Abstract

linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) é caracterizada por uma grande heterogeneidade genética e clínica que complica prognóstico previsão e influências eficácia do tratamento. O esquema mais comum, R-CHOP, consiste de uma combinação de drogas antraciclinas e imuno-baseados incluindo rituximab. Ele permanece indefinida como e em que medida os impactos da variabilidade genética da resposta e tolerância potencial de R-CHOP. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos que conduzem à tolerância da droga em células-B é essencial, e modelagem por intervenção genética directamente em células-B é essencial de tais investigações. vectores de genes baseadas em lentivírus são amplamente utilizados veículos de genes, o que em B-células são uma alternativa atraente para as metodologias baseadas transfecção potencialmente tóxicos. Aqui, nós investigamos o uso de vetores de lentivírus VSV-G-pseudotipados em células B para explorar o impacto dos microRNAs na tolerância ao Rituximab. Notavelmente, descobrimos que a transdução lentiviral robusta de linhas de células B cancerosas marcadamente e especificamente aumenta a resistência de transduzidas centro germinal As células B (GCBs) ao rituximab. Embora o rituximab funciona parcialmente através da lise celular mediada pelo complemento, o aumento da tolerância não é conseguido por meio de efeitos de transdução lentiviral sobre a morte celular mediada por complemento. Pelo contrário, níveis reduzidos de PARP1 e altos níveis persistentes de CD43 em GCBs tratados com Rituximab demonstraram efeitos anti-apoptóticos de transdução lentiviral que podem interferir com o resultado e interpretação de estudos de tolerância rituximab. Nossos resultados sublinham que o cuidado deve ser exercido explorando lentivirais em estudos de tolerância à terapêutica em DLBCL. É importante ressaltar, no entanto, demonstrar a viabilidade do uso da plataforma lentiviral entrega de genes em estudos abordando o impacto da microRNAs específicos sobre a capacidade de resposta Rituximab

Citation:. Ranjbar B, Krogh LB, Laursen MB, Primo MN, Marques SC, Dybkær K, et al. (2016) Anti-apoptóticos Efeitos de Lentivirus Vector Transdução de promover o aumento da tolerância Rituximab em cancerosas B-Cells. PLoS ONE 11 (4): e0153069. doi: 10.1371 /journal.pone.0153069

editor: Kristy L. Richards, da Universidade de Cornell, Estados Unidos

Recebido: 24 de novembro de 2015; Aceito: 23 de março de 2016; Publicação: 05 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Ranjbar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Agnes og Poul Friis Fond; Aase og Ejnar Danielsens Fond; Frits, Georg og Marie Cecilie Gluds Legat; Else og Mogens Wedell-Wedellsborgs Fond; Civilingeniør Frode V. Nyegaard og hustrus Fond; Arvid Nilssons Fond; Fabrikant Ejnar Willumsens Legat. Todos receberam por J. G. Mikkelsen. PhD mobilidade comunhão da Universidade de Aarhus recebido por B. Ranjbar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

linfoma difuso de grandes células B. (DLBCL) é o tipo mais comum de não Hodgkin Lymphoma-em adultos com uma taxa de sobrevida global em 5 anos de 60%, ilustrando que alguns pacientes são ou não respondem ao tratamento atual ou desenvolver resistência aos medicamentos durante o tratamento. DLBCL é tanto clínica quanto molecularmente uma doença heterogênea. A maior subtipo é definido como DLBCL, e não de outro modo especificado (DLBCL, NOS), que por gene-expression profiling pode ser dividido nas seguintes subclasses moleculares: (i) de células B do centro germinativo (GCB) DLBCL e (II) activado B -cell (ABC) DLBCL, [1-3]. As duas subclasses moleculares GCB e ABC diferem na sinalização defeitos caminho, anormalidades genéticas e patogênese [1,4-6]. Os resultados de sobrevivência também diferem, pois os pacientes GCB tem uma maior taxa de sobrevivência em 5 anos de 69-79% em comparação com 52-53% para aqueles com ABC DLBCL quando tratados com uma imuno-padrão e regime multidroga quimioterapia baseada em antraciclina, conhecido como R -CHOP, que compreende rituximab (R), ciclofosfamida (C), doxorrubicina (H), vincristina (O), e prednisona (P) [7]. Além disso, cerca de um terço dos pacientes desenvolvem DLBCL recidivante /doença refractária. Assim, a descoberta de novos marcadores biológicos e agentes terapêuticos, bem como estratégias para superar a resistência aos medicamentos continuam a ser desafios fundamentais para a oferta de um melhor tratamento aos pacientes LDGCB.

