Abstract
A extraordinária diversidade biológica das florestas tropicais abriga uma diversidade química rica com um enorme potencial como fonte de novos compostos bioativos. De particular interesse são os novos ambientes para a descoberta microbiana. Preguiças – mamíferos arbóreas comumente encontrados nas florestas de várzea do Panamá – transportar uma grande variedade de micro e macro-organismos em seus cabelos exterior grossa. Aqui nós relatamos pela primeira vez o isolamento de diversas e bioativos cepas de fungos de cabelo preguiça, e sua colocação taxonômica. Oitenta e quatro isolados de fungos foram obtidos na cultura da superfície do cabelo que foi coletado de viver preguiças de três dedos (
Bradypus variegatus
, Bradypodidae) no Parque Nacional Soberanía, República do Panamá. As análises filogenéticas revelaram um grupo diversificado de Ascomycota pertencentes a 28 unidades distintas operacionais taxonômicos (Otus), vários dos quais são divergentes da taxa previamente conhecida. Setenta e quatro isolados foram cultivados em caldo líquido e extratos foram testados para a bioatividade
in vitro
. Encontramos uma ampla gama de atividades contra as estirpes de parasitas que causam a malária (
Plasmodium falciparum
) e doença de Chagas (
Trypanosoma cruzi
), e contra a linha de células de cancro da mama humano MCF-7 . Cinquenta extratos de fungos foram testados para atividade antibacteriana em uma nova tela de perfil antibiótico chamado Biomap; destes, 20 foram ativos contra pelo menos uma estirpe bacteriana, e um tinha um padrão incomum de bioactividade contra bactérias Gram-negativas que sugere um potencial novo modo de ação. Juntos, nossos resultados revelam a importância de explorar novos ambientes para fungos bioativo, e demonstrar, pela primeira vez a composição taxonômica e bioatividade de fungos de cabelo preguiça
Citation:. Higginbotham S, Wong WR, Linington RG, Spadafora C , Iturrado L, Arnold AE (2014) Cabelo preguiça como uma fonte Novel of Fungi com potente anti-parasitários, anti-câncer e bioatividade anti-bacteriana. PLoS ONE 9 (1): e84549. doi: 10.1371 /journal.pone.0084549
editor: Joy Sturtevant, Universidade do Estado de Louisiana, Estados Unidos da América
Recebido: 31 Julho, 2013; Aceito: 15 de novembro de 2013; Publicação: 15 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Higginbotham et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo programa International Cooperative Groups Biodiversidade (ICBG-Panamá https://www.icbg.org/, conceda o número 2 U01 TW006634-06) e da faculdade de Agricultura e Ciências da Vida da Universidade de Arizona. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Apesar de vastos aumentos nos gastos com saúde internacional ao longo dos últimos 20 anos, as doenças transmissíveis continuam a representar um enorme fardo para a saúde mundial [1]. doenças infecciosas crônicas, como a malária e diversas doenças tropicais negligenciadas (DTNs) afetam milhões de pessoas a cada ano, principalmente mulheres e crianças nos países em desenvolvimento [2]. A rápida disseminação da resistência aos antibióticos diminuiu o arsenal disponível para tratar muitas doenças infecciosas, com o recente aparecimento de resistência pandrug produzindo doenças que são recalcitrantes ao tratamento com qualquer medicamento conhecido [3]. Paralelamente doenças não transmissíveis estão aumentando na incidência em relação a doenças transmissíveis: em 2008, o câncer foi responsável por cerca de 7,8 milhões de mortes (cerca de 13% de todas as mortes em todo o mundo; [4])
Os produtos naturais representam um dos. a maioria das fontes significativas de novas drogas hoje. Aproximadamente 50% de todos os medicamentos introduzidos entre 1981 e 2006 eram de origem natural do produto [5], com um adicional de 34 medicamentos naturais à base de produtos lançados entre 1997 e 2007 [6]. Desde a descoberta de penicilina mais de 80 anos atrás, fungos têm contribuído grandemente para a descoberta de medicamentos produto natural, proporcionando uma série de medicamentos valiosos, incluindo os antibióticos β-lactâmicos, griseofulvina, ciclosporina, ácido fusídico, e lovastatina [7]. No entanto, nos últimos anos, a taxa de sucesso para a bioactividade de fungos diminuiu, possivelmente, apontando para o esgotamento iminente de “baixa fruta de suspensão ‘- os fungos com facilidade e freqüentemente acessados como microfungos do solo -. Como fontes de novos metabólitos bioativos
estimativas conservadoras indicam que o número total de espécies de fungos na existência excede 5000000, ainda menos de 100.000 espécies fúngicas têm sido descritas [8], [9]. Isto sugere que a exploração de novos ambientes que podem ser o lar de fungos anteriormente undescribed pode ser extremamente produtivo. Por exemplo, o exame recente de fungos endófitos tropicais descreveu folhas tropicais como um “hotspot de biodiversidade” [10], [11], [12] que está provando frutífera como fonte de novos compostos bioativos (veja [13] para uma revisão) .
