Abstract
Os efeitos da Como
4O
6 como adjuvante na terapia fotodinâmica (PDT) foram estudadas. Como
4O
6 é considerado como tendo actividade anti-cancerígena através de várias acções biológicas, tais como a produção de radicais livres e a inibição da expressão de VEGF. PDT ou A
4O proliferação de células
6 inibiu significativamente TC-1 de um modo dependente da dose (
P
0,05) pelo teste de MTT. O efeito anti-proliferativo do tratamento de combinação foi significativamente maior do que nas células TC-1 tratadas com a terapia fotodinâmica ou A
4O
6 isolada (62,4 e 52,5% de redução em comparação com as células CT-1 veículo somente tratados , respectivamente,
P Art 0,05). Além disso, a proliferação celular em combinação com terapia fotodinâmica e A
4O
6 tratamento significativamente diminuído por 77,4% (
P
0,05). via de sobrevivência celular (
Naip1, terc
e
AIP1
) e via dependente de p53 (
Bax, p21
Cip1, Fas, GADD45, IGFBP-3 Comprar e
MDM2
) foram significativamente aumentada pelo tratamento de combinação de terapia fotodinâmica e Como
4O
6. Além disso, a resposta imunitária na via pura (
Ly-12, e CD178
IL-2
) também foi modulada após tratamento de combinação, sugerindo melhora os efeitos anti-tumorais, controlando o crescimento indesejado-estimuladoras vias. O efeito da combinação aparentemente refletida concordância com os dados in vitro, em restringir o crescimento do tumor
in vivo
e em relação a algumas vias de sinalização comum aos observados
in vitro
. Estes achados sugerem o benefício do tratamento combinatório com a terapia fotodinâmica e Como
4O
6 para inibição do crescimento de células de câncer cervical
Citation:. Kim YW, Bae SM, Battogtokh G, a Bang HJ, Ahn WS (2012) sinérgica anti-tumoral Efeitos de Combinação de Terapia fotodinâmica e arsênico Composto nas células cancerosas do colo do útero: in vivo e in vitro. PLoS ONE 7 (6): e38583. doi: 10.1371 /journal.pone.0038583
editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América
Recebido: 19 de dezembro de 2011; Aceito: 07 de maio de 2012; Publicação: 08 de junho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O estudo foi apoiado pelo Católica Harvard Wellman Photomedicine Núcleo técnica Development Center, Seul, República da Coreia (Grant # 5-2012-A0154-00001). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a terapia fotodinâmica (PDT) envolve a combinação de corantes não-tóxicos conhecidos como fotossensibilizadores (PSS) e a luz visível de comprimento de onda correcto para ser absorvido pelo PSs. Na presença de oxigénio, isto conduz à geração de espécies de oxigénio reactivas (ROS) que podem danificar os constituintes celulares, conduzindo à morte das células [1], [2]. A descoberta de morte celular programada, ou apoptose, revolucionou o campo da terapia citotóxica, em geral, e em particular PDT [3] – [5]. No entanto, uma erradicação completa das células tumorais por PDT sozinho não tem sido garantida [6]. . Um estudo adicional de controlar vias de crescimento-estimuladores indesejados após a TFD é desejável para minimizar o risco de efeitos adversos prejudiciais
ARSENICAL compostos têm demonstrado possuir qualidades de preservação da vida no tratamento do cancro [7] – [10]. resultados promissores foram reportados, que mostra que o óxido diarsenic (A
3 2O) tratamento poderia oferecer uma alternativa à quimioterapia para a leucemia promielocítica aguda (APL). citopatológico estudos também mostraram indução de apoptose em células de APL. Relatórios recentes sugeriram que os compostos arsenicais inibir a proliferação de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) através de G1 e G2 /paragem fase M do ciclo celular [8]. Além disso, os efeitos inibidores sobre a bFGF ou proliferação celular estimulada por VEGF sugere o potencial anti-angiogénico de compostos arsenicais [11]. Além disso, o óxido de tetra-arsênio (As
4O
6) foi relatado para ter efeitos anti-angiogénicos sobre a formação induzida por NGF de novos vasos na córnea de rato, comparado ao grupo controle e Como
