Abstract

Vários fatores impulsionam a progressão da mucosa saudável em relação carcinomas colorretais esporádicos e evidências acumuladas associa bactérias intestinais com a iniciação e progressão da doença. Portanto, o objetivo deste estudo foi o de fornecer um mapa primeiro de alta resolução de disbiose cólon que está associado com cancro colo-rectal humano (CRC). Para este fim, os microbiomas colonizadoras tecido de tumor do cólon e mucosa não-maligno adjacente foram comparados através de sequenciação de rRNA profunda. Os resultados revelaram diferenças marcantes nos padrões de colonização microbiana entre estes dois locais. Embora a colonização inter-individual em pacientes com CCR foi variável, os tumores de forma consistente formado um nicho para

Coriobacteria Comprar e outras espécies de bactérias probióticas propostas, enquanto potencialmente patogênicos

Enterobactéria

foram sub-representadas no tecido tumoral. À medida que a microbiota intestinal é geralmente estável durante a vida adulta, estes resultados sugerem que fisiológico CRC-associado e alterações metabólicas recrutar bactérias comensais-like-forrageamento tumorais. Estes micróbios, assim, têm uma vantagem competitiva aparente no microambiente tumoral e assim parecem substituir as bactérias patogénicas que podem ser implicados na etiologia de CRC. Este primeiro vislumbre do microbioma CRC fornece um importante passo no sentido da plena compreensão da interacção dinâmica entre a ecologia microbiana intestinal e esporádica CRC, o que pode fornecer pistas importantes para novas ferramentas de diagnóstico relacionados com o microbioma e intervenções terapêuticas

Citation.: Marchesi JR, Dutilh BE, Salão N, Peters WHM, Roelofs R, Boleij A, et al. (2011) Para o Cancer Microbiome colorretal humano. PLoS ONE 6 (5): e20447. doi: 10.1371 /journal.pone.0020447

editor: Niyaz Ahmed, da Universidade de Hyderabad, Índia |

Recebido: 18 de fevereiro de 2011; Aceito: 22 de abril de 2011; Publicado em: 24 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Marchesi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. AB era apoiado pela Sociedade holandesa Câncer (KWF; Projeto KUN 2006-3591). Holandês Digestive Diseases Foundation (MDLs; projeto WO 10-53). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o trato intestinal humano contém cerca de 10

14 bactérias, compreendendo ~ 10

3 espécies, que são essenciais para a digestão dos alimentos, o controle da homeostase intestinal epitelial, desenvolvimento intestinal e da saúde humana [1 ]. Por outro lado, um grande corpo de evidência suporta uma relação entre os agentes infecciosos e cancros humanos [2] e sugere que certas espécies de bactérias associadas à mucosa desempenhar um papel importante na patogénese de cancro colo-rectal (CRC; [3], [4], [ ,,,0],5]. Além disso, as associações clínicas entre infecção bacteriana e CRC foram descritas por muitas décadas, a mais importante das quais infecções preocupação com

Streptococcus bovis

[6], [7] e

Clostridium septicum

[8] no entanto, a co-incidência destas infecções com CRC é muito baixa ( 1%).. uma vez que tais agentes patogénicos oportunistas baixo grau só pode tornar-se clinicamente manifesta em pacientes comprometidos Correspondentemente, os dados serológicos demonstraram um aumento da exposição

S. bovis

antigénios em pacientes estágio CRC início sem sinais clínicos de infecção bacteriana [9]. Com base nisto, foi sugerido que as bactérias do intestino específicos têm uma vantagem competitiva no microambiente CRC, ao passo que infecções oportunistas permanecem reprimido pelo sistema imune activo na maioria dos pacientes.

publicações recentes forneceram provas para mecanicista o envolvimento das bactérias intestinais no desenvolvimento de CRC, que compreende i), a produção de ADN de danificar os radicais superóxido, ii) produção de genotoxinas, iii) da indução dependente de células T auxiliares de proliferação celular, iv) Toll-like receptor mediada por indução de vias pró-carcinogénicas [10] – [14]. Apesar deste vasto corpo de evidências circunstanciais, no entanto, não existem dados clínicos têm sido até agora disponível para mostrar diretamente padrões de colonização de bactérias distintas em pacientes com CCR. De fato, a natureza molecular da comunidade intestinal complexo era muito pouco explorado antes do momento em que Eckburg e colaboradores [15] revelou a presença de espécies bacterianas -400 por sequenciação de sequências de genes de ARN ribossómico procariotas a partir de múltiplos locais de mucosa do cólon e fezes de indivíduos saudáveis . Outras investigações revelaram elevada variação intra- individual de microbiomas intestinais na população humana, enquanto que a colonização microbiana da mucosa dentro dos indivíduos adultos é relativamente estável ao longo do cólon [16] – [18]. Com base nas últimas observações Nossa hipótese é que a análise aprofundada de um número relativamente pequeno de amostras de tecidos emparelhados on /off-tumor de pacientes com CCR podia revelar espécies bacterianas que podem ser implicados na etiologia CRC. Para atingir este objetivo, foi utilizado profunda pyrosequencing de rRNA bacteriano para comparar microbiomes tumorais CRC ao de mucosa não maligno adjacente em seis pacientes. Os dados fornecidos a primeira imagem de alta resolução do microbioma humano CRC e mostrou que CRC está associado com mudanças bastante dramáticas na microbiota intestinal aderente.

