Sumário

Desenvolvimento de agentes de contraste por ressonância magnética (MRI) que pode ser facilmente aplicado para imagens de tecidos biológicos sob contextos clínicos é uma tarefa desafiadora. Este é predominantemente devido à expectativa de um agente ideal MR ser capaz de ser sintetizados em quantidades grandes, que possuem maior vida de prateleira, biocompatibilidade razoável, a tolerância contra a sua agregação em fluidos biológicos, e alta relaxividade, resultando em melhor contraste de imagem durante biológica. Embora um repertório de relatórios abordam várias questões acima referidas, os resultados reportados anteriormente estão longe de ser ideal, o que exige mais esforços nesta área. No presente estudo, nós demonstramos fácil síntese em grande escala de sub-100 nm magnetite quase cúbico e nanopartículas de magnetite /sílica núcleo-invólucro (Mag @ SiO2) e a sua aplicabilidade como um agente de contraste para IRM T2 biocompatível de tecidos biológicos. Nosso estudo sugere que nanopartículas de magnetita revestidas de sílica reportados neste estudo pode potencialmente agir agentes de contraste MR como melhoradas, abordando uma série de questões acima mencionadas, incluindo vida útil mais longa e estabilidade em fluidos biológicos. Além disso, o nosso

in vitro

e

in vivo

estudos demonstram claramente a importância do revestimento de sílica para a melhoria da aplicabilidade de agentes de contraste T2 para imagiologia câncer

Citation:. Campbell JL, Arora J, Cowell SF, Garg A, UE P, Bhargava SK, et al. Magnetita (2011) Quasi-cúbica /sílica-Core Shell Nanopartículas na forma de Enhanced agentes de contraste para IRM para Cancer Imaging. PLoS ONE 6 (7): e21857. doi: 10.1371 /journal.pone.0021857

editor: Yi Wang, da Universidade de Cornell, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de fevereiro de 2011; Aceito: 8 de junho de 2011; Publicação: 01 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Campbell et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o interesse em nanomateriais magnéticos tem persistido ao longo do último poucos décadas, principalmente devido às suas aplicações em muitos campos tais como gravação magnética de dados, detecção, catálise e da biomedicina [1] – [5]. nanomateriais magnéticos têm atraído uma atenção especial na área da biomedicina, devido ao seu grande potencial na melhoria do diagnóstico de doenças atualmente disponível, prevenção e abordagens terapêuticas [6]. Por exemplo, o potencial de nanopartículas magnéticas para entregar precisamente drogas altamente biotóxicas para locais específicos no corpo [6], bem como a sua utilização como bio-sondas altamente especializados para imagiologia de diagnóstico tem sido demonstrado ligando marcadores biomoleculares para a sua superfície [1 ], [7]. Com estes desenvolvimentos, há uma demanda crescente de desenvolver nanomateriais magnéticos biocompatíveis com capacidades de imagem ultra-sensíveis, a fim de que eles podem ser usados ​​para uma ampla gama de

In vivo para aplicativos de imagens médicas.

imagiologia por ressonância magnética (MRI) é considerada uma ferramenta de imagem poderoso devido à sua capacidade de alta resolução espacial, a natureza não invasiva e a sua capacidade para evitar a radiação em contraste com as técnicas de imagiologia nucleares, tais como a tomografia por emissão de positrões (PET) ionizante [8] – [10]. Resumidamente, ressonância magnética funciona, tirando partido da excepcionalmente pequeno momento magnético inerente em cada protão que, sob a presença de um grande campo magnético, produz um efeito mensurável como um sinal na imagem MR. Os sinais produzidos através de relaxamento T1 (spin-lattice relaxamento) ou de relaxamento T2 (relaxamento spin-spin) depende dos parâmetros sequência programada para obter a imagem MR. No geral, T1 ponderada e imagem ponderada T2 fornecer diferentes efeitos contrastantes entre o tecido fluido e do corpo. Por exemplo T1 imagens ponderadas mostrar, tecidos à base de água como escuras fluidos como tecidos cinza e à base de gorduras, como brilhantes, assim, que mostram muito claramente os limites entre diferentes tecidos. Por outro lado, nas imagens ponderadas em T2, fluido aparece brilhante e água e tecidos à base de gorduras aparecem em cinza. A utilização de agentes de contraste melhora grandemente a especificidade e sensibilidade de ressonância magnética, encurtando quer relaxamento T2 dos protões de água adjacentes a eles ou T1, proporcionando assim informação mais detalhada sobre a patologia. agentes de contraste T1 à base de gadolínio são mais comumente usados ​​em MRI, as preocupações no entanto crescentes sobre a segurança de contrastes à base de gadolínio têm conduzir a uma importante mudança para agentes de contraste T2 base de óxido de ferro, que são considerados relativamente biologicamente segura [11] – [ ,,,0],. 13]