2O
3 grupo tratado [9]. Assim, tem sido sugerido que A
4O
6 pode ser um novo composto de arsénio, uma vez que induziu a apoptose em células cancerosas em concentração muito mais baixa do que A
2O
3 [10]. Os compostos de arsénio pode aumentar espécies reactivas de oxigénio (ROS) em células e, assim, aumentar a secreção de apoptose factor indutor (AIF) através da ativação de PARP-1, e, finalmente, induzir a apoptose celular. A libertação de citocromo c e factor indutor da apoptose (AIF) é sintonizado por proteínas da família Bcl-2 em qualquer uma das duas maneiras seguintes: de acordo com um mecanismo possível, Bax presente no citoplasma é translocada para a membrana mitocondrial, onde sofre mudanças de conformação assistidos por Bid. A ligação de Bax para a membrana exterior (OM) faz com que a sua
in situ
multimerização, pelo qual PTP é fechado e citocromo c é liberado. Bcl-2 e Bcl-xL inibir alterações conformacionais em Bax e, portanto, inibem a libertação de citocromo c e apoptose. Alto nível de produção de ROS é a principal causa da apoptose pelo composto arsênico. Como radicais livres, ROS pode reagir com a maioria das macromoléculas biológicas, e, portanto, não só pode induzir danos oxidativos no DNA, mas também alterar a estrutura e função da proteína [12] – [14].
Por outro lado, ROS podem modular a expressão genética, agindo como um segundo mensageiro. Vários estudos têm sugerido que o dano oxidativo pode estar envolvido na iniciação eventos no cancro, e pode ajudar a induzir a iniciação de apoptose depois de um aumento na proliferação de células [15], [16]. composto de arsénio também poderia supostamente regular a resposta imune a envolver função anti-cancro, através da diminuição da expressão de VEGF [12] – [14]
Neste estudo, mostrou que em primeiro lugar o efeito anti-tumoral melhorado de PDT. usando Radachlorin com a
4O
6 em ratinhos portadores de tumores causados pelo vírus do papiloma humano (HPV) 16 E6 /E7 oncogene expressa TC-1 células tumorais. O presente estudo mostrou que a terapia de combinação de PDT Plus como
4O
6 foi muito mais eficaz na supressão do crescimento do tumor, em comparação com PDT ou Como
4O
6 sozinho.
resultados
em efeito inibidor do crescimento celular in vitro de Como
4O
6 mais Radachlorin /PDT em células TC-1 |
Para ver o efeito de inibição do crescimento do PDT na TC -1 célula, a luz de 6.25J /cm
2 foi exposta às 12 h após o tratamento Radachlorin nas células, e, em seguida, o crescimento celular foi medido durante um tempo predeterminado. A viabilidade das células tratadas com várias doses de Radachlorin seguido de irradiação de luz foi reduzida de uma forma dependente da dose em comparação com o controlo, respectivamente (Figura 1A). Para ver o efeito de inibição do crescimento de A
4O
6 em TC-1 de células, o crescimento celular foi medido durante um tempo predeterminado depois de A
4O
6 tratamento. A viabilidade das células tratadas com várias doses de A
4O
6 foi reduzido de uma maneira dependente da dose em comparação com o controlo, respectivamente (Figura 1B). Utilizando estes dados, a viabilidade das células foi determinado após o tratamento das células de cultura de CT-1 com 3 uM de A
4O
6 e diferentes doses de Radachlorin /PDT por dia. O tratamento de combinação apresentaram efeito sinérgico, diminuindo a viabilidade de uma forma dependente da dose, em comparação com o controlo, como mostrado na Figura 1C. A viabilidade celular foi encontrado para ser 62,4% para PDT sozinho e 52,5% após Como
4O
6 sozinho tratamento com uma dose baixa. Em contraste, após a TFD mais Como
4O
6 de tratamento, a percentagem de crescimento celular foi observada menos de 23%. Observou-se também o efeito combinado versus doses individuais ao longo do tempo para elucidar se a abordagem combinatória pode resultar em restrições de vida mais longa da proliferação celular em comparação com terapias individuais (Figura 2). A viabilidade celular foi encontrado para ser inferior a 10% para 0,2 ug /ml de Radachlorin /PDT Plus como
