Abstract
pâncreas adenocarcinoma ductal é a quarta principal causa de morte por câncer em todo o mundo, com nenhum tratamento satisfatório até à data. Neste estudo, testou-se a inibição combinada da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e da desacetilase de histona de classe I (HDAC) podem resultar numa melhor controlo do adenocarcinoma ductal pancreático. O impacto da HDAC concomitante e a inibição de COX-2 sobre o crescimento celular, a apoptose e o ciclo celular foi avaliada em primeiro lugar
In vitro
no pâncreas humano BxPC-3, PANC-1 ou CFPAC-1 As células tratadas com inibidores químicos ( SAHA, MS-275 e celecoxib) ou HDAC1 /2/3/7 siARN. Para testar o potencial de atividade antitumoral desta combinação
in vivo
, temos desenvolvido e caracterizado, um modelo de tumor membrana corioalant�ca pintainho refinado que histologicamente e proteomically imita humano pancreático adenocarcinoma ductal. A combinação de HDAC1 /3 e inibição da COX-2 prejudicado significativamente a proliferação das células BxPC-3
in vitro Comprar e parou completamente o crescimento do tumor células BxPC-3 sobre a membrana corioalant�ca
in vivo
. A combinação foi mais eficaz do que qualquer um dos fármacos utilizados sozinhos. Consistentemente, que mostrou que tanto a HDAC1 e inibição HDAC3 induziu a expressão de COX-2 por meio da via de NF-kB. Os nossos dados demonstram, pela primeira vez, em um modelo de Ductal Pancreático Adenocarcinoma (PDAC), uma acção significativa de HDAC e inibidores COX-2 sobre o crescimento de células de cancro, que estabelece a base para o desenvolvimento de novas terapias combinatórias potencialmente eficazes para o adenocarcinoma ductal pancreático pacientes
Citation:. Peulen O, Gonzalez A, Peixoto P, Turtoi A, Mottet D, Delvenne P, et al. (2013) O efeito anti-tumoral de HDAC Inibição em um modelo de cancro do pâncreas humano é significativamente melhorada pela simultânea inibição da ciclooxigenase 2. PLoS ONE 8 (9): e75102. doi: 10.1371 /journal.pone.0075102
editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Alemanha |
Recebido: 07 de maio de 2013; Aceito: 12 de agosto de 2013; Publicação: 11 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Peulen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelo Fundo Nacional de Bélgica de Pesquisa Científica (https://www.frs-fnrs.be) e Télévie; o Centro Anti-Cancéreux près de l’Université de Liège (https://www.cac.ulg.ac.be). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. A. Gonzalez é um companheiro Télévie. A. Turtoi e D. Mottet são, respectivamente, pesquisador pós-doutorado e pesquisador associado ao Fundo Nacional de Bélgica para a Investigação Científica
Conflito de interesses:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem
Introdução
pâncreas ductal adenocarcinoma (PDAC) listas entre a forma mais mortal de cancro [1]. Em estágio inicial da doença é clinicamente silenciosa eo diagnóstico da doença é feito principalmente em um estágio avançado. Este diagnóstico tardio contribui para um dos a menor taxa de sobrevida em 5 anos (apenas 3%) [2]. Hoje PDAC são tratadas por cirurgia e /ou terapia adjuvante com gemcitabina, aumentando apenas ligeiramente a sobrevivência média dos doentes. Há, portanto, uma necessidade urgente de desenvolver novas terapias eficazes para pacientes PDAC.
Há abundante evidência indicando que a desregulamentação de acetilação das histonas contribui para o desenvolvimento e progressão do câncer de pâncreas [3]. histona-desacetilases (HDAC) representam uma família de enzimas que regulam actividades celulares incluindo primordiais epigenética silenciamento de genes supressores de tumores e a modulação das funções das proteínas. Nós e outros autores demonstraram que a inibição de HDAC exerce tanto anti-cancro e anti-angiogénese [4] – [6]. expressão de HDAC é alterada em PDAC, incluindo HDAC1, HDAC2, HDAC3 HDAC7 e [7] – [10]. Estudos pré-clínicos sugerem que a inibição de HDAC possuem um potencial significativo para o desenvolvimento de novas terapias anticancro [11]. Por conseguinte, vários inibidores de HDAC foram recentemente aprovados pela Food and Drug Administration para o tratamento cutâneo de T-Cell Lymphoma enquanto novas moléculas estão actualmente em fase III de ensaios clínicos. No entanto, quando utilizado em monoterapia, os inibidores de HDAC mostraram uma eficácia limitada em vários tumores sólidos, incluindo PDAC [3], [12], [13]. Com efeito, LAQ824 ou o MS-275 foram avaliadas na Fase I de ensaios clínicos em cancros sólidos, incluindo PDAC, sem qualquer resposta clínica objectivo [14], [15]. Em alternativa, os inibidores de HDAC foram utilizados em estratégias de terapia combinada de [16], [17], com algumas combinações de gerar efeitos promissores para PDAC humano
In vitro
[18] – [21] ou em tumores experimentais [22] . Infelizmente, estes resultados não se traduzem em ensaios clínicos [23], [24].