Embora, óxido de ferro agentes de contraste à base têm sido clinicamente aprovado para ressonância magnética, a sua utilização tem sido predominantemente restrita ao fígado /baço imaging (AMI-25 Feridex® – não mais em uso) e as lúmen gastrintestinal imagiologia (Lumirem® /Gastromark®). Esta limitação é principalmente devido ao tamanho maior das partículas de óxido de ferro envolvidos nesses agentes, os quais são ou absorvidos imediatamente pelo sistema reticuloendothelium após a administração intravenosa (Feridex®), ou são administrados por via oral (Lumirem® /Gastromark®). Portanto, existe uma urgência clínica para desenvolver agentes de contraste comercialmente viáveis ​​e biologicamente seguras que podem ser utilizadas para imagiologia de MR uma vasta gama de tecidos do corpo [14] – [16]. numerosos relatórios Além disso, tem havido em diferentes vias de síntese para agentes de contraste de nanopartículas à base magnéticos, incluindo as nanopartículas magnéticas biologicamente sintetizados [17] – [18], as nanopartículas magnéticas com núcleos dendrim�icos [19], lipossomas superparamagnéticas [20], lípidos à base de agentes de contraste para RM [21], nanopartículas magnéticas dopado com metais [22] – [25], as partículas CoFe2O4 @ SiO2 com corantes fluorescentes incorporadas [26], e nanopartículas magnéticas, tanto para imagiologia e aplicações terapêuticas [27]. Além disso, no cenário pré-clínico, a tendência nos últimos anos tem sido no sentido do desenvolvimento de pequenas nanopartículas (nm-100 sub) de óxido de ferro [24], [28] – [31]. Os estudos anteriores sugerem que a mudança a partir de partículas de óxido de ferro sub-micron à sua forma de nanopartículas no ambiente clínico, os desafios que precisam ser superados incluem sua pequena vida de prateleira estabilidade biológica baixo químicas e, inerente citotoxicidade low-to-high, e baixa magnetização associado com as nanopartículas de óxido de ferro, que tem ainda sido abordados por alguns estudos recentes, até certo ponto, ele ainda requer esforços adicionais nesta área [32] – [34]. Este é predominantemente porque as propriedades acima mencionadas de agentes de contraste de RM pode fortemente dependem de sua rota de síntese.

Neste artigo, vamos abordar a maioria das questões acima mencionadas, demonstrando o desenvolvimento de uma, base de óxido de ferro em T2 agente de contraste para IRM com razoavelmente baixa citotoxicidade, alta relaxividade, e alta estabilidade particularmente notável que pode ser armazenado à temperatura ambiente durante mais de 6 meses, sem qualquer agregação visível. A estabilidade química destas nanopartículas é conseguido por revestimento com uma camada de sílica inorgânico (SiO 2), levando a Mag @ SiO2 nanopartículas de núcleo-revestimento. As nanopartículas resultantes foram analisadas por um dispositivo de medição de interferência supercondutores quantum (SQUID), de alta resolução microscopia electrónica de transmissão (HRTEM), difracção de raios-X (DRX) e um scanner de IRM clínica 3 Tesla. Nossos

in vitro

estudos indicam que o revestimento com SiO2 torna estas nanopartículas biocompatíveis e eles são levados activamente pelas células de câncer de próstata sob

in vitro

condições. Nossa preliminar

in vivo

estudos com modelo animal tumor de mama sugere ainda mais a sua utilidade potencial como bons agentes de contraste MRI para a imagem latente do tumor.