Gloer [14] propôs que a produção de metabólitos secundários por fungos pode ser influenciada pelas pressões seletivas transmitidas por outros organismos. Isto sugere que os ambientes onde existem muitas espécies diferentes em estreita proximidade pode ter potencial em particular como fonte de metabólitos bioativos. Um tal ambiente inexplorado é o microbioma fúngica associada com o grosso cabelo, esponja da preguiça de três dedos (
Bradypus variegatus
), um mamífero arbórea comumente encontrada nas florestas tropicais de terras baixas da América Central.
o brasão de três dedos preguiças consiste em duas camadas distintas: uma camada interna de cabelo fino, macio perto da pele, e uma camada externa de pêlos grossos que são oval em secção transversal e são aproximadamente 0,4 mm de largura [ ,,,0],15]. Estes pêlos exteriores levar a rachaduras transversais que são o lar de uma alga verde, aparentemente onipresente, mais comumente do género
Trichophilus
[16]. A alga é popularmente pensado para proporcionar camuflagem para preguiças contra o fundo manchado de seu habitat, mas isso não foi confirmado com os dados. Suutari
et al.
[16] sugeriu que as substâncias exopolymeric produzidos pela alga pode estimular o crescimento de bactérias benéficas. preguiça cabelo é comumente lar de cianobactérias e diatomáceas, assim como uma variedade de macrorganismos (por exemplo, baratas, lombrigas, e larvas de traça; [16]). No entanto, pouco se sabe sobre as comunidades de fungos no cabelo preguiça.
Em um esforço para descobrir novas fontes de drogas para o tratamento de doenças transmitidas por vetores, câncer e infecções bacterianas, foi utilizada uma abordagem baseada em cultura para examinar comunidades de fungos associados à grossa, cabelo exterior de
Bradypus variegatus
no Panamá. Aqui nós relatamos o isolamento de fungos com bioactividade contra
Trypanosoma cruzi
, o agente causal da doença de Chagas;
Plasmodium falciparum
, o agente causal da malária; a linha celular de cancro da mama humano MCF-7; e uma variedade de bactérias patogénicas humanas Gram-negativas e Gram-positivas. Análises filogenéticas foram usadas para identificar estes fungos num nível mais fina e mais forte do que é possível usando os métodos típicos de banco de dados de correspondência sozinho. Nossos resultados sugerem que o cabelo preguiça é uma nova fonte interessante de importantes fungos bioativos com muito espaço para a exploração das outras cinco espécies de preguiça existentes encontrados em toda a região neotropical.