A falta de eficácia dos inibidores de HDAC em câncer pancreático pode ser ligado às actividades pleiotrópicas de HDACs em biologia celular [25], [26] levando a efeitos indesejados pró-cancerosas. Por exemplo, um estudo recente demonstrou que os inibidores de HDAC induzem pan-expressão de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) em células de cancro do pulmão, que conduz a uma estimulação da proliferação de células endoteliais [27]. Uma vez que a COX-2 tem também sido associada à proliferação de pâncreas de células de cancro [28] ou o crescimento de tumores [29] – [31], a hipótese de que a COX-2 sobre-expressão pode também ser induzida em PDAC quando tratadas com inibidores de HDAC, levando a uma diminuição da eficiência e insuficiência daí terapêutico.
Para testar a relevância biológica de classe combinando I de HDAC e inibidores COX-2
in vivo
, eu inventei um modelo refinado pintainho PDAC corioalant�ca membrana (CAM) com base na nossa trabalho anterior [32]. O modelo de CAM tem sido usado com sucesso com várias linhas de células para produzir tumores [33], [34]. De forma semelhante ao modelo de murino, a maioria dos passos de progressão tumoral são recapitulados num período muito curto de tempo [35]. Anteriormente, BxPC-3 células de câncer de pâncreas já foram demonstrados para produzir vascularizados 100 mm nódulos tumorais longos no CAM [32]. No entanto, o pequeno tamanho dos nódulos representada uma limitação significativa para observação estrutural, a avaliação do volume preciso e estudo da eficácia da droga. Aqui, temos estabelecido e implementado um modelo PDAC BxPC-3 refinada apresentando um aumento dramático (64 vezes) no tamanho do tumor e exibindo estrutural arquitetura e expressão de proteína imitando PDAC humano. Este modelo foi explorada com sucesso para demonstrar que a combinação de HDAC de classe I e inibidores COX-2 resultar numa inibição do crescimento tumoral completa.
Materiais e Métodos
células e substâncias químicas
BxPC-3 (ATCC CRL-1687), PANC-1 (ATCC CRL-1469) e CFPAC-1 (ATCC CRL-1918) são linhas de células de cancro pancreático humano derivadas respectivamente de PDAC [36], pâncreas conduta epitelióide carcinoma [37 ] e metástase PDAC fígado [38]. BxPC-3 foram uma generosa oferta do Prof. Bikfalvi (Inserm u1029, Bordeaux, França), Panc-1 foram uma generosa oferta do Prof. Muller e Burtea (RMN Laboratory, da Universidade de Mons, Bélgica). CFPAC-1 foram comprados de ATCC. Celecoxib foi obtido a partir da Farmácia University (Kemprotec Ltd, Middlesbrough, UK). MS-275 e SAHA foram adquiridos a Life Sciences Enzo (Antuérpia, Bélgica). Outros produtos químicos foram adquiridos a Sigma (Bornem, Bélgica).
cultura celular
BxPC-3 linha celular de cancro pancreático humano foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com glucose (2,5 g /L), de sódio piruvato (1 mM) e FBS (10%). PANC-1 foram mantidas em DMEM suplementado com FBS (10%). CFPAC-1 foram mantidas em Meio de Dulbecco Modificado por Iscove com FBS (10%). As células foram tratadas com o MS-275, celecoxib, ou combinação de ambos, bem como com suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) solubilizado em meio com DMSO a 0,1%.
pequeno ARN interferente transfecção
específico de HDAC-
pequeno ARN interferente (siRNA) foram sintetizados por Eurogentec (Seraing, Bélgica). NF-kB p65 SmartPool siRNA foram comprados de Thermo Fisher-Dharmacon (Whaltham, MA). transfecções Lipofectamina mediadas foram realizados a uma concentração de 40 nM de ARNsi seguindo as recomendações do fabricante (Life Technologies, Carlsbad, NM). GL3 luciferase era um siRNA alvejando irrelevante. sequências de siRNA foram publicados anteriormente [5].