Resultados e Discussão

Figura 1A mostra a imagem TEM das (MAG) nanopartículas magnéticas, o que indica que as nanopartículas como Mag-sintetizados preparadas pela via de síntese foram quase cúbico na morfologia com boa monodispersity e um tamanho médio de 40 ± 5 nm. Notavelmente, utilizando a nossa abordagem, a síntese em grande escala de nanopartículas Mag poderia ser conseguido (pelo menos até 10 g de partículas por lotes), sem comprometer a forma de nanopartículas ou monodispersity. A partir da imagem ampliação TEM superior, essas nanopartículas Mag foram encontrados para ter bordas esféricas, e parece como se estas nanopartículas consistem em várias partículas esféricas menores que montam em conjunto dão origem a estruturas quase cúbico (inset Figura 1A). É importante notar que, sob condições de armazenamento à temperatura ambiente, as nanopartículas Mag imaculadas perder sua morfologia quase cúbica e transformá-esférica após duas semanas de síntese. A vida útil de agentes de contraste para IRM disponíveis comercialmente é de facto uma das principais limitações associadas com aplicabilidade clínica de tais materiais. SiO

2 revestimento de concha tenha sido previamente demonstrado para proporcionar biocompatibilidade, estabilidade das partículas, bem como uma superfície mais fácil para biofunctionalisation nanomateriais em diferentes [27] – [29]. Portanto, para assegurar a estabilidade química de nanopartículas magnéticas, uma concha de sílica foi crescido em torno de partículas de Mag-quase cúbico (dentro de 3 dias após a sua síntese), produzindo, assim, Mag @ SiO2 nanopartículas de núcleo-revestimento (Figura 1B). O revestimento de sílica controlada de nanopartículas Mag levou a formação de estruturas de núcleo-revestimento Mag @ SiO2 com um ca. 20 ± 2 nm shell de sílica em torno de 40 ± 5 nm nanopartículas Mag quase-cúbico (Figura 1B e inserção). Grande área de análise de TEM de estruturas de núcleo-revestimento de SiO2 Mag @ indicou que a maioria das nanopartículas Mag mantiveram a sua morfologia quase cúbico após o revestimento de sílica, e mais de ca. 75% das partículas na amostra foram encontrados para ser revestidos individualmente com um invólucro de sílica. No entanto, menos de ca. 25% de estruturas consistiam de dois ou três ou sem partículas Mag no interior do invólucro de sílica. Notavelmente, este tipo de distribuição é típico de partícula de uma via de síntese química, que não é necessariamente sempre explicitamente reconhecido na literatura que prevalece. Além disso, observou-se que após o revestimento nanopartículas Mag com sílica, as partículas de Mag @ SiO2 permanecem estáveis ​​em solução salina de tampão fosfato (PBS) para, pelo menos, até 1 mg /ml de concentração, assim como na forma de pó prontamente dispersível para a menos até 6 meses. A imagem TEM mostrado na Figura 1B foi adquirido depois de 6 meses de armazenamento, as nanopartículas de Mag @ SiO2, à temperatura ambiente e foi semelhante àqueles fotografada imediatamente após a síntese. Isto sugere que um revestimento de sílica sobre nanopartículas Mag pode melhorar significativamente a sua estabilidade para as condições de armazenagem a longo prazo, mantendo assim as suas propriedades magnéticas, melhorando a sua vida de prateleira. Este é um dos parâmetros cruciais para o desenvolvimento de agentes de contraste à base de ressonância magnética para aplicações clínicas e comerciais.

inserções mostram as respectivas imagens de alta resolução TEM.

Figura 2 mostra os padrões de DRX de Mag e Mag @ SiO2 nanopartículas. O padrão de DRX obtidos a partir de nanopartículas Mag quase cúbicos (curva 1) podem ser indexados com base no padrão de difração padrão normalmente decorrente de magnetita (Fe

3O

4) com os principais picos indexados (JCPDS arquivo Não 75-0449). Após o revestimento de sílica, a maior parte dos picos de difracção que derivam de nanopartículas Mag ainda podia ser detectado. No entanto Curiosamente, após o revestimento de sílica, um pico adicional a ca. 29,3 ° 2θ foi observado que poderia ser atribuído ao (220) de um avião

2 de fase ferro-silício (curva 2) (não apresentar JSPDS. 73-0963). A fase de Fe-Si é misturada muito provavelmente formados na interface de sílica e magnetita durante a síntese de núcleo-revestimento de nanopartículas Mag @ SiO2.