Materiais e Métodos
Aprovação para amostragem da preguiça cabelo foi obtido a partir Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) do Instituto de Pesquisa Tropical Smithsonian e as licenças de coleta foram obtidas a partir do Panamá Autoridade Nacional do Ambiente (ANAM). Uma única amostra de cabelo exterior grossa foram coletados a partir torno da parte traseira inferior de cada um dos nove vivendo de três dedos preguiças encontradas em fevereiro de 2011 junto Pipeline Estrada no parque nacional de Soberania, República do Panamá (N 9 ° 9 ‘, W 79 ° 44’ ; [17]). As amostras de cabelo foram colocadas em tubos Falcon esterilizados metade encheram-se com gel de sílica e armazenados à temperatura ambiente até serem processadas.
Isolamento e cultivo de fungos
Cada cabelo foi enxaguado com água estéril para remover detritos e frouxamente microorganismos associados. Sob condições assépticas cabelos foram cortadas em pedaços de aproximadamente 2,5 cm de comprimento e colocadas sobre a superfície de agar de dextrose de batata (PDA) ou 2% de extracto de malte agar (MEA) em placas de Petri estéreis. As placas foram seladas com parafilme, incubadas à temperatura ambiente, e verificado por um novo crescimento de fungos ao dia durante 2 semanas. As hifas foram cortadas assepticamente a partir de cada placa e transferidas para cultura axénica no mesmo meio. Os isolados foram armazenados como comprovantes de vida à temperatura ambiente (isto é, como agar conecta com micélio em água destilada estéril) e foram arquivados na coleção da International Cooperative Grupo da Biodiversidade (ICBG) no Instituto de Pesquisa Tropical Smithsonian no Panamá (acessos disponíveis no pedido)
identificação fúngica
DNA genômico total foi extraído de culturas frescas de fungos de acordo com Arnold Lutzoni [11]. Os espaçadores internos transcritos nucleares ribossomais e 5.8S gene (ITSrDNA) e uma porção adjacente do grande subunidade ribossomal nuclear (LSUrDNA) foram amplificados como um único fragmento utilizando iniciadores ITS1F ou ITS5 e LR3 seguintes Hoffman
et ai.
[18]. Os produtos de PCR foram visualizados utilizando SYBR verde seguinte eletroforese em gel de agarose a 1% e submetido à Universidade do Arizona Genetics Núcleo para limpeza, normalização e bidirecional sequenciamento Sanger. As sequências foram montadas de forma automática e bases chamado usando
Phred
e
phrap
[19], [20] com orquestração de Mesquite [21], seguida por edição manual em Sequencher 4,5 (GeneCodes Corp.) . As seqüências foram comparadas com o banco de dados NCBI não redundante usando BLASTn [22] para estimar colocação taxonômica e foram submetidos a GenBank com os números de adesão. KF746076-KF746159 (Tabela S1).
Uma vez que a identificação com base apenas em BLAST partidas têm de ser tratados com precaução (por exemplo, [23]) foi utilizada a análise filogenética para fornecer inferência mais forte sobre a afiliação taxonômica. dados de sequência para 84 isolados fúngicos foram carregados como um grupo em Mesquite [21] e alinhado pelo músculo [24]. O alinhamento resultante, que identificou grupos de sequências facilmente ajustável em, era impróprio para uma única análise filogenética devido à prevalência das regiões ambíguas e unalignable. As sequências que alinhadas de forma coerente para um outro foram divididos em grupos de estirpes aparentemente estreitamente relacionados. grupos resultantes foram então analisados como conjuntos de dados separados como se segue: Todas as sequências em cada grupo foram comparados contra a base de dados do NCBI usando BLASTn. Os 50 melhores hits para cada sequência foram baixados e filtrado para remover (1) sequências redundantes, e (2) as sequências de potencialmente mis-identificadas cepas e amostras unvouchered (ver [23]). Pelo menos uma sequência a partir de uma colecção de culturas de confiança foi incluído em cada conjunto de dados, e um ou dois grupos externos foram selecionados de espécies estreitamente relacionadas às seqüências nomeadas no conjunto de dados (escolhido pela revisão da literatura).
