Abstract

inativação epigenética da cromatina desempenha um papel importante na determinação do fenótipo celular tanto em células normais e cancerosas, mas a nossa conhecimento ainda é incompleto com relação a qualquer potencial natureza monoalélicos do fenômeno. Temos genotipagem de DNA isolado a partir de cromatina de duas linhas derivadas de cancro colo-rectal e de uma cultura de células epiteliais intestinais normais humanos (HIEC), que foi imunoprecipitada com anticorpos contra a acetilado H3K9 histona metilado, e apresentou os dados como as diferenças de frequência B alelo mais polimorfismo múltipla de nucleotídeo único (SNP) médias móveis de janela. [B alelo é um termo arbitrária definida como um dos dois alelos de um dado SNP, denominados A e B]. Três testes de validação diferentes confirmou que as diferenças picos expositoras representada domínios monoalélicos. Estes exames complementares confirmaram os seguintes: 1) genes nas regiões de alta B diferença de frequência de alelos foram expressos monoallelically; 2) em células normais todas as regiões de controlo de impressão que cinco SNPs realizadas heterozigóticos foram caracterizados por picos de diferença B alélicas; e 3) os haplótipos nos picos de diferença B alelos foram fielmente mantida na cromatina imunoprecipitada com os anticorpos respectivos. Em ambas as amostras a maior parte dos domínios monoalélicos foram encontrados nas fronteiras entre as regiões de cromatina aberta e fechada. No que diz respeito à linha de cancro, este apoia o conceito estabelecido de conformação espalhamento, mas os resultados a partir de células normais foram inesperados. Uma vez que estas células foram policlonal, as estruturas monoalélicos provavelmente não foram determinadas por escolha aleatória, como ocorre em X-inactivação, por isso propomos que a inativação epigenética em alguns domínios podem ser hereditárias e polimórfica em células humanas normais

Citation.: di Paola D, Raelson J, Rampakakis e, Basik M, Zannis-Hadjopoulos M, Bradley WEC (2013) monoalélicos cromatina Conformação Flanquear longa Distância Silenced Domínios em células cancerosas derivados e normal. PLoS ONE 8 (5): e63190. doi: 10.1371 /journal.pone.0063190

editor: Brian P. Chadwick, Universidade Estadual da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de fevereiro de 2013; Aceito: 27 de março de 2013; Publicado em: 16 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Di Paola et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada por doações da Sociedade de Pesquisa do Câncer e fundos internos do Centro de Câncer Goodman, da Universidade McGill. DDP foi beneficiário de uma bolsa de estudos do Fonds de Recherche en Santé du Québec. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. John Raelson foi anteriormente empregadas pelas Genizon Biosciences Inc. que não tinha influência sobre o conteúdo editorial do manuscrito. Nenhum dos outros autores declaram qualquer conflito. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

controle epigenética da expressão do gene é uma importante fonte de variação fenotípica no câncer. Ao nível cromossómico, este controlo é manifestada por uma alteração de conformação da cromatina associada com modificações de histonas, tais como a metilação e /ou a acetilação de resíduos de lisina em caudas N-terminais das histonas, e com metilação de resíduos de C em ilhas CpG rico em ou promotores de genes próximos. Essas alterações têm sido amplamente utilizados como marcadores para determinar o estado epigenético de um determinado gene, e os recentes avanços na tecnologia de genoma permitiu avaliação da inativação epigenética em intervalos Megabase; Pensa-se agora que estas mudanças podem espalhados por longos trechos [1]. O nosso conhecimento nesta área é, no entanto, incompleta por várias razões: em primeiro lugar, CpG ilha metilação só rende detalhes de genes individuais que estão associadas com ilhas CpG, e isso só nos casos em que a inativação do gene corresponde genuinamente com o estado de metilação. Em segundo lugar, embora estes estudos recentes têm demonstrado que de fato grande escala mudanças epigenéticas podem ocorrer, foram realizadas algumas análises do genoma exaustivos comparando células normais e derivados câncer.