picos de DRX com reflexões de Bragg de magnetite correspondentes foram indicadas. (*) Corresponde ao pico de XRD resultante a partir de uma fase de Fe-Si misto.

alta magnetização de saturação de agentes de contraste de RM é um requisito importante para as nanopartículas magnéticas para ser utilizado para a aplicação de ressonância magnética. A curva de histerese magnética de nanopartículas Mag @ SiO2 obtidos por medição SQUID é mostrado na Figura 3, que se verificou não têm campos coercivos, confirmando assim a sua natureza superparamagnético. Mag @ nanopartículas de SiO2 foram encontrados para possuir um nível relativamente elevado valor de magnetização de massa de 74,4 emu /g, que é comparável à anteriormente relatada valores de magnetização de massa de 72,9 emu /g de partículas de óxido de ferro disponíveis comercialmente Resovist [35].

O Mag e Mag @ SiO2 sintetizados neste estudo foram ainda testados quanto à sua capacidade de ser interiorizado pelas células de cancro da próstata PC3 humanos (Figura 4). Quando submetido a estudos de captação celular, durante 24 h, a 50 ug /ml de Mag @ SiO2 nanopartículas foram encontrados para ser captado por células de cancro da próstata PC3 mais eficientemente do que uma concentração semelhante de nanopartículas Mag nus (comparar as Figuras 4B e C). Quando as células de cancro PC3 foram expostos a nanopartículas Mag, observou-se que as nanopartículas de Mag nus sem qualquer SiO

2 de revestimento tendem a formar agregados grandes (de dimensões semelhantes ao tamanho da célula) na solução durante um período de exposição de 24 h, o que restringiu a sua capacidade de ser absorvido pelas células PC3 (figura 4B). Como pode ser inferido a partir da Figura 4B, estas grandes aglomerados de nanopartículas Mag nus predominantemente anexar para o exterior das células, e são difíceis de serem internalizados por células de cancro da próstata PC3. Por outro lado, depois de SiO

2 revestimento, nanopartículas Mag @ SiO2 permanecem bem dispersos na solução, mesmo após 24 h, o que facilita a sua absorção eficiente pelas células PC3, como pode ser visto a partir de uma maior densidade de nanopartículas Mag @ SiO2 dentro PC3 células de cancro da próstata (Figura 4C). O nosso grupo e outros já anteriormente demonstrado que a dimensão de nanopartículas e agregação em meios biológicos pode desempenhar um papel crucial em processos de captação celular, tal como a absorção não específica de sub-100 nanopartículas nm é geralmente observada através do mecanismo de endocitose das células [36] – [ ,,,0],39]. Agregação de nus (cristalinas) nanopartículas Mag em meios biológicos, assim como evitar a sua agregação após o revestimento de sílica sugere claramente o papel importante de SiO

2 de revestimento, ea vantagem de Mag @ SiO2 nanopartículas core-shell sobre nanopartículas Mag nuas para aplicações biológicas . Com base nos resultados de estudos de captação celular, nanopartículas Mag cristalinas foram considerada inadequada para aplicações biológicas, e, portanto, apenas nanopartículas Mag @ SiO2 foram escolhidos para estudos posteriores em relação à sua adequação para aplicações de MRI.

A partir do estudos de captação celular, é também evidente que as nanopartículas Mag @ SiO2 não causar qualquer mudança significativa com a morfologia de células de cancro da próstata PC3. Estudos anteriores indicam que as nanopartículas de óxido de ferro não são tóxicos na concentração mais baixa, mas pode ser ligeiramente tóxico em concentrações mais elevadas [40] – [41]. Antes de explorar nanopartículas Mag @ SiO2 para a aplicação de ressonância magnética, perfil biocompatibilidade destas partículas foi avaliada através da realização de MTS com base em

In vitro

experiências de citotoxicidade em células do cancro da próstata PC3, que é uma das medidas de biocompatibilidade (Figura 5) . É evidente a partir da Figura 5 que as nanopartículas Mag @ SiO2 não afecta significativamente a viabilidade das células PC3 para, pelo menos, até 50 ug mL-1 concentrações de Fe, em que mais do que 85% de células PC3 viabilidade foi mantida. No entanto aumento adicional na concentração de SiO2 Mag @ nanopartículas equivalente a 100 ug ml

-1 Fe resultou em uma perda de viabilidade celular de ca. 30%. Isto sugere que as nanopartículas Mag @ SiO2 reportados neste estudo pode ser adequado para aplicações de MRI no prazo de 50 ng mL

-1 Fe faixa de concentração. No entanto, este aspecto pode exigir uma investigação mais detalhada, na qual efeito do Mag nanopartículas @ SiO2 sobre citocina perfil de produção de células terá de ser investigado.