O crescimento celular
Igualdade de densidades de células foram semeadas em meio completo e foram colhidas nos indicados pontos temporais. Os números de células foram determinados utilizando indirectamente Hoechst incorporação. Os resultados foram expressos como o teor de ADN.
Western-blotting
BxPC-3 de células ou tumores congelados foram rompidas em tampão de lise (1% de SDS, 40 mM Tris-HCl pH 7,5) na presença de inibidores de protease e fosfatase. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE (6-12,5%), em seguida, electrotransfered em membranas de nitrocelulose. Seguindo os anticorpos primários foram utilizados: anti-COX-2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), anti-HDAC1 (sinalização celular, Danvers, MA), anti-HDAC2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-HDAC3 (sinalização celular, Danvers, MA), anti-acetilado-Histona-3 (Millipore, Billerica, MA), anti-HDAC7 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-fosfo-IkBα (sinalização celular, Danvers, MA ), anti-p65 (sinalização celular, Danvers, MA), anti-p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-p27 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), anti-pRB (BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ), anti-E2F1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti MEK2-(sinalização celular, Danvers, MA), anti ORC2-(sinalização celular, Danvers, MA), anti-caspase-3 (sinalização celular , Danvers, MA) e anti-hsc70 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). A imunodetecção foi realizada utilizando um anticorpo secundário apropriado conjugado com peroxidase de rábano.
quantitativo em tempo real de RT-PCR
extracção de RNA total e quantitativa em tempo real de RT-PCR foram realizados como previamente descrito [39] . Humana expressão de COX-2 foi detectada utilizando um ensaio comercial TaqMan RT-qPCR (Hs00153133-M1; Applied Biosystems, Carlsbad, NM). IL-8 humana foi detectada utilizando expressão específica para a frente (5′-GAAGGAACCATCTCACTGTGTGTAA-3 ‘) e reverso (5′-ATCAGGAAGGCTGCCAAGAG-3’) iniciadores sintetizados por Eurogentec (Seraing, Bélgica).
Anexina V /propídio iodeto de coloração
as células apoptóticas foram determinados por iodeto de propídio corante anexina V-FITC e não vital (PI) da coloração com um kit de detecção de apoptose FITC anexina V I (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) de acordo com a as instruções do fabricante. A citometria de fluxo foi realizada num FACSCalibur II ™ e as amostras foram analisados utilizando o software CellQuest ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).
ciclo celular análise
A percentagem relativa de células em cada fase do ciclo celular foi analisada como anteriormente descrito [33], através da análise por citometria de fluxo com o programa FACSCalibur II ™ e ModFit LT ™.
o crescimento do tumor na CAM
ovos de galinha fertilizados foram abertos como anteriormente descrito [32]. No pós-fertilização dia 11, a superfície CAM foi gentilmente riscado com uma agulha e 3,5 × 10
6 BxPC-3, PANC-1 ou células CFPAC-1 em suspensão com 50% de matrigel em um volume final de 100 mL foram enxertados na CAM fechado por um anel de plástico de 6 mm. O implante dia foi considerado como o dia 0 de desenvolvimento do tumor. Drogas (celecoxib 8 uM e /ou MS-275 de 0,2 M em 30 uL de volume final) foram aplicados diariamente directamente no tumor começando no dia 2. No dia 7, os tumores foram excisados a partir da CAM e imagens digitais foram feitas usando um estereomicroscópio . O volume do tumor foi calculado utilizando uma fórmula elipsóide: volume = (4 × πxZ
1 × Z
2 × Z
3) /3 onde Z
1-3 são a principal raio do tumor.
Ética declaração
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar animal da Universidade de Liège (aprovação # 1278).
procedimento Histologia
BxPC -3 tumores foram lavadas em PBS e em seguida fixadas em paraformaldeído a 4% durante 30 min a 4 ° C. Os tumores foram embebidos em parafina e 5 mm foram corados com Hematoxilina-eosina ou Masson
.