Outro aspecto deste fenómeno que tem permanecido relativamente inexplorado é o grau em que a inactivação epigenética pode ser restrita a um alelo. Dentro das células normais, a inactivação do gene específica para o alelo é conhecido por ocorrer em um número de loci, incluindo genes dentro de domínios impressos (onde a escolha de qual alelo é inactivada é dependente da mãe de origem), a maioria dos genes sobre um cromossoma X na células do sexo feminino, receptores olfactivos, e a um número de genes envolvidos na inflamação e na resposta imune (revisto por [2]). Os mecanismos de controlo para alguns destes eventos de inactivação parece ser alterada em células de cancro, de tal modo que, por exemplo, são frequentemente impressos loci biallelically expressos em cancro (revisto em [3]). No entanto, na medida em que de novo monoalélicos inactivação ocorre em células cancerosas é desconhecido. Os trabalhos iniciais por nós [4], [5] e por outros [6] indicam que na linha celular de mamífero modelo CHO, inactivação monoalélicos podem espalhar-se ao longo de um intervalo de megabases tal que a selecção contra a expressão de um único alelo de um locus resultou em supressão de um alelo numa segunda, vinculadas lócus. Tal espalhar foi demonstrado que ocorrem com elevada frequência e não envolve a metilação da ilha CpG associados-promotor para pelo menos um dos genes envolvidos [7]. Mais recentemente, têm mostrado que, em cerca de metade das linhas celulares derivadas de tumor, em que RARB, um gene com efeito tumor-supressor, foi completamente inactivada, o promotor de apenas um dos dois alelos foi metilado [8], novamente sugerindo um mecanismo de inativação independente de metilação, que pode ser monoalélicos na natureza.

neste estudo, utilizou-se anti-soros contra histona H3 acetilada pelo K9 /14 (H3Ac) e histona H3 em K9 metilado-tri (H3M) em experiências de chip em duas linhas colorrectais derivado de cancro (HCT116 e Colo205) e uma cultura de células epiteliais intestinais humanas (HIEC), que são não-imortalizada e policlonal. Estas marcas de histonas estão associadas a conformação da cromatina aberta e fechada, respectivamente, e foram seleccionados de entre os vários conhecida por estar associada com a conformação em parte, porque as modificações são mutuamente exclusivos e pode haver uma possibilidade maior do que os dados seriam inequívoca. Isso também simplificou a determinação de viés alélicas na conformação em cada SNP utilizados para genotipar o DNA extraído da cromatina imunoprecipitadas, uma vez que poderia calcular a diferença de frequências alélicas B determinados em cada SNP dos microarrays HAP550k. Não inesperadamente, foram encontrados “desertos de genes ‘long a ser caracterizada por trechos de cromatina geralmente fechado em ambas as células normais e cancerosas. De interesse, descobrimos que a conformação monoalélicos foi preferencialmente localizada nos limites desses longos trechos de conformação da cromatina fechado, sugerindo disseminação da conformação inativa (ou ativo).

Resultados e Discussão

Para gerar imagens de longo alcance da conformação da cromatina, os valores de intensidade de fluorescência, expressos como razões lOGR, foram calculados sobre janelas que compreendem 21 ou mais SNPs em movimento, e plotados contra a posição cromossômica. Como esperado, com base em dados fornecidos no navegador epigenoma da UCSC, regiões genômicas de genes dos pobres foram caracterizados por trechos de baixa LogR para cromatina anti-H3Ac-precipitou e correspondentemente elevado LogR para anti-H3M. Isso está ilustrado na figura. 1, mostrando um domínio de 15 Mb de CHR5 abrigar menos de 10 genes, dos quais cinco são membros da família caderina. Nas células normais (e menos frequentemente, nas linhas celulares de cancro) dessas regiões eram tipicamente interrompida por pequenas ilhas de conformação aberta marcadas por picos da trama anti-H3Ac, espelhado por calhas da trama anti-H3M. Às vezes, mas não sempre, estes correspondiam aos promotores dos genes raros no domínio (Fig. 1,

CDH18

e

CDH9 Comprar e o fragmento do gene descaracterizado em 21,5 Mb, a jusante da

CDH12

). Os picos nestes domínios muitas vezes eram achatados nas linhas derivadas de câncer, eo enredo apresentado na Fig. 1 sugere que a transferência da fronteira do lado direito pode ter ocorrido tal que

CDH6

é na cromatina fechado em células HCT116. É possível que esta aparente deslocamento é, pelo menos, por vezes parte do processo de progressão do tumor (ver a seguir).

valores representados representam as leituras médias de uma janela móvel 21-SNP. HCT116, uma linha de células derivadas de cancro colo-rectal; HIEC, células epiteliais intestinais humanas normais. Os genes de (UCSC Genome Browser hg18) estão representadas abaixo as parcelas LOGR.