Uma vez que os nanomateriais magnéticos podem modular os efeitos de melhoria de sinal MR, a capacidade de nanopartículas Mag @ SiO2 como agente de contraste T2 MR foi ainda avaliado em termos da sua relaxividade (R2 ou taxa de relaxamento, que é igual a 1 /T2, onde T2 é de spin-spin tempo de relaxamento) em um Tesla digitalizador 3 MRI clínica em um tempo de eco ( TE) de 10,86 ms. Relaxividade é uma medida da eficácia de um agente de contraste de MR para melhorar o relaxamento de protões e aumentar a eficiência de contraste de imagem, que é produzido durante a MRI [42]. As medições foram realizadas tanto relaxividade em nanopartículas em suspensão como fantasmas, bem como depois de ser absorvido pelas células de cancro da próstata PC3. Mag @ nanopartículas de SiO2 foram encontrados a ter um elevado valor de relaxividade de 263,23 L /mmol /s em suspensões de células livres, e 230,90 l /mmol /s para as nanopartículas Mag @ SiO2 dentro das células PC3. Alto valor de relaxividade (isto é, melhor contraste MR), juntamente com o valor de magnetização de alta massa para a ressonância magnética são considerações importantes no desenvolvimento de agentes de contraste T2, como o processo de relaxamento spin-spin de prótons em moléculas de água em torno das nanopartículas é facilitada pela grande magnitude rodadas em nanopartículas magnéticas [43] – [44]. nanopartículas Mag @ SiO2 com alta magnetização de massa e altos valores de relaxividade pode, portanto, resultar em forte MR diminuição da intensidade de sinal em T2 como medido por ressonância magnética [45]. Isto é crítico para permitir que a actividade nanomolar de agentes de contraste, o que vai facilitar a redução da dose total do agente de contraste para os pacientes.

Os dados relaxividade sugere também uma redução no valor de relaxividade de nanopartículas Mag @ SiO2 em células PC3 depois da absorção celular em comparação com o que em suspensão. Este achado corrobora bem com estudos anteriores, que mostraram que os relaxamentos de nanopartículas de óxido de ferro nativos foram mais elevados em comparação com aqueles que depois de acumulação nas células [46] – [47]. Os mecanismos responsáveis ​​para este efeito não foi ainda completamente compreendido, no entanto, pode, eventualmente, ser atribuído ao confinamento de nanopartículas dentro de endossomas das células alvo, que pode causar uma acumulação de falta de homogeneidade do campo magnético depois compartimentalização sub-celular, o qual seria inversamente estar ausente em nanopartículas uniformemente distribuídas em suspensões [48]. Além disso, o arranjo geométrico diferente das nanopartículas em suspensão e nas células, e, possivelmente, de acoplamento antiferromagnetic como resultado de aglomeração no interior dos compartimentos sub-celulares podem desempenhar algum papel na redução da relaxividade valores após a absorção celular [28], [48]. Notavelmente, em contraste com os valores relaxividade de 230-269 L /mmol /s observados para as nanopartículas Mag @ SiO2 neste estudo, baseado nanopartículas Resovist comerciais têm sido relatadas com valores mais baixos de 151 L /mmol /s [35]. O valor relaxividade observada de nanopartículas Mag @ SiO2 preparadas neste estudo também é relativamente maior do que os relatados por partículas de magnetite não dopadas (218 l /mmol /s) em estudos detalhados recentes [24]. Para as partículas magnéticas dopados, tem sido relatado que as altas relaxividades de até 358 l /mmol /s pode ser conseguida através da dopagem com magnetite Mn (MnFe

2O

4) [24]. No entanto, o potencial de lixiviação de Mn durante a administração destes agentes de contraste MR no corpo pode representar problemas de citotoxicidade, e com o melhor do conhecimento dos autores, não dopadas nanopartículas Mag @ SiO2 com tais valores elevados de relaxação não tenham até agora sido relatados.