Cada conjunto de dados resultante foi separadamente alinhados no músculo. Sequências em cada alinhamento foram aparadas para pontos inicial e final consistentes e de qualidade alinhamento foi verificada por inspeção visual em Mesquite. Todos os alinhamentos foram submetidos a TreeBASE (https://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S14945). Modelos de evolução foram inferidas usando jModeltest [25], [26]. árvores filogenéticas foram inferidas por máxima verossimilhança em Garli [27], com o apoio determinado por 100 de bootstrap repetições implementado no portal web CIPRES [28], e usando métodos bayesianos em MrBayes (acessados via CIPRES [28]). Para este último, análises consistiu de 5 milhões de gerações, com quatro cadeias, árvores de partida aleatórios, e amostragem toda árvore 1000. Completude foi avaliada com base em asymptotes dos valores li -No e avaliação de desvios padrão de frequências de divisão. probabilidades posteriores fornecidos valores inferencialmente independentes para apoiar as relações topológicas e valores de suporte associados a partir de análises de máxima verossimilhança. Resultados de cada análise filogenética foram comparados com a literatura existente para cada grupo taxonômico para garantir que as relações de taxa conhecida eram adequados, proporcionando assim a confiança no que diz respeito à nossa colocação de fungos cabelo preguiça.
Preparação de extratos de fungos
um único pedaço de agar de cada estirpe seleccionada para análise posterior foi transferido em condições estéreis para uma placa fresca de 2% de MEA e incubado na bancada à temperatura ambiente até cerca de 50% da placa foi coberta com crescimento micelial. Quinze tampões de agar (cada um 5 mm de diâmetro) foram cortados com um perfurador de cortiça estéril, sob condições estéreis e transferido para frascos contendo 37 ml de 2% de extracto de malte caldo (MEB). Os frascos foram incubados num agitador orbital (28 ° C, 125 rpm) durante 2 semanas.
As culturas liquidas foram misturados com um volume igual de acetato de etilo e misturou-se durante 2 minutos a 9000 rpm com um Polytron (Lauda- Brinkmann, Delran, NJ, EUA). biomassa fúngica foi removido por filtração a vácuo através de papel de filtro Whatman (# 1) e o filtrado foi extraído duas vezes com um volume de acetato de etilo 01:01. A camada aquosa foi rejeitada e a camada orgânica foi seca e armazenada a -80 ° C.
Bioensaios
extratos brutos de culturas de fungos foram utilizados em bioensaios contra estirpes focais dos agentes causais de malária (
Plasmodium falciparum
) e doença de Chagas (
Trypanosoma cruzi
), e contra a linha de células de cancro da mama MCF-7, como descrito por Higginbotham
et al
. [29]. A bioactividade de extractos, que foram diluídos em DMSO (10 ug /ml), foi medido como a percentagem de inibição de crescimento (% IG) em comparação com o controlo negativo (sem DMSO extracto; 0% IG).
Biomap analisa
uma tela de perfil de atividade antibiótica, Biomap (Anti
bio
tic
m
ode de
a
cção
p
rofile; [30]), foi usada para testar a actividade dos 50 extractos orgânicos brutos contra 15 bactérias patogénicas humanas. Extractos com potente bioactividade foram diluídas em série (16 diluições de 2 vezes) e re-rastreados contra o mesmo painel de bactérias. As curvas de crescimento foram representados através da gravação de um valor OD
600 sub valores de hora a hora durante 24 horas e as concentrações inibitórias mínimas (CIM) foram calculadas subsequentemente, para cada extracto. Para estabelecer os perfis de bioactividade independente da concentração para cada extracto, os valores de MIC em bruto foram normalizados resultando em um intervalo de valores de 0 (inactivo) a 1 (mais bioactiva). Estes perfis de actividade foram comparados com perfis de antibióticos conhecidos que pertencem a todas as principais classes estruturais. Este método é eficaz na predição da classe estrutural de compostos antibióticos desconhecidos a partir de misturas complexas ou bruto [30].