Os padrões de rácios LOGR para o conjunto de CHR9 são mostrados na Fig. 2, com UCSC Genome Browser de exibição “denso” de genes na parte inferior de cada segmento de gráfico. Mais uma vez, os domínios de genes pobre (por exemplo, aqueles centrada em torno de 10 Mb, 82 Mb, 105 Mb) são caracterizadas por baixos valores de LOGR de anti-H3Ac interrompidos por picos localizadas que são ocasionalmente achatadas nas linhas de cancro (dados H3M não estão incluídos na parte principal da figura por simplicidade). Na inserção da Fig. 2 é exibido um pico no CHR9 para todas as três amostras de aparas de anti-acetilado com uma calha concomitante para todos os três dos chips anti-metilados, consistente com a expectativa de imagens especulares nas parcelas LOGR das duas amostras imunoprecipitadas. Existe apenas um gene na região, C9orf123, cuja extremidade 5 ‘é muito perto do respectivo pico e vale.

Os dados foram tratadas como descrito na legenda da Fig. 1. inserir, na região entre 7,7 e 7,9 Mb Mb, que mostra os picos de chip, utilizando anti-soro anti-acetilado contra as calhas de ChIP utilizando anticorpos anti-soro metilado, coincidindo com a região promotora de C9orf123. LogR lotes de anti-metilado ChIP são omitidos a figura principal para maior clareza.

Em seguida, determinaram os padrões de viés alélicas em conformação da cromatina para as duas amostras de células quase diplóides (HCT116 e HIEC), expressa como frequência B alelo (BAF) diferença entre as duas amostras de chip em média, mais de 11 por marcadores janelas em movimento (ver Métodos). Encontramos mais de 60 picos acima de nossa conservador de corte de 0,35 (ver texto em S1 Arquivo) que se estendeu por até 10 Mb em um trecho na linha de derivados de câncer HCT116. Cerca de 35 destes picos foi observado nas células HIEC, a mais ampla cobrindo uma gama de cerca de 400 kb (largura do pico a meia-altura um; ver Figura 3 para sínteses de vários cromossomas.)

Como descrito. no texto, para cada heterozigotos valores absolutos SNP de diferenças BAF entre as duas amostras de chip foram calculados e 11 por marcadores médias móveis de janela em cada cromossomo foram plotados. Azul, HCT116; coral, HIEC. Genes (UCSC Genome Browser) são descritos abaixo das parcelas LOGR.

Para validar esses dados, realizados ambos os testes estruturais e funcionais (detalhes em Métodos). Em primeiro lugar, ao longo do comprimento de um pico diferença BAF uma conformação relativamente fechada deve estender-se ininterruptamente sobre um homólogo e uma conformação aberta do outro. Este mostrou ser o caso corre ao longo de SNPs em desequilíbrio de ligação elevada (LD), como encontramos perfeita concordância entre a fase haplótipo e a sequência de alelos enriquecidas nas respectivas amostras de aparas (binomial p = 1,4 x 10

-45 para HCT116, 5,8 × 10

-11 para HIEC; dados nas figuras S1 e S2 em S1 Arquivo).. Em segundo lugar, verificou-se que sete dos sete genes que residem em picos de BAF diferença foram monoallelically expressa (Fig. S3 no arquivo S1). Em terceiro lugar, mostrou que cinco picos de BAF diferença em HIEC, incluindo o pico principal a 22,9 Mb do cromossoma 15 (Fig. 3), correspondia precisamente com regiões de controlo de impressão (ICRs), as sequências de ADN monoallelically metilado curtas que imprinting directa (outra dados não mostrados). (Outros ICR interrogado eram homozigotos em HIEC). No geral, os três testes que realizamos fazer um caso convincente que as diferenças BAF refletir as autênticas diferenças alélicas na estrutura conformacional da cromatina.