O rituximab é o primeiro anticorpo aprovado pela FDA para ser usado no tratamento de DLBCL . Rituximab como alvo moléculas de CD20 na superfície de células B e pré-estágios mais diferenciados de células B [8]. CD20 é um antigénio de superfície de células específicas de diferenciação, que está presente na superfície de células B a partir de fases precoces do desenvolvimento de células B para as fases de maturação pós-germinais, mas não sobre a superfície de células plasmáticas maduras [8]. A molécula está envolvida na activação e proliferação das células B e é pensado para fazer parte de um complexo da superfície celular envolvidas no transporte de cálcio, embora o ligando para CD20 permanece desconhecido [8]. Diferentes mecanismos de acção foram descritos para o rituximab, incluindo a citotoxicidade celular dependente do complemento (CDC), dependente de anticorpos mediada por células citotoxicidade (ADCC), e indução directa da morte celular por apoptose [8,9]. No entanto, apesar dos benefícios de rituximab, a resistência aos medicamentos continua a ser um desafio para o tratamento eficiente e prolongada. Vários mecanismos que conduzem à tolerância rituximab foram descritos; Estes incluem a regulação negativa da expressão de CD20 [10-12], a sub-regulação de proteínas envolvidas-apoptose, tais como Bak, Bax e [13], e a inibição da actividade de MAPK p38 [14], como recentemente revisto por Pérez-Callejo e colegas [15]. Além disso, microARNs (miARNs) Acredita-se que contribuem para a resposta da droga e o potencial de resistência através da sua capacidade para modular a expressão de proteínas de vias de transdução de sinal chave [16-18].

MiRNAs são pequenos (cerca de 20 nucleótidos ) RNAs que o pós-transcricional regulam a expressão do gene através da via interferência de RNA [19] não-codificante. Estas moléculas de RNA, expressa a partir de genes ou RNApolII- RNApolIII transcritos no genoma, são processados ​​tanto no núcleo e, após exportação nuclear, no citoplasma. Como parte do complexo induzida pelo RNA silenciamento (RISC), miRNAs maduros emparelham com sítios de reconhecimento em mRNAs alvo e mediar a degradação mRNA ou supressão de translação [20,21]. A interacção entre miARN e ARNm é baseado no emparelhamento de bases, mas jogo completo entre as duas moléculas não é necessária para a função de miARN. Assim, uma única miARN tem o potencial para atingir e regulam muitos mRNAs diferentes, enquanto que um ARNm específico pode ser alvo de um conjunto de diferentes miARNs. Isso cria uma rede de interações gene regulador e sugere que miRNAs desempenhar um papel de tamponamento na regulação dos genes com alguma redundância potencial entre miRNAs. Considerando estas actividades, miARNs são jogadores crítica em muitas vias celulares e de desenvolvimento e auxiliar na regulação propriedades celulares básicas, incluindo a diferenciação, proliferação, apoptose, e a homeostase. É bem conhecido que a regulação miARN influencia o desenvolvimento e progressão [22] do cancro, e miARN pode servir quer como supressores de tumores ou oncogenes, com base no seu gene (s) alvo auxiliar na supressão e promoção, respectivamente, do crescimento e a progressão do cancro [23 -26].