Além disso, estudos relaxividade como uma função de diferentes concentrações de Fe em nanopartículas Mag @ SiO2, tanto como suspensão de nanopartículas em fantasmas (Figura 6A) e, após 24 h de absorção de nanopartículas por células de cancro PC3 da próstata (Figura 6B) revela que mag nanopartículas @ SiO2 agir como agentes de contraste em T2 em circulação. Isto é mostrado por um efeito de imagem escurecimento, demonstrado pela queda na R2 (ΔR2 /R2

controle) a intensidade de sinal com o aumento da concentração de Fe. Por exemplo, a 100 mg de concentração /mL Fe, nanopartículas Mag @ SiO2 proporcionar um aumento do sinal de ~ 90% em comparação com o aumento de sinal mais de 70% durante o exame das células cancerosas da próstata PC3. Este é um melhoramento de sinal significativa, em comparação com a maioria dos materiais anteriormente relatados, em que tem sido observado, geralmente, apenas o aumento do sinal de 15-20% [28]. Esse reforço de sinal MR forte é esperado de nanopartículas Mag @ SiO2 por causa de seus valores relativamente altos relaxação e magnetização de saturação.

O painel A mostra os estudos realizados em fantasmas para as partículas em suspensão, enquanto o painel B mostra os estudos semelhantes em PC3 células cancerosas humanas da próstata após nanopartículas absorção por 24 h. Correspondente imagens de RM ponderadas em T2 de amostras diferentes, mostrando a imagem efeito escurecendo com o aumento da concentração de Fe também são mostrados em cada bar.

In vivo

exames de ressonância magnética em um mouse tumor de mama modelo também demonstrou o aumento do sinal T2 no local do tumor por nanopartículas Mag @ SiO2 (Figura 7). As imagens seguintes

In vivo

administração da dose de 10 ug de nanopartículas Mag @ SiO2 demonstrar a sua capacidade para produzir melhoramento de MR no local do tumor em relação ao corpo. efeitos de melhoria de sinal em T2 por nanopartículas Mag @ SiO2 em uma imagem MR são visualizadas como escurecimento ou o contraste entre as áreas infiltradas com Mag @ nanopartículas SiO2 e sem nanopartículas. estudos futuros sobre Mag @ SiO2 podem ser adaptados para MRI alvo, utilizando as suas características magnéticas superiores no diagnóstico de patologias.

Mouse 2 foi injectado com nanopartículas Mag @ SiO2 como agente de contraste T2, enquanto Rato 1 foi injectado com solução salina como controlo. locais de tumor no controle (mouse 1) e no ratinho tratado (mouse 2) foram rotulados como círculos azuis e vermelhos, respectivamente. Painéis C e D mostram as imagens de seção transversal maior ampliação de local do tumor correspondente a Painéis A e B, respectivamente, em que a região do tumor injetado com agente de contraste MR tem sido destacada usando círculos brancos.

Em resumo, importante considerações para um agente de contraste para IRM eficaz incluem o tamanho de partícula mais pequeno, a sua absorção eficiente pelas células, a agregação reduzida nos fluidos biológicos, melhoraram a vida de prateleira, e uma melhor biocompatibilidade. Um controlo sobre todos estes parâmetros irão fornecer uma capacidade de atingir uma gama de aplicações de imagens moleculares /celular sem causar toxicidade aguda para as células normais. Especialmente para aplicações de imagem de tumor, sub-partículas 100 nm pode proporcionar uma vantagem significativa, como o diâmetro de corte de poros dos vasos tumorais é 400-600 nm [41] – [43], [49] – [51].

neste estudo, nós demonstramos uma síntese, em larga escala fácil de magnetite quase cúbica e nanopartículas Mag @ SiO2 de sub-100 nm de tamanho. As nanopartículas Mag @ SiO2 relatados aqui têm um prazo de validade de mais de 6 meses, e que são eficientemente absorvido pelas células sem causar agregação significativa ou toxicidade celular. A meia-vida biológica de nanopartículas pequenas e revestido de silica de óxido de ferro deverá ser aumentada devido à sua reduzida interacção com os fluidos corporais. Assim, este estudo sublinha claramente a importância de SiO