Quando os rácios LOGR e diferenças BAF de células HCT116 foram plotados juntos foram observados dois padrões gerais (ver Fig. 4, que mostra oito dos picos no cromossoma 18, numerados de I a VIII). Como seria de esperar, alguns picos de diferença BAF correspondeu de perto com picos e /ou calhas das respectivas amostras de chip isoladas. Aqueles em 35 Mb e 57 Mb (picos III e VIII) se enquadram nesta categoria, juntamente com cerca de um quarto do resto desses picos ao longo do genoma. Como muitos como dois terços dos picos, no entanto, ocorreu nos limites entre os valores alto e baixo LOGR, isto é, entre os domínios de conformação da cromatina aberta e fechada. Picos I, II, V – VII e talvez IV estão nesta categoria (Fig 4, o último é menos certo por causa da homozigose uninformative abrangendo o pico.). Na maioria dos casos, as parcelas de diferença LOGR e BAF eram virtualmente sobreponíveis através da região de interesse imediato, indicando que a divergência entre os alelos começou no mesmo ponto que o início da passagem de uma conformação para o outro. Curiosamente, os limites que coincidem com os picos de diferença BAF foram geralmente aqueles para os quais um deslocamento relativo foi visto em proporções LOGR, como é visto por picos I, VI e VII (a última é menor, mas real, com um deslocamento de 100 kb). O limite no pico II, também pode ser considerado como deslocada, por uma distância mais de cerca de 2 Mb.

o painel superior, as diferenças BAF em toda a totalidade do cromossoma 18 para HCT116. painéis inferiores, lote de HCT BAF diferença (Red; escala da direita) sobreposto a parcelas de HCT e HIEC, os rácios LOGR (escala da esquerda) sobre o cromossomo 18 domínios indicados no painel superior

. interpretamos este como indicando que os domínios aberto ou fechado se espalharam para estes limites e que a propagação era ou monoalélicos ou ocorreu a diferentes níveis nos dois homólogos, gerando assim um domínio de conformação da cromatina monoalélicos. explicações alternativas são possíveis, mas nós favorecemos o cenário se espalhando em parte porque parece simples para prever um mecanismo desse tipo, para os quais existe algum precedente em células de mamíferos na forma de X-inactivação espalhando em cromatina autossômica nos pontos de fusão de X-autosome translocação [9].

também realizamos as mesmas análises com dados de células HIEC. O cromossoma X não produziu diferenças BAF acima do ruído de fundo (dados não mostrados), embora H3K9 acetilação /metilação está envolvida na inactivação de X-[10]. Isto é como seria de esperar para a inactivação aleatória, considerando-se que as células HIEC são policlonais, e o resultado confirma que os eventos de inactivação aleatórios não deve confundir os resultados. Entre os autossomos, julgamos 13/32 BAF picos diferença como correspondente à isoladas relação LogR picos /vales de amostras H3Ac /H3M Chip. No entanto, o resto, compreendendo uma maioria dos picos diferença BAF coincidiu com limites entre aberta e fechada conformação da cromatina (exemplos mostrados para o cromossoma 22, na Fig. 5 com pico II sendo na primeira categoria e os outros mostrando efeitos de deslocamento limite monoalélicos). Este foi um resultado inesperado, que, contudo, considerar a ser real, dado o rigor do nosso processo de validação. A nossa interpretação deste efeito é como descrito acima, a saber, que a conformação fechada limites de abrir /cromatina, algum grau de monoalélicos propagação de conformação pode ocorrer.

o painel superior, as diferenças BAF em toda a totalidade do cromossoma 22 para HIEC . painéis inferiores, enredo diferença HIEC BAF (vermelho; escala da direita), sobreposto, HCT e HIEC, LOGR rácios parcelas (escala da esquerda) sobre o cromossomo 22 domínios indicados no painel superior