4O
6 tratamento durante três dias, quando comparado com o tratamento individual. Para a avaliação do sinergismo entre Radachlorin /PDT e Como
4O
6 tratamento, foi utilizado um índice de combinação que o calculado pelo método de Chou e Talalay (Tabela 1). Entre as várias combinações de tratamento, 0,2 ug /ml Radachlorin /PDT e 3 uM de A
4O
6 no dia 3 e 4 conduziu à maior taxa de morte celular e mostrou-se sinergismo. Mais algumas linhas de células, tais como HaCaT, HeLa, e células SiHa foram incluídos para avaliar a inibição do crescimento celular (Figura Suplemento S1). Embora os resultados de HaCaT e SiHa foram consistentes com estimativas anteriores do ensaio de MTT, HeLa mostraram Radachlorine /tendência resistente PDT em comparação com as outras células. A viabilidade das células da linha de células duas verificou-se ser inferior a 25% para 0,15 ug /ml de Radachlorin /PDT Plus como
4O
6 tratamento durante quatro dias, em comparação com o tratamento individual. Nós caracterizado morte celular por coloração das células TC-1 tratadas com 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT e /ou 3 uM de A
4O
6 durante 1 dia. Como esperado, o efeito do tratamento de combinação foi maior do que cada tratamento único. Na ausência de Radachlorin /ou PDT Como
4O
6, as células alcançaram uma monocamada confluente completamente densa, após 48 h de cultivo (Figura 1D). As células permaneceram ligados ao substrato de cultura de tecidos e que adoptada uma morfologia alongada. Em contraste, a maioria das células tratadas com Radachlorin /PDT Plus como
4O
6 foi isolada a partir da placa e foi arredondado; característica de células que sofrem morte por apoptose. As células tratadas com Radachlorin /PDT ou Como
4O
6, no entanto, adoptado morfologias que eram de natureza intermediária. Contamos diferentes populações de células apoptóticas induzidas por 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT e /ou 3 uM de A
4O
6 durante 1 dia. Como mostrado na Figura Suplemento S2, a morte celular aumentou significativamente após Radachlorin /PDT Plus como
4O
6 tratamento. No início população apoptótica foi de 9,9% em Radachlorin /PDT Plus como
4O
6 tratamento. Em contraste, as populações de células em apoptose precoce foram de 4,3% e 4,1% em Radachlorin /PDT e A
4O
6 de tratamento, respectivamente. Isto mostra que o tratamento de combinação induziu células apoptóticas mais cedo em comparação com terapias individuais.
(A) células TC-1 (3 × 10
3) foram cultivadas em placas de 12 poços, em triplicado, durante a noite e tratada com diferentes concentrações de Radachlorin e PDT (6,25 J /cm
2), tal como descrito em Materiais e Métodos. Depois de PDT, as células foram cultivadas durante um tempo predeterminado. efeitos (B) inibição do crescimento celular de A
4O
6 em células TC-1. as células CT-1 foram cultivadas e tratadas tal como descrito em Materiais e Métodos. Depois Como
4O
6 de tratamento, as células foram cultivadas durante um tempo predeterminado. A viabilidade celular foi determinada com base no ensaio com MTT. (C)
In vitro de crescimento celular
efeitos inibitórios de Como
4O
6 mais Radachlorin /PDT em células TC-1. as células CT-1 foram cultivadas com 3 uM de A
4O
6 e diferentes doses de Radachlorin /PDT durante 1 dia, tal como descrito acima. A viabilidade celular foi determinada com base no ensaio com MTT. Cada barra representa a média [± DP (linha vertical)] de três réplicas por dose (
N
= 3). * E #: significativamente diferente (
P Art 0,05) do controle e do PDT por t-teste do estudante. (D) As alterações morfológicas de células TC-1. as células CT-1 foram tratados com 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT e /ou 3 uM de A
4O
6 durante 1 dia. As células foram então visto ao microscópio. Fotos foram tiradas com microscopia de contraste de fase no X300. (A) não tratados; (B) 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT só; (C) 3 UM como
4O
6 sozinho; (D) 3 UM como
4O
6 mais 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT.