Resultados e Discussão
Um total de 84 isolados fúngicos foi examinada a partir do exterior cabelo grosso de nove indivíduos que vivem da preguiça de três dedos (
Bradypus variegatus
) encontrados ao longo Pipeline Estrada no parque nacional de Soberania, República do Panamá. As amostras de cabelo foram transportados para o laboratório em tubos Falcon estéreis que tinha sido metade cheio com gel de sílica, um dessecante que é eficaz para o armazenamento de tecido fúngico [31], [32]. Cada pedaço de cabelo preguiça colocados em agar produziram vários isolados de fungos que representam uma variedade de tipos morfológicos. Análises filogenéticas de estirpes axênicas revelou um grupo diverso de fungos, alguns dos quais parecem ser novos em relação à taxa observada anteriormente ou sequenciados (Tabela 1, Figura 1). Muitos destes isolados exibem bioactividade
In vitro
contra parasitas que causam a malária e a doença de Chagas, células de cancro da mama, e as bactérias patogénicas humanas, tanto Gram-positivos e Gram-negativos (Tabela 2, Tabela 3).
Topologia de cada árvore reflete análise ML, e valores acima de ramos indicam valores ML de bootstrap e probabilidades posteriores Bayesiana ( 0,50 e 0,75, respectivamente). Outgroups e amostragem taxon para cada árvore foram validados por análise da literatura científica (ver métodos). Conclusões taxonómicas são apresentados na Tabela 1. A Figura 1 (A): Colocação de F5073 no grupo 17; (B) F4847 no grupo 18; (C) F4831a no grupo 19; (D) F4819 no grupo 20; (E) F4801 no grupo 5; (F) F4806 no grupo 7; (G) F4886 no grupo 8; (H) F5071 no grupo 15; (I) F4812-F4816, F4830, F4831, F4845, F4852-F4856, F4860, F4873, F4882, F4883 e F4900-F4902 no grupo 1; (J) F4803, F4817, F4820, F4823, F4824, F4826, F4827, F4829, F4837, F4841, F4842, F4846, F4848, F4857, F4858, F4861, F4862, F4870, F4872, F4875, F4878, F4879, F4894-F4896 , F4908, F4909, F5069 e F5074 no grupo 2; (K) F4818 e F4839 no grupo 10; (L) F4877, F4890 e F4897 no grupo 11; (M) F4828 e F4898 no grupo 12; (N) F4876 e F4881 no grupo 13; (O) F4863 e F4884 no grupo 6; (P) F4821, F4874, F4889 e F4913 no grupo 3; (Q) F4802, F4807, F4825, F4844, F4906 e F5068 no grupo 4; (R) F4850 e F4891 no grupo 9; (S) F4904 e F4905 no grupo 14; e (T) F5070 e F5072 no grupo 16.
filogenética analisa
A 84 de fungos isolados representados 28 unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com base em 95% de semelhança de sequências (Tabela 1). Os dois mais abundante UTOs representado 34 (40,5%) dos isolados. Os restantes 50 isolados foram representados por 26 distinta OTUs.
comparações explosão com GenBank fornecida estimativas preliminares de colocação taxonômica e semelhança com fungos previamente sequenciado (Tabela 1). Todos os isolados foram Ascomycota. Quatorze isolados teve um jogo de cima para clones fugais incultos e 23 teve um jogo de cima para fungos cultivados, mas não identificados. Os 47 isolados restantes tiveram partidas a cepas nomeados que provisoriamente sugeridas colocação na sordariomycetes (Xylariales, Glomerellales, Hypocreales), dothideomycetes (Botryosphaeriales e pleosporales) e eurotiomycetes (Eurotiales). Para determinar com mais confiança colocação taxonômica, as sequências foram analisadas utilizando máxima verossimilhança e métodos Bayesian
As sequências que alinhadas bem um ao outro foram divididos em grupos para criar 20 grupos de espécies aparentemente semelhantes (Tabela 1; Figura 1).. Um grupo continha 29 sequências de fungos preguiça-de cabelo, um grupo continha 20 seqüências, e os restantes 18 grupos contidos entre 1 e 6 sequências de cada um. Entre 34 e 165 sequências de taxa intimamente relacionados foram compilados para cada grupo para fazer conjuntos de dados não redundantes de que um ou dois grupos externos apropriados foram adicionados com base na revisão da literatura.