global miRNA expressão profiling estudos têm revelado assinaturas miRNA distintos para diferentes subgrupos LDGCB, sugerindo que os cancros de células B podem ser classificadas com base em perfis de expressão de miRNA [27]. Dado que tais diferenças de assinaturas de miARN, subconjuntos específicos de miARN pode ser identificados como potenciais marcadores de prognóstico e de previsão para a progressão da doença e do tratamento, respectivamente. Como um exemplo, elevada expressão de miR-155 foi encontrado um conjunto de dados na clínica a ser associada com falha do tratamento com R-CHOP [27]. Uma pesquisa sistemática recente de estudos sobre a expressão miRNA em DLBCL identificou um total de 30 miRNAs associados com o desfecho do paciente [28]. Nomeadamente, apenas uma quantidade relativamente pequena de miARNs foram identificadas em diversos estudos independentes, apoiando a noção de que as discrepâncias podem existir devido à complexidade reguladora extrema e a existência de redes não identificados em grande parte de cooperar miARNs. Além disso, tem sido mostrado que o miR-224 pode afectar a eficiência Rituximab através da regulação do gene alvo que codifica CD59, indicando as funções plausíveis de miARN no desenvolvimento da resistência ao rituximab [29]. Um estudo recente sugeriu que o miR-199 e miR-497 causa aumento da sensibilidade à Rituximab e outros quimioterápicos, contribuindo para a sobrevida global melhorou em DLBCL [30].

análises globais de amostras clínicas utilizando tecnologias baseadas em matrizes ou próxima geração seqüenciamento são abordagens poderosas, que levaram à identificação de preditores moleculares, incluindo miRNAs, de sobrevivência DLBCL e prognóstico [31,32]. É essencial, no entanto, para modelar a função de miARN em células-B e criar uma plataforma para o estudo de redes de miARN e a sua importância para a resposta à droga e do desenvolvimento de tolerância à droga potencial. manipulação molecular em células-B é complicada pelo facto de estas células são difíceis de transfectar com DNA plasmídeo e sintetizado ou

In vitro

-transcribed ARN e que a transfecção por tratamento químico ou a electroporação pode ser acompanhada por toxicidade substancial e morte celular. transferência de genes à base de vírus, no entanto, representa uma estratégia alternativa para modelar a função de miARN em células-B. Neste estudo, investigou-se a utilização de estomatite vesicular vírus da glicoproteína G (VSV-G) -pseudotyped vectores lentivirais em células B para estudar o impacto dos miARNs sobre a sensibilidade das células B cancerosas ao rituximab. Notavelmente, mostramos que a transdução de células-B do tipo GCB com vectores lentivirais padrão leva a um aumento da tolerância ao rituximab e que factores anti-apoptóticos são induzidos por tratamento das células com vectores lentivirais. Apesar destes efeitos da transdução lentiviral vector de células B, demonstramos a viabilidade desta plataforma de entrega de genes em estudos que abordam a importância de miRNAs específicos em relação à capacidade de resposta Rituximab.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

Seis linhas celulares DLBCL foram utilizadas para ensaios de dose-resposta. NU-DHL-1 e SU-DHL-5 foram adquiridos de DSMZ (Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares). FARAGE [33], OCI-Ly-7 [34], RIVA [35], e SU-DHL-8 [36] foram gentilmente cedidas pelo Dr. Jose A. Martinez-Climent (Oncologia Molecular Laboratory, da Universidade de Navarra, Pamplona , Espanha). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2. DLBCL linhas foram cultivadas em RPMI1640 (Lonza, Basileia, Suíça) suplementado com 10% de FBS, 1% de glutamina e 1% de penicilina /estreptomicina. As células HEK-293T foram semeadas em DMEM (Lonza, Basileia, Suíça) contendo 5% de FBS e 1% de penicilina /estreptomicina. A identidade das linhas celulares foi verificada por meio de código de barras de DNA, como descrito anteriormente [37].

Vector construção

A miRNA lentivirais expressão vector padrão (PLV /miRCS-PE), carregando um miRNA local de clonagem (miRCS) para inserção de sequências de miARN amplificados por PCR, foi criada por clonagem da cassete de expressão de U1 que contém um sítio de clonagem interno (U1-MCS-U1terminator) no plasmídeo vector lentiviral plv /PGK-eGFP [38], que contém o PGK-eGFP (PE), cassete de expressão. Para permitir a inserção de fragmentos de NotI-digerido a jusante do promotor de U1, um local de restrição foi introduzida BSP120I entre o promotor e o terminador U1 U1. As sequências de ADN genómico que codifica as várias miARNs estudados foram amplificadas por PCR a partir de ADN genómico humano isolado a partir de células HeLa e clonado em BSP120I digerido plv /miRCS-PE. miRNAs estudadas e os iniciadores utilizados para amplificação por PCR são fornecidos na Tabela S1.