TC-1 células foram cultivadas com 3 uM de Como
4O
e 6 (A) 0,15 ug /ml e (B) 0,2 ng /ml de Radachlorin /PDT, respectivamente. A viabilidade celular foi determinada com base no ensaio com MTT. Cada barra representa a média [± DP (linha vertical)] de três repetições (n = 3). * E #:. Significativamente diferentes (P 0,05) do controle e do PDT por t-teste do estudante
perfil de células TC-1 tratadas com Como
A expressão gênica
4O
6 mais Radachlorin /PDT
Foi utilizado RT
2 Profiler PCR matriz do sistema para entender as mudanças de processos celulares através do qual as células TC-1 poderiam ser influenciadas pelo tratamento combinado com Como
4O
6 mais Radachlorin /PDT. Encontrámos 63 genes que foram, pelo menos, duas vezes o aumento ou regulados negativamente (cada gene está detalhado na Tabela 2) e utilizadas agrupamento hierárquico para mostrar os genes diferencialmente expressos (Figura 3A). Para detectar as diferenças nos perfis funcionais, que colocado genes diferencialmente expressos no contexto do conhecimento interactoma presente, utilizando as ferramentas de análise Ingenuity Pathways (
P
para todos 0,05), mostrando que a inibição do crescimento celular aumentada e efeitos anti-tumorais foram significativamente relacionada com os níveis de genes relacionados com a morte celular, isto é, p53 e NFAT via (Figura 3B) de expressão de genes. Cada gene na via foi testado por PCR quantitativa (Figura 4) e os resultados da matriz de PCR e qRT-PCR foram semelhantes. Estes genes codificam para Terc incluídos, AIP1, Bax, p21, Fas, GADD45, IGFBP-3, MDM-2, Ly-12, e IL-2, em comparação com expressa ligeiramente genes tais como Naip1 e CD178. funções moleculares significativamente up-regulamentados para o grupo de tratamento de combinação foi via p53. A função molecular regulamentada-down foi via NEAT. MAPK, interacção com o receptor de citocina por citoquina, de adesão focal, vias de adesão de células também foram estudadas nos conjuntos de genes, mas não estritamente correlacionada com a inibição do crescimento celular aumentada (
P
para todos 0,05) (Figura 3C- F).
(a) Todos os dados foram mediana centrado e agrupados usando um agrupamento hierárquico. A imagem Conjunto representando 63 dos genes é mostrado no formato de matriz, onde as linhas representam genes individuais e as colunas representam cada ensaio. Cada célula na matriz representa o nível de expressão de um gene em um ensaio individual. células vermelhas e verdes refletem os níveis de expressão de alto e baixo, respectivamente. (B) Dez genes (p53 e caminhos puro) mostrando diferenças estatisticamente significativas nos três grupos são mostrados como uma imagem de cluster. (C) MAPK via como uma imagem de cluster. (D) via a interacção receptor de citocina por citoquinas. (E) circuito de adesão focal. (M) via de adesão celular.
Os resultados estão apresentados como os níveis de transcritos em relação ao nível em células de controlo não tratadas, utilizando o método de CT, com o nível de ARNm de média de cinco genes de controlo interno, incluindo B- actina, usado como o controlo de normalização. (A) percurso de sobrevivência celular. (B) via NEAT. (C) via p53.
As
4O
6 mais Radachlorin /PDT suprime o crescimento tumoral em modelo animal TC-1 |
Para determinar a sinérgica efeitos antitumorais de Como
4O
6 mais Radachlorin /PDT
in vivo sc
, camundongos C57BL /6 foram desafiados com o CT-1 de células e depois tratada com A
4O
6 ou /e Radachlorin /PDT. O tratamento foi iniciado no dia 0 quando os tumores tinham ~230 mm
3 em tamanho. Como mostrado na Figura 5A, como
4O
6 ou Radachlorin /PDT tratados grupos de animais mostrou supressão significativa do crescimento do tumor, em comparação com o grupo de controlo não tratado. No entanto, os animais tratados com a combinação de A
4O
6 mais Radachlorin /TFD mostrou a supressão tumoral mais significativa, em comparação com os outros grupos. Isto sugeriu que A
4O
6 pode desempenhar um papel importante na inibição do crescimento por Radachlorin /PDT.
