR3 utilizando imunotransferência. Expressão de beclin1 e LC3B-II foi significativamente mais elevada em células tratadas quercetina do que o controlo (Figura 4 Q-T).

A imunocoloração de beclin1 e LC3B-II em células OVCAR3 e de controlo SW626 e depois de ter sido tratado com 300 ug /ml de AE ​​(A, B, e e F). Os histogramas mostram a percentagem de beclin1 (C e D) e LC3B-II (G e H) de células imunopositivas como uma percentagem do total de células. OVCAR3 e células SW626 foram cultivadas e crescidas durante 2 dias em DMEM, na presença de soro a 10% tal como descrito em Materiais e Métodos. Após este período, as culturas foram alimentadas com meio contendo 10% de soro e AE durante 24 horas. As células foram fotografadas em 400 x ampliação. Expressão de beclin1 em proteína total de OVCAR3 (I) e as células SW626 (J) e a expressão de LC3B-II da proteína total de OVCAR3 (M) e SW626 (N) células depois de terem sido tratados com AE (300 ug /ml) durante 24 hrs. fotografia representativa de western blot para beclin1 e LC3B-II são mostrados no topo. β-actina foi detectado como controlo para cada mancha. A média + S.E.M. valores de razão de beclin1 densitométrica (K e L) e LC3B-II (O e P) com β-actina estão apresentados na parte inferior de cada respectivo gel. Q-T: tratamento A quercetina (5 ug /ml para 48 horas) induz a expressão de beclin1 (Q, R) e LC3B-II (C, T) em células OVCAR3. Após o tratamento, a proteína a partir de células OVCAR3 e SW626 foi extraída e 50 ug de proteínas foram submetidas a electroforese em SDS-PAGE. A proteína foi então transferida para uma membrana de nitrocelulose e imunotrans anticorpos contra beclin1 e LC3B-II. Depois de bandas positivas imunodetecção, beclin1 e LC3B-II foram medidos densitometricamente e normalizados com os valores de p-actina. Os valores são médias ± S.E.M. de 6 expericias independentes. *, P 0,05, em comparação com o grupo de controlo. Bar = 50 mm.

AE inibe genes relacionados com a angiogénese em células OVCAR3

Em vista do fato de que uma massa tumor em crescimento deve estabelecer um suprimento vascular e relatórios recentes que a angiogênese poderia ser inibida por remédios de ervas que incluíam AE [8], queríamos determinar se AE poderia inibir a angiogênese

in vitro

. Especificamente, foram estudados os efeitos do tratamento AE sobre a expressão de genes angiogénicos no-tratados AE (300 ug /ml) e células OVCAR3 não tratados usando a matriz humano Angiogênica OligoGE que detecta 112 genes envolvidos especificamente na angiogénese (SA Bioscience Corporation). Os experimentos foram realizados em três ensaios independentes e os resultados são mostrados na Figura 5 A-D. Muitos genes (verde

*) foram expressos em níveis reduzidos nas células tratadas com AE em comparação com controlos não tratados (Figura 5B). Um clustergrama que descreve os resultados obtidos em culturas de controlo e tratados com AE é mostrado na Figura 5C. A expressão de COL4A3, CXCL6, ECGF1, EFNB2, FGF2, IL1β, PDGFB, TNFRSF12A e HIF-1α foram reduzidas para menos de 40% dos níveis de controlo (Figura 5D), com HIF-1α sendo inibida na maior medida.

A. As fotografias representativas de micro matriz de controle e cultura tratada AE. A cultura foi tratada com 0 ou 300 ug /ml de AE, durante 24 h. Após o tratamento, o ARN foi isolado utilizando o método de extracção Trizol. As membranas foram hibridadas com superarray marcado com biotina ADNc, incubadas com estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina, a expressão do gene foi detectado com o substrato quimioluminescente CDP-Star. B. scatterplot Representante da AE-tratados vs culturas de células controle. Muitos genes (verde

*) estão sob expressa em grupo tratado com AE. C. Painel esquerdo: Mapa de Calor (clustergrama) de controle e culturas tratadas com AE. Nove genes que são reduzidas em mais de 70% são indicadas por pontas de setas no lado direito do mapa de calor. o painel do meio: Um mapa de calor ampliada que mostra a expressão reduzida de HIF-1α no grupo tratado com AE. Painel da direita: A magnitude da expressão do gene. representação D. gráfica da expressão gênica relativa usando o fundo global e GAPDH como gene de referência e convertido para dobrar de mudança de valores (AE versus controle).

AE inibe a expressão de HIF-1α in vitro

Em experiências anteriores, foi demonstrado que o tratamento AE suprimida a expressão de numerosos genes associados com a angiogénese. A fim de determinar se a diminuição da expressão do gene correspondeu à diminuição dos níveis de proteína, foram examinados especificamente o efeito do tratamento de AE ​​na produção de proteína HIF-1α em células OVCAR3 usando imunocitoquímica e Western blots. Ambos imunocitoquímica e os resultados Western blot mostraram uma redução significativa expressão de HIF-1α em culturas de células OVCAR3 (Figura 6 A-B), apoiando ainda mais o conceito de que o tratamento AE suprime angiogênese.

A. Fotomicrografia apresentando reduzida expressão de immunostatining HIF-1α em células OVCAR3 após o tratamento AE. O histograma mostra a percentagem de células imunopositivas HIF-1α em comparação com células totais. células OVCAR3 foram cultivadas e semeadas e tratadas com 0 ou 300 ug /ml de AE, durante 24 horas. As células foram imunocoradas com anticorpo HIF-1α e fotografado em aumento de 400X. Barra = 50 uM. Os valores são médias ± S.E.M. de 4 experiências independentes. *, P 0,05, em comparação com o grupo de controlo. B. Uma fotografia representativa de Western blot para HIF-1α é mostrado no topo. β-actina foi detectado como um controlo para cada mancha. A média + S.E.M. valores da razão densitométrica de HIF-1α e β-actina estão apresentados na parte inferior do gel. Depois de imunodetecção, o volume de bandas positivas HIF-1α foi medida densitometricamente e normalizados com os valores de p-actina. Os valores são médias ± S.E.M. de 4 experiências independentes. *, P 0,05, em comparação com o grupo de controlo.