Análise da função miRNA

Para estudos funcionais das variantes miRNA clonados, sequências alvo individuais foram fundidas com o gene repórter Rluc por inserção de oligonucleótidos emparelhados que contêm a sequência alvo em NotI /XhoI digerido psiCHECK-2 vector (Promega, Madison, WI, EUA), como descrito anteriormente [39]. Funcionalidade de miARNs clonado foi verificada em células HEK-293T co-transfectadas com o plasmídeo psiCHECK-2-derivado e VLP /plasmídeo miRCS-PE-derivados que codifica o miARN relevante utilizando o ensaio duplo de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo o protocolo do fabricante.

produção lentivírus e transdução

para produzir vetores de lentivírus, as células HEK-293T foram semeadas em 10 ml de DMEM a uma densidade de 4 × 10

6 por 10 cm prato. No dia seguinte, as células foram transfectadas com plasmídeos de embalagem lentiviral (13,0 g pIntg, 3,75 g pMD2G, 3,0 ug pRSV-Rev, e 13,0 ug PLV /miR [número] -PE). O meio foi mudado após 24 horas. 48 horas após a transfecção, o sobrenadante foi recolhido e ultra-centrifugada através de uma almofada de sacarose. O rendimento virai foi avaliada utilizando um kit de ELISA de p24 (XpressBio, Frederick, MD, EUA), e a quantidade de vírus para diferentes preparações de vector foi normalizada com base no nível de proteína p24. células B cancerosas foram semeadas a uma densidade de 3 x 10

4 /ml em 2 ml de RPMI1640. As células foram transduzidas no dia seguinte utilizando quantidades iguais de vírus baseados em medições de p24. A eficácia de transdução foi medida utilizando citometria de fluxo (LSRFortessa, BD Bioscience, San Diego, CA, EUA).

Rituximab ensaio de citotoxicidade

Para investigar os efeitos dos vários miARNs na sensibilidade ao tratamento com rituximab, células transduzidas foram recolhidas, lavadas, e semeadas a 3 x 10

5 /ml em 0,8 ml de RPMI 1640, 72 horas após a transdução. As células foram tratadas no dia seguinte com rituximab a uma dose correspondente ao GI50 de rituximab ou o mesmo volume de tampão de cloreto de sódio. Um volume de 200 ul de soro AB humano reunido (HS) (Innovative Research, Novy, MI, EUA) foi adicionado às placas. Quarenta e oito horas após o tratamento com fármaco, as células foram contadas directamente pelo corante azul de tripano (como viabilidade marcador) método de exclusão utilizando a câmara de Neubauer (0,0025 mm

2) e corado em paralelo com BrdU (BD Bioscience, San Diego, CA , EUA) para medir a taxa de proliferação. Para algumas experiências, as proteínas do complemento foram inactivadas no soro humano (INHS) por aquecimento a 56 ° C durante 30 minutos.

A citometria de fluxo

As células foram recolhidas, lavadas, e coradas durante 30 minutos com solucionáveis ​​próximo ao marcador viabilidade celular IR-mortos (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram então lavadas e fixadas em paraformaldeído a 4% durante 15 minutos e analisadas para a viabilidade e a expressão da GFP. Para CD43 e análise de CD20, as células foram recolhidas, lavadas, e coradas com APC-conjugado anti-CD43 (BD ​​Bioscience, San Diego, CA, EUA) e APC conjugada com anti-CD20 (BD Bioscience, San Diego, CA, EUA) separadamente durante 30 minutos a 4 ° C no escuro e depois fixadas 15 minutos com 4% paraformaldeído. Para medir a taxa de apoptose, as células foram recolhidas, lavadas, permeabilizadas e coradas com conjugado com PE anti-PARP1 Clivadas (BD Bioscience, San Diego, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Para medir a taxa de proliferação, as células foram incubadas com BrdU durante 55 minutos e, em seguida, recolhidas, lavadas duas vezes, e permeabilizadas e coradas com APC-conjugado anti-BrdU (BD Bioscience, San Diego, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Quantificação de GFP, viabilidade, as células CD43 e expressão de CD20, PARP1 clivado, e BrdU-positivas foi avaliado com um citómetro de fluxo (LSRFortessa, BD Bioscience, San Diego, CA, EUA) e os dados analisados ​​utilizando o software FlowJo_V10.