(A) curvas de crescimento de tumor para TC-1 de ratinhos tratados com Radachlorin /e PDT /ou a
4O
6 (n = 7 para cada grupo). ratinhos portadores de tumor foram injectados intravenosamente Radachlorin (10 mg /kg p.c.) e /ou injecções peritoniais de 7,5 mg /kg de A
4O
6. Três horas mais tarde, as células foram expostas ao laser, o tamanho do tumor foi monitorizado em seguida, como descrito em Materiais e Métodos, e o seu volume elipsóide significativo foi representada graficamente ao longo do tempo. inibição significativa do crescimento do tumor foi detectado por análise de variância. *:
P Art 0,01, em comparação com o grupo controle, #:
P Art 0,01, em comparação ao grupo com apenas Radachlorin /PDT e US $:
P
0,01, em comparação com o
4O
6 só grupo como. (B) de perfusão e alterações morfológicas em TC-1 em tumores de ratinhos C57BL /6 tratados com A
4O
6 (10 mg /kg p.c., i.p.). Os tecidos tumorais foram colhidas após 48 h após Conforme
4O
6 tratamento. De tecido foram vistos em um comprimento de onda de 365 nm e fotografada com uma ampliação de 200x. (C) a área por cento da área de perfusão de TC-1 em tumores de ratinhos C57BL /6 tratados com A
4O
6 em comparação com tumores não tratados. Os tecidos tumorais foram colhidas nos tempos indicados após Conforme
4O
6 tratamento. Alterações sequenciais de áreas perfundido a 1, 3, 6, 12, 24, e 48 h após Como
4O
6 tratamento. *
P Art 0,05, em comparação com os controles não tratados. (D) secções de tumor imunocoradas-CD31 (ampliação original, x400) e Como
seções tratados com 6 4O
são exibidos. Vinte e quatro horas depois de Como
4O
6 tratamento, TC-1 tumores mostrou extensa perda de coloração CD31 indicativo de dano vascular induzida por As4O6 significativo.
Efeito do tratamento de arsénio na região perfusão do sangue no tecido de tumor foi usado
Hoechst 33342 para visualizar os vasos perfundidas tal como descrito em materiais e métodos. Em tecido de controlo, as células endoteliais vasculares foram claramente corados pela Hoechst 33342, tanto a sua aresta exterior e região central (Figura 5B). tecido tratado foi descorado central e o sinal periferia florescimento era quase indetectável. Este fenómeno continua até ao ponto 24 h. No entanto, a fluorescência na periferia das células foi claramente evidentes às 48 h pós-tratamento, enquanto que a coloração central ainda permaneceu ausente. A fim de observar as mudanças de função dos vasos no tumor inteiro, seção de tumor foram campo digitalizado pelo campo. As alterações sequenciais da área após perfusão Como
4O
6 tratamento são mostrados na Figura 5C. Em cada ponto de tempo, a percentagem de cada secção de campo do tumor era comparável ao controlo de tecido em cada ponto de tempo. A área de perfusão foi reduzida imediatamente após a A
4O
6 tratamento. Às 6 e 12 h, a área da perfusão foi o mínimo, às 24 h área de perfusão foi de 14,4% em comparação com o tecido tratado com PBS a partir de tecido de controlo. dimensões densidade de microvasos de tumor foram medidas após a administração de A
4O
6 para ratinhos portadores de TC-1 xenoenxertos de tumor. Tal como mostrado na Figura 5D, não havia uma diferença significativa na densidade de vasos tumorais, como detectado por coloração com CD31 entre o A
4O grupo
6-tratados e o grupo de controlo tratado com PBS combinado de tempo após 24 h de Como
4O
6 tratamento. Os ratinhos tratados com A
4O
6 tinham uma redução nas dimensões dos vasos tumorais em comparação com os animais de controlo, com CD31 coradas microvasos ainda ser aparente na borda exterior do tumor.