Immunoperoxydase e ácido amilase-periódico de Schiff (PAS) coloração foram realizados em 5 mm de, respectivamente, com a XT BenchMark IHC /ISH Stainer automatizado e o NexES colorações especiais (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) de acordo com as instruções do fabricante. foram usados seguintes anticorpos: anti-citoqueratina 7 (CK7 – Dako, Glostrup, Dinamarca), anti-citoqueratina 19 (CK19 – Roche Diagnostics, Vilvoorde, Bélgica), anti-citoqueratina 20 (CK20 – Dako, Glostrup, Dinamarca), anti- CD56 (Novocastra, Leica Microsystem Inc, Buffalo Grove, IL), o antígeno anti-carcinoembrionário (CEA – Roche Diagnostics, Vilvoorde, Bélgica), anti-Ki67 (Dako, Glostrup, Dinamarca), anti-latente proteína de ligação fator transformador de crescimento beta 2 (LTBP2 – Santa Cruz Biotchnology, Santa Cruz, CA), anti-factor de transformação de crescimento induzida por beta (TGFBI – sinalização celular, Danvers, MA), anti-myoferlin (Sigma, Bornem, Bélgica) e anti-desmina (Dako, Glostrup, Dinamarca) foram usadas para a reacção primária.
Ki67 quantificação foi realizada em fotografias tiradas aleatoriamente (3 imagens de cada tumor, 3 tumores em cada grupo experimental). Após a divisão do canal, azul canal fotos foram binarizadas acordo com a luminosidade. O tamanho da área ocupada por todas as células, ou por células Ki67-positivas foi medida usando o software ImageJ 1.46r.
De modo a visualizar a vasculatura do tumor, as secções de tecido grosso re-hidratados (35 uM) foram incubadas durante 30 min em no escuro, com 0,05% de Triton X-100 em PBS contendo 5 ug /ml
Sambucus nigra
aglutinina (SNA, Vector Laboratories, Burlingame, CA). As secções foram lavadas com 0,05% de Triton X-100 em PBS e visualizadas com o microscópio confocal (Leica SP2). imagens tridimensionais foram reconstruídos com software Imaris (Software Científico Bitplane, Zurich, Suíça).
A análise estatística
Todos os resultados foram relatados como média com desvio padrão. A análise estatística foi realizada utilizando uma ou vias ANOVA de duas vias, dependendo do número de factores de agrupamento. as médias do grupo foram comparadas pelo pós-teste de um Bonferroni. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os experimentos foram realizados como 3 repetições biológicas independentes.
Resultados
Classe I HDAC crescimento de células cancerígenas de inibição reduzida pâncreas in vitro
BxPC-3 células foram descritas para expressar alterada níveis de classe I HDAC1, HDAC3 e classe II HDAC7 [40], [41]. Para avaliar o papel destas HDAC em BxPC-3 células, examinamos primeiro o seu crescimento e dependente da concentração em função do tempo em presença de SAHA, uma classe I /II inibidor (Figura 1A). Os resultados confirmaram que as células BxPC-3 foram sensíveis a SAHA, com uma redução de 50% do crescimento (P 0,001) foi observada a 5 uM. HDAC1 seguinte, nós silenciados seletivamente, -3 ou -7 usando siRNA para examinar o envolvimento individual destes HDAC na redução do crescimento induzido SAHA. HDAC7 silenciamento não afectou o crescimento celular (Figura 1B). No entanto, HDAC1 e HDAC3 silenciamentos reduziu significativamente o crescimento de células BxPC-3, respectivamente, por 50% (P 0,001) e 20% (P 0,001) (Figura 1C). A fim de avaliar esta diminuição no crescimento celular com drogas clinicamente compatível, avaliou-se o crescimento dependente do tempo e dependente da concentração de células BxPC-3, na presença de MS-275 (inibidor de HDAC1 e HDAC3). MS-275 (1 uM) reduziu o crescimento celular BxPC-3 em 50% (P 0,001), enquanto que 5 jiM aboliu completamente o crescimento (P 0,001). (Figura 1D)
(A) Tempo efeitos dependentes e dependentes da dose de SAHA na proliferação celular. (B) efeito dependente do tempo da classe IIa HDAC7 silenciando sobre a proliferação celular. expressão HDAC7 foi detectada por 48h western-blot após siRNA transfecção. Hsc70 foi utilizado como um controlo de carga. (C) efeito dependente do tempo de classe I HDAC1 ou -3 silenciando sobre a proliferação celular .. expressão HDAC1 e HDAC3 foi detectada por 48h western-blot após siRNA transfecção. Hsc70 foi utilizado como um controlo de carga. (D) dependente do tempo e os efeitos dependentes da dose de MS-275 sobre a proliferação de células *** P .001 contra condições DMSO ou GL3. Os resultados são expressos como média ± DP, n≥3 em cada condição.