A quantificação dos níveis de ARNm por qPCR

As células foram colhidas, lavadas, lisadas e 48 horas após o tratamento com rituximab. O RNA total foi purificado utilizando um estojo de isolamento miRvana miARN (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) de acordo com o protocolo do fabricante. A expressão de CD43 foi medida por iniciadores e sonda (Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante utilizando luz Cycler 480 (Roche, Basileia, Suíça). O nível de expressão foi normalizado para a expressão de RPLP0.

testes t de análise estatística

Estudante (duas caudas) pareados e não pareados foram realizadas. Todos os experimentos incluindo ensaios de drogas e análise de expressão gênica e protéica foram realizadas três vezes em triplicado biológicos.

Resultados

transdução lentiviral eficiente de células B de GCB- e ABC-como origem

para investigar os efeitos da expressão de miARN sobre a resposta o rituximab em linhas celulares DLBCL difíceis de transfectar, primeiro gerada uma construção de vector lentiviral, PLV /miRCS-PE, com duas cassetes de expressão permitindo a expressão simultânea de (i) um miARN de interesse expressa a partir do promotor pequena U1 humano ARN nuclear (snRNA) e (ii) o gene repórter eGFP accionado por um fosfoglicerato quinase (PGK) (Figura 1a). Usando a expressão de eGFP como um marcador para a entrega de genes bem sucedida, determinou-se a taxa de transdução de LV upconcentrated /miRCS-PE num total de seis linhas de células B cancerosas de origem DLBCL. Duas destas linhas celulares foram refractário para a transdução de vectores lentivirais de VSV-G pseudotipado, mas as restantes linhas celulares apresentaram níveis consistentes de transdução de lentivírus (Figura S1a). Além disso, a viabilidade das células após a transdução foi perto de 100% para todas as linhas celulares (Fig S1b). Com base neste rastreio de linhas celulares que eram suscetíveis a transdução lentiviral, nós nos concentramos em duas linhas de células de GCB-like OCI-LY-7 e SU-DHL-5 e os dois ABC-como linhas celulares Riva e do NU-DHL- 1. Conforme determinado por análise de citometria de fluxo, estas quatro linhas de células B foram todas positivas para a expressão de CD20 na superfície celular (Fig S2). Para estas linhas de células, foram realizadas experiências de transdução adicionais e confirmou eficaz de entrega de genes por microscopia de fluorescência (Figura 1b). Assim, os níveis de transdução determinada por citometria de fluxo variaram de 57 ± 3% em células Riva 78 ± 2,5% no SU-DHL-5 (células perfis de expressão representativa apresentados na figura 1C). Deve também notar-se que a morfologia destas quatro linhas de células diferem de um modo que era independente do tratamento lentiviral. Assim, ambas as células OCI-Ly-7 e SU-DHL-5 formado grupos de células com agregados de células maiores, especialmente evidente no OCI-Ly-7 culturas, enquanto que nem Riva nem NU-DHL-1 células mostraram qualquer tendência a se agrupar.

(a) um vector lentiviral, PLV /miR-PE foi construído para expressar simultaneamente um miARN específico (a partir de um promotor U1) e eGFP (a partir de um promotor de PGK). A caixa roxa (marcado ‘T’) indica a sequência de terminação U1 que termina a transcrição de miRNAs inserido no local BSP120I. caixas cinzentas claras ilustram elementos (R, U5, e ΔU3) das repetições terminais longas do vector lentiviral. CMV (seta luz cinzento) indica que o promotor utilizado para conduzir a expressão do ARN de vector em células produtoras de vector. eficiência de transdução do vector foi analisada por (b) A microscopia de fluorescência e (c) análise de citometria de fluxo em diferentes linhas de células B cancerosas. A escala das imagens do microscópio é indicado pela barra vermelha que representa um comprimento de 0,1 mm em todas as imagens.