in vivo a expressão génica níveis de tecidos de tumor tratados com a
4O
6 mais Radachlorin /PDT
TC-1 foram tratados com células como
4O
6 e Radachlorin /PDT durante 1 dia, a partir indicados na secção “Materiais e Métodos”. A expressão de genes de ARNm em tecidos de tumor foi examinado por qRT-PCR (Figura 6A). Os resultados estão apresentados como os níveis de transcritos em relação ao nível em células de controlo não tratadas, utilizando o método de CT, e os níveis de ARNm de b-actina foram utilizadas como o controlo de normalização. Usando o antigénio CD5 no grupo de terapia de combinação, Ly-12 e IL-2 de expressão do gene aumentou 26 e 17 vezes, respectivamente, em comparação com o grupo de controlo, mostrando que p53 estava envolvida na regulação da via de NFAT de p21, GADD45, IGFBP-3 , MDM-2 e de outros genes. a expressão do gene foi encontrado aumento em três experimentos consecutivos. Para determinar os papéis de vias de sinalização p53 nos efeitos antitumorais sinérgicos de Como
4O
6 mais /PDT
In vivo
, investigamos ainda mais as p53, p21, e os níveis de proteína GADD45 Radachlorin in vivo (Figura 6B). Como tratado
4O
6 ou Radachlorin /PDT grupos animais não apresentaram alterações expressão significativa, em comparação com o grupo de controlo não tratado. Em contrapartida, p53, p21, e a proteína GADD45 foram significativamente aumentada no tratamento de combinação com A
4O
6 mais Radachlorin /PDT.
(A) A expressão de genes de mRNA em tecidos tumorais foi examinados por Q-PCR. Os resultados estão apresentados como os níveis de transcritos em relação ao nível em células de controlo não tratadas, utilizando o método de CT, com os níveis de ARNm de b-actina utilizada como o controlo de normalização. (B) Análise de Western blot de in vivo tecidos tumorais tratadas com 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT e /ou 3 uM de Como
4O
6 por vários dias.
Discussão
neste estudo, comparativamente analisados de tratamento único de Como
4O
6 ou grupos de terapia fotodinâmica com aqueles obtidos pela co-tratamento utilizando E6 /E7 expressar-1 TC linha celular e C57BL /6 modelo de ratinho transplantado com este celular. Nós finalmente relatar a inibição e antitumorais efeitos avançados de crescimento celular e alterações nos níveis de genes relacionados com a morte celular, ou seja, p53 e NFAT via de expressão gênica, induzidas por este Como
4O
6 e co-tratamento PDT método.
Estes efeitos foram produzidas pela terapia fotodinâmica, dependendo da concentração do fotossensibilizador Radachlorin, e pelo Como
4O
6 tratamento de uma forma dependente da concentração. Nas células não tratadas-PDT, o crescimento celular foi consistentemente mantido até o final do período de observação. células tratadas com PDT foram regredido por apenas 1 dia após a TFD, mas o crescimento da célula foi re-aumentada, após 2 dias pós-PDT. Quanto menor a medida
4O
6 nível foi, mais lento foi mostrado o crescimento de células efeito inibidor. Menos de 3 uM de Como
4O
6, inibição do crescimento celular parecia começar no 1º dia de tratamento e foi consistentemente mantido sob 60~80 nível% do crescimento celular durante os primeiros 4 dias de tratamento. Em contraste, as concentrações de A
4O
6 maior do que 3 uM parecia ser citotóxico. No grupo de co-tratamento de A
4O
6 e PDT, foram encontrados efeitos mais significativos sobre a inibição do crescimento celular e alterações morfológicas mais, em relação a cada grupo de tratamento único. Tem sido conhecido que os agentes antitumorais gerar oxigénio reactivo e espécies reactivas de azoto para induzir a apoptose e necrose da célula [17] – [19]. Como um dos agentes anti-tumor, o mecanismo de anti-tumor do composto de arsénio para gerar espécies reactivas de oxigénio e de azoto na linha celular de cancro colorrectal também foi avaliado [20]. O fornecimento de oxigénio suficiente e a geração de espécies de oxigénio reactivas (ROS) são conhecidas como sendo factores importantes que determinam o efeito da terapia fotodinâmica [4], [21]. Portanto, a indução de ROS mediada por agentes antitumorais podem ter contribuído para aumentar a eficiência dos PDT.