Expressão induzida
inibição de HDAC de classe I de COX-2 in vitro
A eficiência limitada de inibidores de HDAC em ensaios clínicos incluindo pacientes PDAC poderia ser explicada, pelo menos em parte, pelo potencial até regulação da expressão de COX-2 em células malignas do pâncreas. Para avaliar esta hipótese, analisamos primeira expressão de COX-2 em BxPC-3 células silenciadas para HDAC1, HDAC2, HDAC3 ou tratados com MS-275. HDAC1 ou HDAC3 repressão induzido, respectivamente, uma 6,3-vezes e um aumento de 4,8 vezes da expressão de COX-2 ao nível da proteína (Figura 2A), enquanto HDAC2 silenciamento reduzida expressão de COX-2 (Figura 2B). HDAC1 silenciamento induziu uma superexpressão HDAC2.
(A) de detecção Ocidental-blot de COX-2 e HDAC em 20 ug BxPC-3 proteínas 48h após HDAC1 ou HDAC3 siRNA transfecção. (B) a detecção Ocidental-blot de COX-2 e HDAC em 20 ug BxPC-3 proteínas 48h após HDAC2 siRNA transfecção. efeitos (C) dependentes da dose de 48h tratamento MS-275 sobre COX-2 expressão. -Histona H3 acetilada foi utilizado como um controlo da eficácia do tratamento. Hsc70 foi utilizado como um controlo de carga. (D) Expressão relativa dependente do tempo do ARNm de COX-2 em BxPC-3 células tratadas com 1 uM de MS-275. Os resultados são expressos como média ± D.P., n = 3.
O tratamento de células BxPC-3 com MS-275 apresentaram efeitos semelhantes sobre a acumulação de COX-2 de uma maneira de concentração dependem-(Figura 2C). Para determinar se a indução de COX-2 ocorre a nível da transcrição, analisamos a COX-2 nível de ARNm por RT-qPCR seguinte 6, 12, e 24 horas de tratamento de EM-275. Verificou-se que a COX-2 de expressão do gene foi regulada para cima a seguir ao tratamento de MS-275 de uma forma dependente do tempo (Figura 2D).
Para estudar os mecanismos pelos quais a inibição da classe I de HDAC induzem a COX-2, exploramos a conhecer a ligação entre o NF-kB e HDAC1 /3 [42], [43] e testada a possibilidade de que induzida por MS-275 a expressão de COX-2 poderia ser dependente de NF-kB. Dessa forma, as células com MS-275 e BAY-11-7082, um inibidor IkBα quinase (IKK) co-tratada. BAY-11-7082 reduzida em 30% a 90% da expressão da COX-2 a seguir, respectivamente, 6h e 48h de tratamento de EM-275 (Figura 3A), sugerindo que a expressão induzida por MS-275 da COX-2 é, pelo menos em parte, , NF-kB dependente. Esta hipótese foi suportada por p65-p65 silenciamento e a translocação para o núcleo. COX-2 foi induzida por um tratamento de 24 horas com o MS-275 e foi prevenida pela p65 siRNA (Figura 3B). Além disso, 24H tratamento de EM-275 induziu um aumento de 50% do nível de proteína p65 no citoplasma e na fracção de cromatina BxPC-3 de células (Figura 3C). O mesmo tratamento MS-275 induziu a expressão do gene de IL-8 (Figura 3D), o alvo directo de NF-kB.
(A) Efeito de um inibidor IKK (10 mM BAY-11-7082) em 1 uM MS-275 induzida por expressão da COX-2. A fosfo-IkBα foi utilizado como um controlo de BAY-11-7082 a eficácia do tratamento. Hsc70 foi utilizado como um controlo de carga. A densitometria foi expressa como uma proporção de COX-2 /Hsc70 ou IkBα /hsc70. (B) Detecção de Westernblot de COX-2 em 20 ug BxPC-3 proteínas após 1 uM de MS-275 de tratamento e p65 transfecção siRNA. Hsc70 foi utilizado como um controlo de carga. (C) a detecção Ocidental-blot de p65 em 15 ug BxPC-3 citoplasma, nucleoplasma ou proteínas associadas à cromatina após o tratamento 1 PM MS-275. E MEK2 ORC2 foram utilizados como um controlo de carga, respectivamente, no citoplasma e fracções de cromatina. Densitometria foi expressa como uma p65 /MEK2 ou p65 /rácio ORC2. (D) Expressão relativa dependente do tempo do ARNm de IL-8 em BxPC-3 células tratadas com 1 uM de MS-275, 10 uM de celecoxib ou uma combinação de drogas. Os resultados são expressos como a média ± S.D. *** P 0,001, * P 0,05 contra DMSO. n≥3 em cada condição.