O aumento da tolerância ao Rituximab em células GCB-like tratado com vetores de lentivírus

com o objectivo de explorar a entrega lentiviral em estudos de tolerância Rituximab em células B, partimos primeiro a identificar os efeitos celulares de transdução de vector lentiviral. Em uma resposta do ensaio padrão do fármaco (DRA) (configuração experimental representado na S3 figura), expôs-se células transduzidas ao rituximab na presença de soro humano (HS) 72 horas após transdução com LV /miRCS-PE e medido o efeito do tratamento com rituximab depois de mais 48 horas, contando o número de células ou a analisar marcação com BrdU, como uma medida da proliferação celular. Inicialmente, as células OCI-LY-7 e Riva foram tratados com doses crescentes de rituximab, correspondendo a GI50 (a concentração de droga que provoca 50% de inibição de crescimento celular), TGI (a concentração de droga que causa a inibição total do crescimento), e 2 × TGI.

para as células OCI-LY-7 observa-se que as células transduzidas com o vector de expressão padrão, LV /miRCS-PE, mostrou um aumento da resistência a todas as doses de rituximab (como determinado por ensaios de contagem de células e proliferação de BrdU) em relação a células que não foram tratados com um vector lentiviral (Fig 2A e 2B, painéis esquerdos). Tal melhoria da tolerância não podia ser identificada em células transduzidas Riva (Fig 2A e 2B, painéis direitos). Tratamento dos dois tipos de células com a doxorrubicina não revelou quaisquer efeitos sobre a tolerância à droga após a transdução de lentivírus (Figura 2c e Fig S4a), sugerindo que a tolerância induzida em células OCI-LY-7 era específico para o rituximab. Usando uma concentração Rituximab correspondente ao GI50, realizamos estudos de tolerância rituximab em todas as quatro linhas celulares (OCL-LY-7, SU-DHL-5, a Riva, e NU-DHL-1 células) e encontrou os mesmos efeitos da transdução com VE /miRCS-PE em duas linhas celulares de GCB semelhante, ao passo que a tolerância ao rituximab foi afectada nas duas linhas celulares ABC-like (Figura 2d e S4B figura), sugerindo que a tolerância induzida era específico para GCB-como célula DLBCL linhas. Em paralelo, a contagem de células direta de transduzidas-5 SU-DHL células OCL-LY-7 e mostraram uma diminuição na taxa de proliferação (Fig 2e), que foi apoiado por análise da incorporação de BrdU (S4C Fig), ilustrando que a tolerância Rituximab foi não é um resultado do aumento da proliferação celular nas células transduzidas lentivirally.

as células foram tratadas com rituximab (RTX) 72 horas após a transdução de vector lentiviral. A proliferação celular foi medida 48 horas após o tratamento com rituximab usando (a) Coloração com azul de tripano e contagem celular directa e (b) ensaio de BrdU e análise de citometria de fluxo. (C) Ausência de efeito de doxorubicina, como mostrado pela medição da proliferação das células 48 horas após o tratamento com a droga. (D) aumento Lentivírus mediada de tolerância ao rituximab em linhas celulares de GCB-Como DLBCL (OCI-LY-7, SU-DHL-5), mas não em células ABC-like. (E) Redução da proliferação de células em OCI-LY-7 e SU-DHL-5 células tratadas com vectores lentivirais. Os números de células foram determinadas após 96 horas de incubação. NTC, células nontranduced; LVTC, as células transduzidas por vectores lentivirais. Os asteriscos indicam nível de significância da seguinte forma: *:

p

value≤0.05, **:

p

value≤0.01, ***:

p

value≤0.001.