Na sequência de análises filogenéticas, as identidades de alto nível (classe, ordem, da família) poderia ser com confiança atribuídos a 82 fungos que representam 15 famílias e 10 ordens (Tabela 1; Figura 1). A maioria (81,7%) destes eram sordariomycetes. Fungos desta classe estão bem documentados fontes de metabolitos bioactivos (por exemplo, [33], [34]). Os isolados restantes foram dothideomycetes (15,9%) e eurotiomycetes (2,4%)
Oitenta isolados poderia ser atribuído a confiança 15 géneros (Tabela 1; Figura 1).. Dois isolados foram dadas colocações filogenéticas mais experimental. F4886 (Figura 1 (L)) foi identificado como
Robillarda
sp. ou como um membro de um gênero estreitamente relacionado dentro do Amphisphaeriaceae. Isolar F4831a (Figura 1 (C)) foi identificado como um membro de
Paraconiothyrium
sp. ou um género dentro do Montagnulaceae intimamente relacionados. Os gêneros dois mais comuns,
Pestalotiopsis
sp. e
Hypocrea
sp., foram isolados a partir de 7 de 9 e 5 de amostras de cabelo 9 preguiça, respectivamente.
Isolar F4891 (Figura 1 (R)) não pareceu estar estreitamente relacionado com qualquer chamada sequências em GenBank e só poderia ser identificada como possivelmente um membro da ordem pleosporales (dothideomycetes). Isolar F4850 (Figura 1 (R)) tinha 96% de similaridade de sequência com o seu valor mais próximo na GenBank, um clone de fungo do solo sem cultura (Tabela 1; [35]). Outras análises são garantidos, a fim de confirmar se isola F4891 e F4850 são novas espécies fúngicas. Em geral, as identificações atribuídas por análises filogenéticas estreitamente alinhados aos do topo BLAST bate para cada isolado (Tabela 1).
Bioatividade de cabelo preguiça isola
fungos cabelo preguiça que foram cultivadas em meio líquido e extraiu-se com acetato de etilo foram testados quanto à bioactividade. Considerou-se extractos a ser altamente bioactiva se causarem pelo menos 50% de inibição do crescimento (isto é, ≥50% IG) de parasitas ou células cancerosas
in vitro
.
De modo geral, dois 70 (2,5%) extratos testados foram altamente ativos contra
P. falciparum
, oito dos 62 (12,9%) extratos testados foram altamente ativos contra
T. cruzi
, e 15 de 73 (20,6%) foram testados extractos altamente activo contra a linha celular de cancro da mama MCF-7 (Tabela 2). A maioria dos extractos com bioactividade foram activos em apenas um ensaio (Tabela 2). estirpes bioactivos foram isolados com igual frequência em MEA e PDA (Tabela 2). Notavelmente, intimamente relacionada isolados, muitas vezes diferem em bioatividade: por exemplo, três de 20 isolados identificados como
Hypocrea
sp. (Tabela 1) apresentavam bioactividade apenas contra MCF-7 Células de cancro da mama; três foram ativos contra células MCF-7 de cancro da mama e
T. cruzi
(Tabela 2); e um era ativo apenas contra resistente à meticilina
S. aureus
(Tabela 3).
Dos 16 fungos que tiveram alta IG% em pelo menos uma
in vitro
ensaio, 13 pertenciam ao Hypocreales (Hypocreaceae, Bionectriaceae e nectriaceae) . Os restantes três fungos pertencia ao Valsaceae (Diaporthales), Amphisphaeriaceae (Xylariales) e Trichocomaceae (Eurotiales). Anti-malária e actividades anti-câncer foram relatados na literatura a partir destas linhagens fúngicas relativamente bem estudados (por exemplo, [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]). Contudo, os nossos resultados representam, para o melhor de nosso conhecimento, os primeiros relatórios de actividade anti-tripanossoma em
Cytospora
(Valsaceae) e
Bionectria
(Bionectriaceae).