Para quê. podemos atribuir essa propagação aparente? A natureza policlonal das HIEC nos permite descartar algumas possibilidades. Em primeiro lugar, é improvável que seja devido ao mesmo mecanismo que a expressão monoalélicos generalizado descrito por Gimelbrant et ai. [11], uma vez que esta mostrou-se aleatória. Podemos semelhante exclui a possibilidade de que os picos reflectem um estado pré-canceroso, tal como é vista com a metilação de genes supressores tumorais em tecido normal de pacientes com cancro, uma vez que este também seria aleatória no que diz respeito à escolha do alelo. Em qualquer caso, as células são HIEC fetal na origem e não imortalizadas [12], e que, portanto, não se espera que tenham quaisquer características pré-cancerosas. Uma outra interpretação, que, no entanto, não é fortemente suportada pelos dados, é que estes picos de BAF diferença são previamente domínios Imprinted desconhecidos. Evidências recentes de pesquisas do genoma sugere que a maioria dos domínios imprimidos genuínos são agora conhecidos, assim, dado o seu número (cerca de 20) e sua presença nos limites de cromatina abertas fechado (ao contrário dos picos associados a imprinting que se detectam) isso parece improvável, embora esta questão não pode ser de forma inequívoca dirigida usando nosso projeto experimental. Uma interpretação que consideramos ser consistente com os dados é que as diferenças alélicas detectados reflectir as alterações epigenética constitucionais, isto é, que os picos monoalélicos estaria presente em todos os tecidos do indivíduo em questão. Tais fenómenos têm sido descritas para um número limitado de genes supressores de tumores, incluindo

MGMT

[13], em que estes genes foram encontrados para ser silenciado em células somáticas normais, e são pensados ​​para resultar em um Câncer predispondo fenótipo. Há sugestões na literatura que essas “epimutações constitucionais ‘pode ser de origem genética [14], [15]. Outros grupos têm realizado estudos de associação do genoma de expressão alélica [16] e têm encontrado muitas SNPs a ser associado com níveis de expressão. Em todos estes casos, o efeito monoalélicos é restrito a um componente genético, tal como um SNP ou o promotor de um único gene. Não houve associação particular nestes estudos de expressão monoalélicos com conformação da cromatina ou com a proximidade de desertos de genes, por isso ainda não se sabe se os padrões de expressão monoalélicos esses autores descrevem podem se sobrepor aos que descrevemos.

O nosso estudo inova em dois aspectos. Primeiro, localiza uma fonte significativa da estrutura da cromatina monoalélicos a regiões imediatamente adjacentes a domínios de conformação da cromatina fechado. Como tal, sugere um mecanismo para este polimorfismo epigenética, que pode assemelhar-se a uma versão controlada do espalhamento que nós e outros propõem a ser uma fonte significativa de variação fenotípica em cancro. Segundo, se a nossa interpretação é precisa, ele levanta a perspectiva de um componente genético para esta fonte de variação epigenética. Sabe-se que a impressão na

IGF2R

local em chr6q é polimórfico e, talvez, podem existir alguns elementos de controlo epigenética hereditárias de conformação da cromatina, o que se manifestam como os domínios de conformação monoalélicos que têm documentado. Um fenômeno inexplicável, o que pode estar relacionado é a herança transgeracional [17], em que fatores genéticos influenciam fenótipo em gerações sucessivas, sem os genes que determinam diretamente que fenótipo a ser herdada. Em qualquer caso, os novos aspectos de nossos resultados podem levar a uma compreensão mais profunda da hereditariedade, e estamos actualmente a investigar esses efeitos ainda mais.