2 de revestimento para melhorar a absorção de nanopartículas Mag @ SiO2 pelas células cancerosas da próstata PC3, e melhorar a vida de prateleira de agentes de contraste de RM. As nanopartículas compostas magnética em sílica agir agentes de contraste T2 como promissores que oferecem uma opção potencialmente viável como um agente de contraste MR comercial. Isto é atribuível ao seu pequeno tamanho, de elevado Mr reforço do sinal, em relação a biocompatibilidade, a vida de prateleira mais longa e altamente modificável química de superfície de sílica que vão permitir que a adesão de vários marcadores moleculares para MRI alvo no futuro. Estas características de um agente de contraste T2 são altamente desejáveis ​​para aplicações de ressonância magnética no nível pré-clínica e para uso posterior clinicamente.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

o modelo de ratos de tumor de mama foi desenvolvido in-house, e todos os estudos envolvendo animais foram pré-aprovados pelo comitê de ética animal institucional.

Materiais

Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich e usados como recebidos sem qualquer modificação adicional. As células de cancro da próstata PC3 (linha celular) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC). CellTiter 96 Aqueous One Solution Proliferação Celular Assay (Promega) kit foi adquirida da Promega Corporation.

Síntese de nanopartículas de óxido de ferro

nanopartículas de óxido de ferro Quasi-cúbicos (referidas como “Mag”) foram sintetizados usando um processo de duas etapas significativamente modificada de Park

et ai

, conduzindo assim a síntese em larga escala controlada [52]. Durante a síntese, um complexo de oleato de ferro foi formada em primeiro lugar pela dissolução de 5,4 g de cloreto de ferro e 18,25 g de oleato de sódio em uma solução composta de 40 ml de etanol, 30 mL de água destilada e 70 ml de hexano. Depois de homogeneizada, a solução foi submetida a refluxo a 70 ° C durante 4 h, seguido por separação da camada orgânica superior usando um funil de separação, lavagem e evaporação hexano, deixando assim um complexo de ferro oleato ceroso. Os nanocristais de óxido de ferro foram formados por dissolução de 9,0 g do complexo de oleato de ferro em 1,425 g de ácido oleico e 63,3 ml de 1-octadeceno, seguido de refluxo, sob azoto, até atingir 320 ° C, altura em que a temperatura foi mantida durante 30 min e, em seguida, deixada arrefecer até à temperatura ambiente. 250 ml de etanol foi então adicionado à solução e as partículas de magnetite foram separados por meio de centrifugação, seguindo-se três ciclos de lavagem com etanol. Nomeadamente, através da concepção deste protocolo, a escala de, no mínimo até 10 g nanopartículas magnéticas por reação pode ser facilmente alcançado em condições de laboratório.

Síntese de óxido de ferro revestido de sílica (Mag @ SiO2) nanopartículas

nanopartículas de óxido de ferro revestido de sílica (SiO2 Mag @) foram preparados usando um método significativamente modificado a partir fang

et al Comprar e Morel

et al

[53] – [54], em que hidrólise controlada do precursor de sílica, na presença de nanopartículas de magnetite foi realizada. Na nossa abordagem, partículas magnéticas pré-formados foram utilizados como locais de nucleação para a hidrólise subsequente do precursor de sílica em torno deles. Em resumo, 1 mg de nanopartículas de óxido de ferro foi preparado na etapa anterior foram sonicadas numa solução consistindo de 15 mL de etanol e 2 mL de água desionizada (MilliQ). 1 ml de amoníaco (solução a 25%) foi adicionada à solução anterior enquanto imersa num sonicador programado para ligar durante 1 min em cada 10 min. Além disso, um agitador superior foi adicionalmente usada para misturar a solução enquanto se 4 mL de 1:60 (orthosilicate:ethanol tetraetilo) foi adicionado a uma taxa de 0,4 ml /h, usando uma bomba de seringa, e a solução foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 12 h. As nanopartículas de óxido de ferro revestido de sílica foram centrifugadas, lavadas três vezes com etanol e novamente dispersadas em água MilliQ.