Materiais e Métodos

Matéria Paciente

Seis pacientes (rotulados a-F, Tabela 1) foram submetidos a ressecções para adenocarcinoma de cólon primário na Universidade Radboud Nijmegen Medical Centre. Após a ressecção, os espécimes de cólon foram extensivamente lavados com água estéril após o que as amostras foram examinadas por um patologista oncológico. Doença foi encenada segundo a classificação tumor-nódulo-metástase (TNM) [19]. A partir de cada amostra de cólon, as biópsias foram retirados do local do tumor ( “on-tumor”, A

on-F

on) e a partir de tecido não maligno ( “off-tumor” adjacente, A

off -F

off) no lado luminal da parede do cólon (distância de cerca de 5-10 cm). Os espécimes de tecido foram rebentadas por agitação mecânica, após o que o ADN total foi extraído utilizando o kit de DNA /RNA AllPrep (Qiagen). Todas as amostras foram armazenadas a -80 ° C até o uso.

Ética Declaração

A pesquisa foi realizada de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. O estudo foi aprovado pela pela Comissão de Ética Médica do distrito de Arnhem-Nijmegen (Holanda); pacientes forneceram consentimento informado por escrito para a recolha de amostras e análise posterior, quando necessário.

desnaturação Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) e Ribossômico Intergenic Análise Spacer (RISA)

Usando DNA total a partir do 12 de cólon biópsias como um modelo, 16S rRNA genes foram amplificados por uma abordagem integrada [20] utilizando os iniciadores pares 27f /1492r [21] e L1401r /968f-GC [22], [23], em duas reacções de PCR subsequentes (Tabela S1) . DGGE foi realizada sobre a mistura de PCR resultante, tal como descrito anteriormente [24]. Deve notar-se que as bandas visíveis (ver Figura 1) representam espécies bacterianas que possuem uma grande quantidade de, pelo menos, 1-10% do total da comunidade, enquanto que baixas espécies abundantes não vai resultar em uma faixas detectáveis ​​por esta abordagem. Para confirmar os dados DGGE, regiões separadoras intergênicas ribossômicas bacterianas foram amplificados com iniciadores 1406f e 23Sr usando o mesmo DNA como modelo (Tabela S1; [24]). RISA foi realizada como descrito anteriormente [23].

Um fragmento interno (~450 pb) do gene de ARNr 16S bacteriano foi amplificado a partir de DNA extraído de tecido de cólon por um largo espectro abordagem de PCR após o que estas misturas amplicon foram aplicados a DGGE. As características dos pacientes podem ser encontrados na Tabela 1;

off

, o tecido não-malignas;

de

, tecido tumoral.

FLX 454 titânio pyrosequencing

Na segunda etapa da abordagem PCR nested, nós amplificado região V1-V3 da bacteriana gene 16S rRNA usando pares de primers marcados com 12 marcas distintas metagenoma IDentification (MID) (Tabela S1). 454 sequenciamento foi realizado na Universidade de Facility Genomics avançados do Liverpool. Sequências estão disponíveis mediante pedido.

Leia processamento e comunidade diversidade

Todas as sequências de genes 16S rRNA parciais foram processados ​​inicialmente usando o Pyro-gasoduto para o projeto de banco de dados ribossomal (RDP, [25] ; Solte 10) para cortar e remover iniciadores dos ribotags parciais e limitar sequências a 400 pb e = 500 bp, sequências foram processados ​​usando o comando pre.cluster que minimiza erros introduzidos pela plataforma pyrosequencing [26]. Este passo desde que os conjuntos de dados para análise (Tabela S2) com os histogramas de comprimento leitura mostrado na Figura S2

A

. Os dados de todas as amostras foram processadas usando MOTHUR [27] para gerar índices de diversidade, curvas de rarefação (Figura S2

B

) e realizar a análise Libshuff de similaridade amostra. MOTHUR foi executado usando as facilidades computacionais da Divisão de Pesquisa Avançada de Computação @ Cardiff (Arcca), Universidade de Cardiff. Comparações das bibliotecas de um indivíduo foi realizada utilizando Biblioteca da RDP comparar ferramenta. A análise dos ribotags também foi realizada utilizando MEGAN [28] para o qual a entrada era a saída CSV do gasoduto classificador da RDP (usando as configurações padrão e um nível de confiança de 50%). A ferramenta de comparação foi selecionado e lê normalizada entre amostras e correção de Bonferroni usados ​​para destacar as diferenças entre as amostras. Uma análise independente alinhamento da data também foi realizada utilizando 5-meros e análise de distribuição de freqüência paisagem (fLAND) [29] – [31]. A geração dos 5-meros foi realizada utilizando um script PERL bespoke (escrito por cama, disponível quando solicitado) e análise PCA foi realizado em MATLAB na Arcca, a análise fLAND foi realizada utilizando o software fLAND