inibição combinada de classe I HDAC e COX-2 inibe o crescimento de células in vitro
A fim de validar nossa hipótese de que classe I HDAC inibição mediada por indução de COX-2 podem contribuir para a baixa eficiência da terapia baseada HDAC em doentes PDAC, que se combinaram estes últimos com celecoxib, um inibidor selectivo de COX-2 na IC50 (uM respectivamente 1 de MS-275 e 10 uM de celecoxib). A induzida por MS-275 sobre-expressão de COX-2 conduziu a um aumento de 50% da concentração de PGE2 nos meios da cultura (Figura 4A). tratamento de células com BxPC-3 por si só ou em combinação com EM-275 celecoxib reduziu significativamente o
concentração de PGE2 no meio celular. Em seguida, analisamos o impacto destes tratamentos sobre o crescimento celular. A combinação dos dois fármacos reduziu significativamente ( 85%, P 0,001) o crescimento de células BxPC-3 em comparação com a utilização de qualquer um dos fármacos sozinhos (Figura 4B). A seguir, a pergunta se esta redução é devido à indução de apoptose e executou um iodeto de coloração de anexina V /propídio em 24, 48 e 72 horas (Figura 4C) seguindo o tratamento. Nenhum dos fármacos individuais, nem a sua combinação foram capazes de induzir a apoptose. Estes resultados foram confirmados por Western-blot, que mostra caspase-3 intacto em todas as amostras (Figura 4C). Para investigar adicionalmente os mecanismos da paragem do crescimento celular observado, que em seguida examinado o efeito do EM-275 /combinação de celecoxib no ciclo celular (Figura 4D). MS-275 sozinho, mas não o celecoxib, aumentou a proporção de células em G1 em 50% em 48 h. No entanto, o MS-275 /combinação celecoxib reduziu significativamente (P 0,001) a proporção de células em fase S a 24 (-74%), 48 (-92%) e 72 h (-82%) e aumentou significativamente (P 0,001) a proporção em fase G1 a 24 (+ 48%), 48 (+ 119%) e 72 h (+ 80%). Para validar estes resultados foram analisados por Western blot da expressão de marcadores do ciclo celular e encontrada uma clara acumulação de p21
e WAF1 p27
KIP1, dois inibidores do ciclo celular, às 24 h e 48 h após a co-administração de MS- 275 e celecoxib (Figura 4E). Consistentemente, a forma hiperfosforilada de pRb foi menos abundante quando as células BxPC-3 foram co-tratados com MS-275 /celecoxib. A forma de pRb hipofosforilado apareceu com o co-inibição de HDAC de classe I e de COX-2. A proteína pRb inteira desapareceu às 48h após o co-tratamento. Este desaparecimento já foi observado por outros depois de um p21
WAF1 ou p27
acumulação KIP1 [44]. O factor de transcrição E2F1, um orquestrador da fase S, tornou-se indetectável 48 horas após a co-administração de MS-275 e celecoxib. Estes resultados mostram que a inibição do crescimento celular está associada a um bloqueio de fase G0 /G1.
de ensaio (A) ELISA de PGE
2 em cultura de células 24h e 48h após a meios 1 uM de MS-275 e 10 uM o tratamento com celecoxib. (B) Os efeitos dependentes do tempo de MS-275 e celecoxib no crescimento celular. (C) efeitos dependentes do tempo de 1 uM de MS-275 e 10 uM de celecoxib em relação celular por apoptose por anexina V /PI citometria de fluxo e em caspase-3 clivada. (D) os efeitos dependentes do tempo de 1 uM de MS-275 e 10 uM de celecoxib no ciclo celular por incorporação de PI. (E) a detecção Ocidental-blot de p21, p27, pRb ppRb e E2F1 em 20 ug BxPC-3 proteínas de 6 a 48h após 1? M MS-275 e 10 mM tratamento com celecoxib. Hsc70 foi utilizado como um controlo de carga. Os resultados são expressos como média ± D.P., *** P 0,001, ** p 0,01, * P 0,05 contra DMSO ou condições indicadas. n≥3 em cada condição.