A número de isolados altamente ativos contra
T. cruzi
(Tabela 2) é de particular interesse como nós tão raramente encontrar micróbios com bioatividade neste ensaio: apenas 104 de 2698 fungos endófitos (3,9%) de nossa coleção cultura geral são altamente ativos contra esse parasita [29]. Atualmente, os únicos tratamentos disponíveis para esta doença são nitrofurano e benznidazol, ambos os quais estão associados a tais efeitos secundários tóxicos que o tratamento é muitas vezes abandonados [44].
Dos 50 extratos de fungos selecionados por Biomap, 20 foram ativos contra pelo menos um organismo de teste (Tabela 3). A maioria dos isolados (16 de 20) ativo contra bactérias no ensaio Biomap pertencia à família Lasiosphaeriaceae (Sordariales), Glomerellaceae (Glomerellales), Valsaceae (Diaporthales), Botryosphaeriaceae (Botryosphaeriales) e Amphisphaeriaceae (Xylariales). Os quatro fungos restantes pertenciam à nectriaceae, Bionectriaceae e Hypocreaceae (Hypocreales). Atividade contra bactérias Gram-positivas foi detectado muito mais frequência do que contra as bactérias Gram-negativas (Tabela 3)
Cinco isolados (
Colletotrichum sp
F4806 (Figura 1 (F));..
Cytospora
sp 1, F4818 tensão (Figura 1 (K));.
Fusarium sp
1, tensão F4898 (Figura 1 (M));.
Lasiodiplodia
sp. 1, a estirpe F4807 (Figura 1 (Q)), e
Lasiodiplodia
sp 1, F4844 tensão (Figura 1 (Q)) tinha uma actividade particularmente potente no ensaio Biomap e foram selecionados para testes adicionais diluídas em série.. extractos foram novamente testados para a atividade contra o painel de 15 bactérias e perfis de bioatividade foram construídos utilizando valores de CIM normalizadas (Tabela 4).
o extrato de
Lasiodiplodia
sp. 1 ( estirpe F4807) foi de particular interesse uma vez que tinha uma actividade potente e específica contra bactérias Gram-negativas (Quadro 4). o perfil de bioactividade do isolado não é igual ao de qualquer uma das classes de antibióticos conhecidos anteriormente testadas no ensaio Biomap, sugerindo um potencialmente novo modo de acção (ver [30]). As infecções causadas por (MDR) bactérias Gram-negativas multirresistentes emergentes estão se tornando uma grande preocupação clínica em todo o mundo [45]. Estas infecções mais comumente incluem MDR
Pseudomonas aeruginosa
, de espectro estendido produzindo Enterobacteriaceae β-lactamase, e MDR
Acinetobacter baumannii
[46]. Dados recentes sugerem que as infecções rastreados para
Staphylococcus aureus
isolados da corrente sanguínea estão em declínio, mas que as infecções por
Escherichia coli, as espécies Gram-negativas mais comuns responsáveis por infecções no sangue humano isola, são aumentando em freqüência [47]. Esse relatório [47] também destaca a escassez de agentes antibacterianos em desenvolvimento para as bactérias Gram-negativas, com mais esforço que está sendo focado em MRSA Gram-positivas. O aumento da prevalência de organismos MDR é principalmente devido ao uso excessivo de antibióticos de amplo espectro e má administração de antibióticos [48]. Por conseguinte, a especificidade do extracto de F4807 estirpe para as estirpes Gram-negativas é altamente valiosa e vale a pena prosseguir para posterior análise.