Materiais caracterização

A morfologia e tamanho das Mag e Mag @ SiO2 nanopartículas foi caracterizado usando JEOL 2010 alta resolução de electrões de transmissão (HRTEM) microscópio operada a uma voltagem de aceleração de 200 kV. As amostras para medições HRTEM foram preparados por partículas de fundição em gota para uma grelha de cobre revestida a carbono, seguido por secagem ao ar. A cristalografia dos pós nanomaterial foi obtido em um difratômetro de raios-X Bruker D8 ADVANCE usando radiação Cu Ka. Para medições magnéticas, foi utilizado um magnetômetro baseado dispositivo de interface quântico supercondutor (Quantum projeto MPMS-XL5). O teor de ferro das soluções de nanopartículas utilizadas para

in vitro

e

in vivo

estudos foi verificada em um Varian AA280FS rápido sequencial de Absorção Atômica Spectrometer (AAS) após a digestão de partículas durante a noite em ácido nítrico.

In vitro

estudos celulares e ensaios de citotoxicidade

próstata humano células cancerosas (linha celular PC3) foram rotineiramente cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 usando meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% penicilina, 1% estreptomicina /penicilina e 1 mM de L-glutamina. Para a sub-cultura, as células de cancro PC3 próstata foram separadas por lavagem com salina tamponada com fosfato (PBS) e incubação com uma solução de tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, EDTA 1 mM) durante 5 min a 37 ° C, seguido de lavagem e incubação com suplementado meio RPMI 1641. Para a absorção celular, as células foram primeiramente semeadas em 24 cavidades pratos de poliestireno, durante 24 h, seguido de incubação com nanopartículas Mag e Mag @ SiO2 durante 24 h a 37 ° C em meio celular completo, e subsequente três vezes a lavagem das células com PBS , antes de imagem sob um microscópio invertido. Para os ensaios de citotoxicidade, foi determinada a viabilidade das células de cancro da próstata PC3 expostos a nanopartículas Mag @ SiO2, na ausência de meio de crescimento celular. Um CellTiter 96 Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular (Promega) kit contendo o composto de tetrazólio 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS), foi utilizada para monitorar a viabilidade celular de acordo com os protocolos do fabricante. MTS mudança de cor foi monitorizada utilizando um leitor de placas a 490 nm, e os dados de viabilidade celular foi representada graficamente, considerando a viabilidade para as células não tratadas como 100%. As experiências foram realizadas em triplicata, e as barras de erro representam erros experimentais padrão.

ressonância magnética (MRI) estudos

exames de ressonância magnética foram realizados em soluções de nanopartículas armazenados em fantasmas, em células de câncer de próstata PC3 depois absorção de nanopartículas, e num modelo de ratinho com cancro da mama. Para os estudos de ressonância magnética fantasma, fantasmas foram preparados em tubos de Eppendorf com nanopartículas Mag @ SiO2 em três concentrações diferentes de Fe (0,18 mM, 0,9 mM, 1,79 mM) e uma solução salina sem qualquer nanopartículas foi utilizada como um controlo. Para

In vitro

estudos de MRI, células de cancro PC3 foram cultivadas utilizando o protocolo anteriormente referido, em placas de 24 poços de poliestireno, e incubados durante 24 h com nanopartículas e Mag Mag @ SiO2 em três concentrações diferentes (0,18 mM, 0,9 mM, 1,79 mM) e com um controlo de células, mas não há nanopartículas. medições de MRI para fantasmas e células PC3 foram realizadas com um scanner de 3.0 Tesla clínica Clinical Siemens Trio MRI utilizando uma bobina de cabeça de 12 canais e os seguintes parâmetros: imagem ponderada em T2, sequência gradiente eco, tempo de eco múltipla (TE) variando de 0.99- 100 ms, tempo de repetição (TR) = 2000 ms, matriz de 128 × 128, espessura de corte de 3 mm. as taxas de relaxamento (R2) foram determinadas utilizando uma única sequência de eco (SE) com uma constante de TR 2000 ms e TE múltiplos variando de 0.99-100 MS. O sinal foi representada graficamente como uma função do tempo de eco e equipada para obter os valores de R2. Os valores de R2 do Mag @ SiO2 em fantasmas e células PC3 foram determinados traçando a relaxividade a um TE de 10,86 ms, como uma função da concentração de ferro molar em respectivas amostras, e extraindo o valor T2 a partir do declive por regressão linear dos dados Os pontos obtidos em valores de concentração mais baixos de Fe.