BxPC-3 é uma linha celular caracterizada pela sua PDAC KRAS tipo selvagem, enquanto que as mutações do gene que codifica para esta proteína é a alteração genética mais comum observado em PDAC humano. No entanto, as células BxPC-3 sobre-expressam a COX-2, uma situação observada em 50% dos PDAC humano. Nós decidimos estender nossas observações sobre o interesse do tratamento combinado no câncer de pâncreas ao analisar a eficácia de tal tratamento combinado em duas linhas de células de pâncreas humanos com mutações no KRAS relatados. A primeira linha de células foi PANC-1 ([12 ASP] -KRAS) em que a COX-2 foi sem ser detectado ao nível da proteína [45]. A segunda linha celular foi CFPAC-1 ([12 VAL] -KRAS), mas em que a COX-2 foi detectada ao nível da proteína [45].
PANC-1 A linha celular foi cultivada com MS-275, celecoxib ou ambas as drogas em combinação. Celecoxib 10 uM, não alterou o crescimento celular quando o MS-275 1 ^ M reduziu significativamente (p , 001) o crescimento celular em 32%. A combinação dos dois fármacos reduziu o crescimento celular PANC-1 (49%, P 0,001). No entanto, a inibição do crescimento induzida por combinação não foi significativamente diferente do induzida por MS-275 (Figura 5A). Nesta linha celular, o MS-275 não induziu a expressão de COX-2 (dados não mostrados).
(A) os efeitos dependentes do tempo de MS-275 e celecoxib sobre o crescimento celular PANC-1. (B) Os efeitos dependentes do tempo de MS-275 e celecoxib sobre o crescimento celular CFPAC-1. (C) Detecção Westernblot de Cox-2, p21, p27 em 30 ug de proteínas CFPAC-1 48h após a 1 ^ M de MS-275 e 10 uM tratamento com celecoxib. Hsc70 foi utilizado como um controlo de carga. Os resultados são expressos como média ± D.P., *** P 0,001 contra DMSO ou condições indicadas. n≥3 em cada condição.
A linha de células CFPAC-1 foi cultivada nas mesmas condições. Celecoxib 10 uM reduziu o crescimento celular em 54% (p , 001) e EM-275 1 ^ M reduziu o crescimento celular em 59% (p , 001). Aqui, a combinação dos dois fármacos reduziu significativamente (79%, P 0,001) o crescimento de células CFPAC-1, em comparação com qualquer um dos fármacos sozinhos (Figura 5B). Em seguida, analisado por Western blot da expressão da COX-2 e marcadores do ciclo celular em células CFPAC-1 48h após a administração dos fármacos. Nós mostramos uma acumulação induzida MS-275 de COX-2 como em BxPC-3 células (Figura 5C). Encontramos também um acúmulo de p21
WAF1 e p27
KIP1 após a co-administração de MS-275 e celecoxib (Figura 5C), sugerindo uma interrupção do ciclo celular.
BxPC-3 tumor CAM imita humana PDAC
a avaliação de novas drogas ou combinações de drogas para o câncer de pâncreas será facilitado pela disponibilidade de fácil, de forma ética e economicamente modelos animais sustentáveis. Assim, comprometeram-se a refinar um modelo de pâncreas humano membrana corioalant�ca (CAM) baseado no nosso trabalho inicial [32]. Incorporação células BxPC-3 em matrigel antes da implantação CAM gerado uma melhoria significativa no volume do tumor. Com efeito, a seguir à implantação, o volume de tumor aumentou linearmente (R
2 = 0,87) até ao dia 7 (Figura 6A). No momento da recolha do tumor (dia 7), um volume médio de tumor de 59,95 ± 15,34 milímetros
3 (n = 10) foi observada. tumores BxPC-3 CAM cresceu no interior do tecido conjuntivo CAM como um nódulo spheric única. O mesmo procedimento foi seguido para BxPC-3, PANC-1 e linhas de células CFPAC-1. PANC-1 não cresceu no CAM quando CFPAC-1 cresceu como muito pequenos nódulos (1 mm de comprimento).
(A) células foram implantadas no CAM no dia embrionário 11 e coletadas 2, 4, 5, 6 ou 7 dias após a implantação. imagens macroscópicas foram obtidos com a mesma ampliação da parte superior, inferior e lateral. Os resultados são expressos como média ± D.P., n 5, em cada ponto de tempo. (B) histológico (Hematoxilina-Eosina ou coloração Masson) Análise de tumores recolhidos 2, 4, 5, 6 ou 7 dias após a implantação. (C) imuno-histologia de tumores 7 dias após a implantação BxPC-3 no CAM e os tumores humanos PDAC. CK7 = Cytokeratin-7, CK19 = citoqueratina-19, CEA = Antígeno carcinoembrionário, PAS = amilase periódico Schiff ácido coloração.