fungos isolados neste estudo foram taxonomicamente consistente com os grupos de fungos conhecida a ocorrência no solo e nas plantas como patógenos, saprófitas, ou endófitos [11], [49]. Preguiças podem encontrar tais fungos, aliás, a partir Spora ar, ou através de contacto directo quando eles descem das árvores, a fim de defecar e urinar, momento em que eles cavam um buraco no solo que, posteriormente, cobrir com serapilheira [50]. Surpreendentemente, a comparação com uma grande coleção de endófitos de plantas terrestres no Panamá ([29]; 1269 linhagens) revelou que as sequências de 29 isolados de cabelo preguiça eram idênticas às estirpes obtidas a partir de plantas (100% de similaridade ao longo do comprimento sequência completa). Assim, este estudo estende a gama de hospedeiros conhecidos e modo ecológico de endófitos putativos. Alguns destes fungos podem afiliado diretamente com a alga verde que habita pêlos grossos de preguiças, bem como associado fungos endolichenic com algas verdes em talos líquen e muitas vezes são taxonomicamente semelhante ao endófitos nos mesmos ambientes [51], [52].
papéis potenciais desses fungos na saúde das preguiças não foram investigadas. Araújo Xavier
et al
. [50] relataram infecções fúngicas em
B. variegatus
causada pelo fungo patogênico
Microsporum
(que também causa a dermatite nos seres humanos; [53]), mas este gênero não foi recuperada no presente estudo ou no trabalho anterior de Suutari
et al
. [16]. Em contraste com o microbioma humano, em que os fungos compreendem 0,01% de communites microbianas em superfícies externas, tais como a pele [54], Suutari
et ai. [16] relatou que os fungos representaram 8% da flora nas pesquisas de micróbios preguiça-de cabelo. A alta abundância e diversidade de fungos associados com cabelo preguiça, juntamente com a sua bioactividade, pode falar com um importância biológica para preguiças que ainda é inexplorado.
A necessidade urgente de novos medicamentos continua a representar um dos maiores desafios da humanidade . é comumente acordado que a grande maioria dos micróbios bioativos continuam a ser descobertos [9] e taxa microbianas recém-descobertas mantenha uma promessa importante do romance química. abundante evidência aponta para novos ambientes como fontes promissoras de microrganismos ainda não descritas [55]. Aqui temos demonstrado que o cabelo da preguiça de três dedos (
Bradypus variegatus
) no Panamá é uma fonte rica de diversos fungos bioativos. Cepas isoladas aqui incluídas membros de algumas linhagens bem estudados (por exemplo, Hypocreales; pleosporales), mas também membros da estudado ou potencialmente novos grupos (por exemplo,
Endomelanconiopsis
sp F4801;.
Robillarda
sp . F4886; Ascomycota sp F4891;.. Ascomycota sp F4850). Prevemos que o romance taxa adicional poderia ser encontrado em cabelos preguiça, expandindo os métodos de inquérito a diversos tipos de mídia e através de métodos de alto rendimento para avaliar a composição da comunidade. Nós também antecipar que taxa diferente pode ser isolado a partir de preguiças em outras regiões, bem como comunidades de endófitos em plantas tropicais diferem acentuadamente em escala regional [56], [57]. Assim, nosso trabalho sugere que a exploração frutífera da microbiota preguiça é garantido por aplicações potenciais na descoberta de medicamentos.
Informações de Apoio
Tabela S1. números de identificação de cabelo fungos e acesso GenBank
preguiça
doi: 10.1371. /journal.pone.0084549.s001
(DOCX)
Reconhecimentos
Agradecemos Bryson Voirin para recolha de amostras de cabelo preguiça. Agradecemos Phyllis D. Coley, Thomas A. Kursar, Meg Crofoot e Santosh Jagadeeshan pelos comentários e outras formas de assistência, e Malkanthi Gunatilaka e Jakob Riddle para análise da sequência. Agradecemos ao governo do Panamá e, em particular, o pessoal das do Panamá Autoridade Nacional do Ambiente (ANAM), para facilitar a pesquisa. Agradecemos ao Smithsonian Tropical Research Institute (STRI) para suportar todos os aspectos logísticos deste trabalho e os muitos estudantes e assistentes que contribuíram para este corpo de pesquisa.