Lentivirus tolerância Rituximab induzida pelo vector não envolve a lise celular mediada pelo complemento

para investigar o papel da lise celular mediada pelo complemento para o aumento da tolerância Rituximab em GCB-like lentivirally transduzidas células, foi analisada a resposta a doses de rituximab GI50 na presença de HS e soro humano inactivado pelo complemento (INHS). Nós, as células cultivadas primeira OCI-Ly-7 e Riva transduzidas com LV /miRCS-PE na presença de INHS e HS. Para OCI-LY-7 células, verificou-se a tolerância reduzida ao rituximab na presença de complemento (células cultivadas com HS) relativamente às células crescidas na ausência de complemento (células cultivadas com INHS), conforme medido por contagem de células (Figura 3a, painel da esquerda). Em contraste, a resposta ao Rituximab não foi afectada pelo complemento em células Riva (Fig 3a, painel da direita). Estes resultados foram apoiados por medição da incorporação de BrdU (fig S5a). Assim, a morte celular induzida por tratamento com rituximab de OCI-LY-7 ocorreu parcialmente através de mecanismos que envolvem citotoxicidade dependente do complemento (CDC).

(a) aumento da tolerância ao rituximab (RTX) em células de GCB-semelhantes na presença do complemento em relação a células crescidas na ausência de complemento. O tratamento de células com soro humano inactivado pelo calor (INHS) mostraram que o efeito apoptótico do Rituximab foi independente do sistema do complemento em Riva (ABC-like), mas não em células OCI-LY-7 células (GCB-like). (B) taxa de sobrevivência relativa das células tratadas com Rituximab cultivadas em soro humano (HS) e INHS não diferiu entre as células nontransduced e lentivirally transduzidas. O número de OCI-LY-7 e SU-DHL-5 células foi determinado com e sem transdução lentiviral na ausência ou na presença de complemento activo. Para ambas as linhas celulares GCB-like (OCI-LY-7, SU-DHL-5) o aumento relativo da tolerância Rituximab foi semelhante nos grupos NTC e LVTC, mostrando que os efeitos protetores da transdução lentiviral não envolve efeitos no CDC. cinzento claro e colunas tracejadas representam o número de células medido na presença de HS e na presença de INHS, respectivamente. O número absoluto das células foi quantificada pelo método de exclusão de corante azul de tripano após o tratamento com Rituximab e normalizada para o número de células não tratadas. O número relativo de células foi utilizada como um índice de inibição de crescimento que mostra a proporção de células tratadas em relação ao controlo não tratado.

próxima estabelecido para testar se o efeito protector de transdução de lentivírus em GCB semelhante efeitos sobre células CDC envolvido. Para este fim, o número de OCI-LY-7 e SU-DHL-5 células foi determinado com e sem transdução lentiviral na ausência ou na presença de complemento activo. Para ambas as linhas celulares, observou-se um aumento da tolerância ao rituximab de células tratadas com vectores lentivirais independentes da presença de complemento. Assim, a taxa de sobrevivência relativa de células tratadas com Rituximab cultivadas em HS e INHS não diferiu entre as células nontransduced e lentivirally transduzidas (Fig 3b), o que foi confirmado por medições incorporação de BrdU (S5b FIG). Isto apoia a noção de que os efeitos protetores da transdução lentiviral não envolvem a lise celular mediada pelo complemento.

transdução de vector de Lentivirus induz efeitos anti-apoptóticos em células GCB-like

A seguir, abordados se os efeitos protetores da transdução lentiviral foram associados com uma resposta apoptótica alterada. Usando PARP1 clivado como uma medida da taxa de apoptose, verificou-se que o número de células apoptóticas Parp1-positiva clivados na ausência de Rituximab e HS diminuiu de 1,4 ± 0,15% em células nontransduced a 0,7 ± 0,1% no OCI-LY-7 as células que foram transduzidas com o vector lentiviral (Fig 4A). Este efeito anti-apoptótico de transdução de lentivírus foi significativo também no OCI-LY-7 e SU-DHL-5 células tratadas com rituximab (Figura 4b), o que demonstra que as vias de morte celular foram afectadas durante a entrega do vetor lentiviral. Notavelmente, no entanto, foram testadas as capacidades anti-apoptóticos de transdução de lentivírus em resposta a uma série de estímulos indutores de apoptose (actinomicina D, camptotecina, ciclo-hexamida, dexametasona, e etoposide) e encontrou o número de células aumentou apenas em transduzidas OCI-LY-7 expostos ao rituximab (Fig 4C), sugerindo que os efeitos anti-apoptóticos observados eram específicos para o rituximab. Em resumo, a transdução lentiviral interfere com os mecanismos de apoptose que são especificamente desencadeadas por Rituximab.