Em seguida, analisados comparativamente a mudança de via de sinalização intracelular de cada grupo /co-tratamento único, usando o RT
2Profiler
TM método de matriz de PCR, e estes resultados foram confirmados pela análise em tempo real de PCR utilizando 13 iniciadores diferentes. Usando a real-time PCR, analisou-se a alteração em níveis de 84 genes envolvidos em 15 vias de sinalização de expressão. Foram encontradas alterações significativas nos níveis de genes que se sabe estarem envolvidas na via de sobrevivência de células (por exemplo, Naip1, terc, AIP1, etc), via p53 (por exemplo, Bax, p21, Fas, GADD45, IGFBP-3, Mdm- expressão 2, etc), e NFAT (factor nuclear de células T-activate) via (por exemplo, Ly-12, CD178, IL-2, etc.) envolvidos na modulação da resposta imune. Especialmente, os níveis de Naip1, que é conhecido como o gene inibidor de apoptose, e terc, a telomerase transcritase inversa de expressão, foram reduzidas em cada percurso de sobrevivência celular, enquanto que o nível do gene indutor de apoptose AIP1 expressão foi aumentado. Além disso, os resultados de matriz PCR mostrou a diminuição dos níveis de expressão do gene Terc de 2,7, 17,1, e 34,6 vezes na A
4O grupos
6 sozinha, PDT sozinho, e co-tratamento, respectivamente, cada um em comparação com o grupo de controlo . terc gene é conhecida por estar relacionada com a activação da telomerase, e no caso do cancro do colo do útero, o gene c-myc parece induzir a activação da telomerase por expressão terc [22]. Portanto, sugerimos que a regulação negativa do gene Terc induzida por esse co-tratamento de Como
4O
6 e PDT pode ter sido envolvido na morte celular. A inibição do gene Terc também foi confirmado pelo tempo real exame PCR realizada após a RT
2 Profiler
análise de matriz TM PCR, e esta redução do nível de expressão do gene de terc foi mostrado de forma consistente no grupo co-tratamento, tanto
in vitro
e
in vivo
.
Nós também observaram mudanças nos níveis de p21 expressão, Fas, GADD45, genes de IGFBP-3, e MDM-2, conhecido de ser envolvida na via de p53, e o grupo de co-tratamento mostraram aumento mais significativo em relação a cada grupo de tratamento único. No entanto, não foi observada qualquer alteração significativa da expressão do gene Bax (conhecido por ser activada por p53). Além disso, a partir da ausência de alterações significativas dos níveis de p53, essas alterações de p21, Fas, GADD45, os níveis de IGFBP-3, e MDM2 de expressão de genes parecem ser mediados por vias independentes do p53.
Além , considerando-se os níveis de genes como Ly-12, CD178, e de IL-2, conhecida por estar envolvida na via de NFAT expressão, Ly-12 de expressão aumentada, ao passo que CD178 e IL-2 expressões em vez diminuiu no grupo co-tratamento, em comparação com cada grupo de tratamento único. Como foi conhecido da via intracelular de NFAT para ser associada a respostas imunes aumentadas, espera-se que ele pode ser regulada para cima pela TFD; No entanto, os níveis de expressão do gene nesta via, incluindo IL-2, diminuiu após tratamento PDT e nova descida foi encontrado no grupo co-tratamento. No entanto, quando tentámos para confirmar os resultados de RT
2Profiler
TM matriz PCR utilizando o método de PCR em tempo real, encontramos resultados opostos comparados com os de RT
2Profiler
array TM PCR, ou seja, IL-2 expressão diminuiu no grupo de tratamento sozinho PDT e aumentou no grupo co-tratamento, ambos mostrando resultados semelhantes em
in vitro Comprar e
in vivo
condições. Foi relatado que a PDT pode estimular o crescimento indutor de tumores sinais imunológicas e pode ser melhorada, controlando vias de crescimento-estimuladores indesejados [23], [24]. Por conseguinte, os nossos resultados para a IL-2 parecem mostrar que a TFD diminuiu a expressão deste gene, ao passo que foi aumentado pelo tratamento com o composto de arsénio, o que indica que a terapia de combinação combinam duas vantagens através da indução de mediadores imunes e efeitos antitumorais. Além disso, este tratamento concomitante aumentou a
in vitro
e
in vivo
níveis de expressão do gene do antigénio CD5 e Ly-12 até 23 e 26 vezes, respectivamente. No entanto, os níveis de Ly-12 ou IL-2 expressão não mostrou alterações significativas no grupo sozinho tratamento PDT; Portanto, o aumento da expressão de genes parece ser induzida pelo composto de arsénio. Até agora, no entanto, há outros estudos relataram a relação entre o combinado PDT-Como
4O
6 tratamento e da via NFAT, e os estudos mais intensivos deve ser realizada.