BxPC-3 histologia do tumor CAM (Figura 6B) revelou grandes ilhotas de coesa células, algumas das quais mostraram uma nascentes lúmen central e foram isoladas umas das outras por uma matriz extracelular contendo colagénio com várias células semelhantes a fibroblastos dispersas demonstrando a presença de um estroma intersticial.
Para validar ainda mais a nossa pâncreas humano modelo CAM câncer, comparou-se a expressão da citoqueratina-7, -19, -20, CD56, CEA e Ki67 utilizando imuno-histoquímica para PDAC humano. Verificou-se ainda mucina e produção de proteoglicanos utilizando a coloração PAS. células tumorais a partir de ambos BxPC-3 de tumor e amostras PDAC CAM foram fortemente positivas para a citoqueratina-7 e -19, CEA e Ki67 (Figura 6C), mas negativa para citoqueratina-20 e CD56 (dados não mostrados). Ambos os tumores foram positivas para a coloração de PAS. Ao todo, os dados mostraram notáveis semelhanças histologia e expressão de biomarcadores entre o modelo CAM BxPC-3 e PDAC de pacientes humanos.
Além disso, nosso trabalho recente sobre biomarcadores segmentáveis no PDAC humana [46] identificados vários candidatos biomarcadores entre as quais myoferlin, factor de crescimento transformante e latente factor de crescimento transformante-beta-proteína de ligação 2. a imuno-histoquímica e western-blot induzida por beta confirmou a presença destes novos biomarcadores PDAC nas BxPC-3 tumores came (Figura 7A-B). Finalmente, utilizando Western blot confirmou-se que HDAC1, HDAC2, HDAC3 e COX-2 são expressos na BxPC-3 de tumor de CAM (figura 7A).
(A) de detecção de mancha Ocidental-HDAC1, HDAC2, HDAC3 , HDAC7, a COX-2, TGFBI, MYOF, LTBP2 em 20 ug PDAC-CAM ou proteínas BxPC-3. Hsc70 foi utilizado como um controlo de carga. (B) rotulagem Immunoperoxydase de MYOF, TGFBI, LTBP2, COX-2.
A seguir demonstrado que os tumores eram funcionalmente vascularizado. BxPC-3 vasos sanguíneos CAM foram coradas pelo SNA conjugado com FITC e 3D reconstruída após a aquisição confocal. BxPC-3 tumores CAM exibido vasos sanguíneos ao redor ilhotas pancreáticas (Figura 8a). A fluorescência do estroma do tumor após a injecção do corante fluorescente na vasculatura CAM confirma que os navios são funcional (figura 8B) e a detecção de pericitos positivos desmina sugere estabilização vaso (Figura 8C).
(A) reconstrução 3D Imaris a partir de um 35 mm imagem guardada após coloração SNA (verde). Os núcleos foram contra-coradas com DAPI (azul). (B) imagem confocal após FITC (verde) injecção nos vasos sanguíneos CAM. Os núcleos foram contra-coradas com TOPRO (azul) (C) Desmin imunodetecção (vermelho) no PDAC-CAM coradas com SNA (verde). Os núcleos foram contra-coradas com DAPI (azul).
Em seguida, BxPC-3 tumores foram tratados com início dia 2, quer com 8 mM celecoxib ou 0,2 mM MS-275 ou com uma combinação de duas drogas em seu respectivas concentrações. concentração de MS-275 foi escolhido para se encaixar com a concentração plasmática medida em humano em um 5 mg /m
2 esquema de dosagem semanal [15]. Enquanto o celecoxib sozinho não afectou o crescimento do tumor, o MS-275 sozinho induziu uma diminuição do crescimento do tumor em 50% (P 0,001) e induzida a expressão da COX-2. Combinação de celecoxib e MS-275 completamente abolida (P 0,001) o crescimento do tumor, levando a nenhuma mudança no volume do tumor em comparação com o início do tratamento (Figura 9A-B). Os tumores tratados com EM-275 sobre-expresso de COX-2 (Figura 9C). Os tumores tratados com a combinação de celecoxib e EM-275 revelou espaços vazios dentro do tumor. (Figura 9D). Pedimos então a questão de saber se esta redução do volume do tumor é devido à indução de apoptose ou para prisão proliferação. Os tumores tratados com EM-275, celecoxib, ou ambas as drogas foram submetidos a uma detecção de caspase-3 clivada e foram marcadas durante Ki67. A de comprimento completo de caspase-3 foi detectada em todas as amostras, mas não se observou qualquer caspase-3 clivada (Figura 9E).