Métodos

Células

HIEC- 6 são células epiteliais policlonais imortalizadas não-intestinais em cultura a partir de uma mulher de 20 semanas embrião. Eles foram gentilmente cedida na passagem 17 por Jean-François Beaulieu, e foram cultivadas de acordo com métodos publicados [12]. Os experimentos foram realizados no prazo de 6 passagens de recepção em nosso laboratório. HCT116 e Colo205 são linhas celulares derivadas de cancro colorectal originalmente obtidas a partir da ATCC, e cultivadas em meio RPMI como descrito anteriormente.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

O procedimento seguido foi o descrito por [18] . As células cultivadas em meios completos foram lavadas com PBS pré-aquecido e tratou-se com 1% de formaldeído, durante 10 min a proteínas de ligação cruzada e ADN

In vivo

; elas foram em seguida lavadas e raspadas para PBS gelado e ressuspensas em tampão de lise (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 140 mM, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM) suplementado com um comprimido completo de inibidor de protease (Roche Molecular Biochemicals). Após a passagem através de uma agulha de 21 G três vezes, os núcleos foram recolhidas, ressuspensas em um volume embalado nuclear de tampão de lise, e sonicado até que os fragmentos de ADN de 1 kb foram obtidas. tamanho da cromatina foi monitorizado por electroforese. A imunoprecipitação (IP) foi realizado como anteriormente descrito, com as seguintes modificações: Em resumo, os lisados ​​de cromatina cortadas (500 ug) foram pré-aclarado por incubação com 50 ul de proteína A agarose /L (Roche Molecular Biochemicals) para reduzir o fundo causado pela adsorção não-específica para os grânulos, incubadas durante 6 horas, quer com 20 ug de anti-acetilado H3K9 /14 (Upstate), anti-trimetilada H3K9 (Upstate) ou soro normal de coelho (NRS) a 4 ° C com rotação constante. Foi adicionada proteína A /G agarose (50 uL) e incubada durante a noite a 4 ° C. As esferas sedimentadas foram lavadas sucessivamente duas vezes com 1 ml de tampão de lise durante 15 minutos cada, a 4 ° C, seguido de 1 ml de WB1 (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, NP40 a 0,1%, 0,05% de desoxicolato de sódio, comprimido completo de inibidor de protease), 1 ml de WB2 (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NP40 a 0,1%, 0,05% de desoxicolato de sódio, completa do comprimido inibidor de protease) e 1 ml de TE estéril. As pérolas foram ressuspensas em 200 ul de TE /SDS a 1%, incubadas a temperatura ambiente (ta) durante 15 min e centrifugou-se a 3000 r.p.m. durante 1 min à temperatura ambiente. Metade do sobrenadante foi então incubada durante a noite a 65 ° C para reverter as ligações cruzadas, seguido por 100 mg de proteinase K a 55 ° C durante 2 h. O ADN foi purificado utilizando o kit de purificação PCR QIAquick (Qiagen, Valência, CA, EUA) e eluiu-se em 100 ul de TE.

A genotipagem

DNA de HIEC e HCT116 foi genotipados no microarrays Ilumina HAP550 pelo serviço de genotipagem Genizon Biosciences Inc., de acordo com as instruções do fabricante e como foi descrito [19]. DNA de Colo205 foram genotipados na matriz dupla 1 M, de acordo com as instruções do fabricante. Para explicar a diferença na produção microarray, multiplicou os rácios LOGR da matriz de 1 M de 2,0 para a apresentação com essas parcelas geradas a partir da matriz HAP550. Isto permitiu a apresentação de parcelas com amplitude equivalente. dados de microarranjos são depositados em Dryad. (doi: 10,5061 /dryad.43h8c)

Cálculo de diferenças de frequência de alelos B

plotamos frequência B-alelo (BAF) diferenças contra a posição cromossômica, apresentando os dados de duas maneiras. Em primeiro lugar calculou-se o desvio do BAF da preparação de controlo cromatina precipitados com soro de coelho normal para cada uma das duas amostras imunoprecipitadas. A diferença entre estes valores foi calculado em cada SNP, o valor absoluto e foi obtido 11-marcador médias móveis de janela foram representados graficamente versus a posição cromossómica. Em segundo lugar, para cada SNP, simplesmente subtraído BAF para a amostra H3Ac do que para a amostra H3M (normalizado) e os valores absolutos destas diferenças foram em média mais de 11-marcador como acima janelas em movimento e representados graficamente versus posição. Não havia nenhuma diferença significativa entre os dois processos de cálculo, e apresentamos apenas os dados obtidos pelo segundo dos dois métodos. Três testes foram realizados para validar os resultados, conforme descrito na secção seguinte.