Da mesma forma, o nosso TC-1 célula modelo de ratinho transplantado-line mostrou significativamente reforçada efeito antitumoral do PDT e Como
grupo 4O
6 co-tratamento, em comparação com cada grupo de tratamento único. Para identificar o mecanismo que explica este efeito, foram realizadas em tempo real experiência de PCR utilizando 10 iniciadores diferentes e finalmente observadas alterações significativas nos níveis de genes que se sabe estarem envolvidas no percurso de sobrevivência celular, via p53 expressão, e via de NFAT, semelhante com aqueles obtido a partir de
in vitro
experimentos. Nossos dados western blot demonstra que a co-tratamento aumento da expressão de p53, p21, GADD45 em 7 dias em comparação ao tratamento com um único agente e controle. A activação da proteína p53 desempenha um papel crucial no controlo da resposta de células de tumor a agentes quimioterapêuticos e agentes que danificam o DNA. p21 e GADD45, efectores a jusante de p53, foram activadas no tratamento de combinação produzindo apoptose em TC-1 células tumorais. Estes resultados sugerem que a apoptose pode ser mediado através da via de sinalização de p53 através de regulação positiva de proteínas pró-apoptóticas.
durante a PDT, a depleção de oxigénio intracelular e colapso vasos sanguíneos pode induzir hipóxia intracelular e isso pode sobre-regular o nível da expressão de VEGF para catalisar a angiogénese [25]. Muitos estudos sobre PDT têm vindo a tentar aumentar a eficiência deste método, apoiando a geração de ROS intracelular, ou realizando este método em combinação com vários inibidores de angiogénese, tais como COX-2, MMP, ou VEGF [9], [ ,,,0],26] – [31]. Os compostos de arsénio são actualmente utilizados como agentes terapêuticos para leucemia aguda e vários tumores sólidos, e eles também têm sido relatados para gerar ROS e inibir a expressão de VEGF [17], [19]. Neste estudo, o efeito da perturbação vascular Como
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6 foi determinado por imuno-histoquímica e Hoechst33342 perfusão coloração CD31. área de perfusão sanguínea diminuiu rapidamente depois de Como
4O
6 tratamento. Do ponto de tempo de 3 h, a parte central dos tumores desapareceu no que diz respeito à actividade de perfusão e, finalmente, quase nenhum sinal pode ser detectado na área de tumores todo, mesmo o bordo exterior. Curiosamente, esta redução da área de perfusão foi recuperado a partir do ponto de tempo de 24 horas, e a fluorescência apareceu a partir do bordo exterior claramente às 48 e 72 h. Mesmo que a perfusão de sangue apareceu para ser recuperado a partir da borda exterior 72 h após o tratamento, nenhum sinal foi detectado a partir do interior dos tumores. Estes dados mostraram que os microvasos imunorreactivas muito mais intensas foram observados em tecidos de tumor de ratinhos tratados com PBS, mas pouca coloração CD31 estava presente na região central de tecidos de tumor de ratinhos tratados com A
4O
6. Os resultados ecoam os de estudos envolvendo Como
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3 e Conbretastatin A-4, [33] [32]. Como
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3 diminuiu sangue de perfusão em relação aos controlos até 6 h após Como
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3 tratamento com alguma recuperação às 24 h [32], e também CA-4-P, 24 h após o tratamento em tumores P22 funções vasculares exibida recuperar parcial [33]. Portanto, no presente estudo, utilizou-se um dos compostos de arsénio, isto é, como
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6, em combinação com o método PDT para investigar o efeito anti-tumor e também aumentar as suas vias de sinalização intracelulares. Estes dados mostraram que o efeito da terapia combinatória em VEGF e vias associadas foram reforçadas com as avaliações da vasculatura associada a um tumor no modelo animal e de marcadores de angiogénese nas lesões tumorais.