(a) Redução da taxa de apoptose em lentivirally transduzidas versus não transduzidas células OCI-LY-7. (B) Redução do nível de apoptose em células em relação a células transduzidas nontransduced expostas ao rituximab durante 48 horas. (C) Análise de capacidades potenciais anti-apoptóticos de transdução de lentivírus em resposta a uma série de estímulos indutores de apoptose, incluindo Rituximab (RTX) em células OCI-LY-7. O número relativo de células foi utilizada como um índice de inibição de crescimento que mostra a proporção de células tratadas em relação ao controlo não tratado.

expressão persistente de CD43 em células de GCB-lentivirally como transduzidas tratados com rituximab

a perda de expressão da proteína de superfície CD43, expressa principalmente em linfócitos, está associada com as fases iniciais de apoptose em células polimorfonucleares [40]. A redução do nível de CD43 pode, portanto, servir como um marcador de células submetidas a passos iniciais de apoptose. Em conformidade, uma população de OCI-LY-7 células submetidas a rituximab, apresentaram níveis aumentados de PARP1 clivado em células com níveis mais baixos de CD43, enquanto que as células com maior expressão da CD43 tinham níveis mais baixos de PARP1 clivados (figura 5a). Assim, as células com um perfil de expressão de CD43 mostrou menor nível mais elevado de apoptose. Curiosamente, observou-se que o (clivada PARP1) a taxa de apoptose em células de baixa expressando CD43 (definido pela relação entre P3 e P4 na Figura 5a) foi idêntica para os dois grupos (0,18 para ambos NTC e LVTC), demonstrando um nível constante de apoptose em células com baixa expressão de CD43. As células transduzidas com vectores lentivirais foram predominantemente positivo para CD43 e a taxa de apoptose, medido por células com expressão de CD43 perdido ou aumento dos níveis de PARP1 clivada, foi marcadamente reduzida (Figura 5A e 5B). Em seguida, seguiu a expressão de CD43 em células OCI-LY-7 ao longo do tempo após o tratamento com rituximab e mostrou uma perda gradual de expressão CD43 em células não transduzidas. No entanto, as células que foram transduzidas com vectores lentivirais foram capazes de resistir à perda da expressão do CD43, como mostrado por citometria de fluxo (Figura 5c) e confirmado a nível de ARN por qPCR 48 horas após o tratamento com rituximab (Figura 5D). Em conclusão, estes resultados sugerem que os efeitos anti-apoptóticos contribuem para o aumento da tolerância ao rituximab de células transduzidas lentivirally.

(a) Redução da apoptose em transduzidas OCI-LY-7 células 8 horas após o tratamento com rituximab, tal como medido pela análise da expressão CD43 e PARP1 clivada no NTC e LVTC. (B) redução da expressão de CD43 em células OCI-LY-7 48 horas depois do tratamento com rituximab. O histograma ilustra o número de células CD43-positivas em células nontransduced (NTC), em células transduzidas lentivirally (LVTC), e numa linha celular de controlo negativo. (C) A perda de CD43 em resposta ao tratamento com rituximab é bloqueado por transdução de células de lentivírus OCI-LY-7. (D) A confirmação dos níveis de expressão CD43 mantidos em células transduzidas com vectores lentivirais e subsequentemente sujeito ao rituximab. Análise da expressão do gene CD43 foi realizada utilizando qPCR em RNA total isolado de NTC e LVTC.

Exploração de transdução lentiviral para a análise do impacto dos miRNAs na tolerância Rituximab

lentivirais são ferramentas exclusivas para a entrega de genes de forma eficaz em células B e, portanto, também atraente, em estudos de função de miRNA. No entanto, considerando o efeito de transdução de lentivírus em morte celular e a tolerância de células GCB semelhante ao rituximab, não era claro se o efeito da ferramenta de distribuição própria iria interferir com os estudos de genes, incluindo genes de miARN-codificam, que afecta a tolerância aos a droga.