Validação de Peaks Diferença BAF como representando Allelic Viés

Para validar esses dados, realizados dois testes estruturais e funcionais. Em primeiro lugar, se os picos de BAF diferença alélica reflectir viés conformacional real, em seguida, uma conformação aberta deve estender-se ao longo do comprimento de BAF diferença em um homólogo e conformação fechada na outra. Assim, os padrões de BAF diferenças nas respectivas amostras de aparas deve aparecer como haplótipos de um ou de outro homólogo. Encontramos os padrões para ser perfeitamente consistente (p binomial = 1,4 × 10

-45 para HCT116, 5,8 × 10

-11 para HIEC; dados para vários blocos LD dentro de dois picos são dadas no arquivo S1, Fig 2 , a Fig. 3). O segundo teste de validação baseou-se na expectativa de que dentro de um pico de BAF diferença, e apenas um dos alelos realizado um gene na conformação aberta, de modo que o padrão de expressão deste gene deve tendem a ser monoalélicos. As amostras de ADNc de sete genes nestas regiões que continham cSNPs heterozigóticos foram ensaiados e verificou-se que o enriquecimento significativo ou completa para um alelo (Ficheiro S1, Fig. S3). O terceiro teste baseou-se na expectativa de que pelo menos alguns dos picos de diferença em células BAF HIEC deve corresponder a domínios conhecidos de expressão monoalélicos em células normais. Desde HIEC são policlonais, não deve detectar qualquer viés alélicas no cromossomo X ou em outros locais sujeitos a inativação aleatória de alelos (S1 Arquivo); entretanto, nos domínios imprimido, inativação de alelos não é aleatória, mas específico do pai, então todas as células em uma população policlonal deve ostentar a marca de impressão no mesmo alelo. Assim, encontramos cinco dos picos de diferença HIEC BAF, incluindo o maior pico em 22,9 Mb do cromossoma 15 (Fig. 3), correspondeu precisamente com ICR (S1 Arquivo). Todas as outras ICR interrogado, incluindo a de que controlar o cluster H19, são homozigotos em HIEC e, portanto, indetectável.

Informações de Apoio

arquivo S1.

texto de apoio e figuras S1, S2 e S3. Figura S1. Validação que BAF picos diferença refletem domínios contíguos em HCT116. Nós fundamentado que, se diferenças BAF representado autênticos diferenças entre os dois homólogos, o material immunoprecitated por anti-Me deve principalmente ser derivado de um homólogo, e que por anti-Ac principalmente a partir do outro ao longo do comprimento de alta LD. Duas regiões sob a longo pico da BAF diferença na Chr1 (painel superior) foi encontrado com o qual os dados HapMap mostrou muito alto LD (r

2 mais de 0,9 em todo). A maior freqüência do alelo foi traçado para anti-Ac (azul) e anti-Me (coral) para cada SNP dentro do prazo identificados de alta LD. Para cada SNP, o anti-Ac ChIP rendeu um BAF maior do que o anti-Me Chip, indicando concordância perfeita entre haplótipo e o material imunoprecipitado. Figura S2. Validação que BAF picos diferença refletem domínios contíguos em HIEC. Ver legenda da Figura S1. Três regiões de alta LD em CHR7 são mostrados. Mais uma vez foi observada concordância perfeita entre haplótipo e o material imunoprecipitado. Figura S3. Validação que BAF picos de diferença representam domínios de expressão monoalélicos em SPRY2 (em 80,1 Mb, CHR13). O ADN genómico e ADNc torno rs504122 (C heterozigótica /T em ambos HCT116 e HIEC) foram amplificados a partir de ambas as linhas e sequenciado. Os painéis superiores, ambos os alelos são expressos em HIEC, apenas o C em HCT116. painel inferior, as diferenças BAF traçadas nas duas linhas celulares, mostrando HCT116, mas não HIEC, com diferenças BAF

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063190.s001

(DOC)

Agradecimentos

os autores agradecem ao Dr. Jean-François Beaulieu para fornecer as culturas HIEC e Dr. Patrick Dion para assistência editorial.