Consistência. análise

enviesamentos na microbiota entre as amostras tumoral e sobre-off-tumoral em todo pacientes foram resumidos, de modo a identificar os taxa que foram consistentemente quer enriquecida ou consistentemente empobrecido nos dois nichos. Todos pyrosequencing lê foram primeiramente mapeado para a base de dados global de SILVA alinhados, qualidade verificada 16S /18S 300 NT (versão SSUParc_100; [32]), utilizando BLAT V34 com parâmetros predefinidos e pontos de corte [33]. Assumiu-se que cada leitura foi derivado a partir de um microrganismo diferente e que a amostragem de leituras representada a distribuição taxonómica dentro do microbiota intestinal. Para cada amostra, cada leitura foi atribuído à sua sequência mais semelhante na base de dados Silva e um resumo das anotações taxonómicas das sequências da base de dados detectados foi gerado. Cada clado taxonómico foi avaliada para determinar se ele mostrou uma fracção mais elevada de leituras em off-tumoral ou sobre-tumoral amostras para cada paciente, e uma pontuação de consistência foi calculado por contagem de “1” se o clado foi maior fora de tumor, ” -1 “se o clado foi maior no tumor, e” 0 “, se a fração de leituras dentro e fora do tumor foi idêntica (por exemplo, se o clado não foi medido neste paciente). Finalmente, essas pontuações foram somadas, resultando em uma pontuação de coerência global entre -6 e +6 que reflete o quão consistentemente o clade foi enriquecido ou empobrecido em todos os pacientes. Note-se que cada sequência no banco de dados SILVA tem duas anotações taxonómico, ou seja EMBL e RDP.

Resultados

DGGE fingerprinting

Como uma primeira exploração, perfis de 16S rRNA genes foram gerados utilizando DGGE para tumor e correspondentes mucosa adjacente não-maligna (off-tumoral) a partir de 6 pacientes de CRC (Tabela 1). Como mostrado na Figura 1, as comunidades microbianas do tecido tumoral e adjacente “off-tumor” mucosa eram notavelmente diferentes e foram obtidos resultados semelhantes quando RISA fingerprinting foi aplicado às mesmas amostras (Figura S1). Notavelmente, este resultado contrasta com as observações anteriores de que a microbiota da mucosa do cólon é quase idêntico em locais adjacentes em indivíduos saudáveis ​​[15], [16], [34] – [36]. Inspirado por esta observação marcante, o próximo apontado para uma abordagem microbioma seqüenciamento para mapear as mudanças microbioma em uma alta resolução em vez de sequenciamento de bandas distintivas individuais que representam apenas as espécies abundantes em uma determinada amostra.

FLX 454 titânio pyrosequencing

Para definir o microbioma tumor de cólon em um nível profundo, nós amplificado e sequenciado região V1-V3 dos genes 16S rRNA (Tabela S1), o que resultou em um total de 193,880 ribotags de comprimento 401 500 pb. Os dados mostraram valores elevados de cobertura ( 88%) e curvas de rarefação indicaram amostragem satisfatório das comunidades a 90% de identidade (Figura S2

B

; Tabela S2). Libshuff análise indicou que todas as comunidades dentro e fora do tumor foi significativamente diferente (p 0,0001) entre si (Tabela S3). É importante ressaltar que ambos os métodos de alinhamento-dependentes e independentes apoiaram a observação destes microbiomes tumorais alterados (Figura 2, Figura S2

C Comprar e

D

; Tabela S3). Além disso, enquanto DGGE e RISA mostrou apenas pequenas diferenças de paciente D, sutil, mas significativa, as diferenças puderam ser identificadas pela abordagem de sequenciação de profundidade. Este exemplifica claramente a resolução superior, que pode ser obtida com a última tecnologia. Os dados mostraram uma tendência geral de mais Bacteroidetes e Firmicutes menos a partir de tecido do tumor em comparação com correspondência off-tumor mucosa (Figura S3). No entanto, como seria de esperar os deslocamentos observados microbioma mostrou um elevado grau de variabilidade entre doentes (Figura S3A-F) e, em certos casos, foram mesmo contrariamente à tendência geral (Figura S3

L

). Embora

S. bovis

ou

C. infecções septicum

ter uma associação clínica conhecida com CRC, apenas muito poucas sequências mapeadas para rRNA destas duas espécies e não foi observada a colonização confiável de tecido CRC. Isto poderia ser explicado pelo fato de que tais agentes patogénicos oportunistas são predominantemente presente na fase transitória de adenoma CRC [37].

Os dados de sequenciação foram normalizados em 454 MEGAN (Huson et al., 2009) e analisada através do RDP ferramenta pyropipeline classificador (Cole et al. 2009) para gerar um arquivo CSV de abundância taxonômica. Este arquivo foi usado como entrada para MEGAN para visualizar em que as famílias diferenças entre o tecido não maligno (

off

-tumor) e tecido CRC (

de

-tumor) comunidades estão presentes. Uma imagem de alta resolução desta figura de “zoom-in” fins pode ser baixado a partir da Figura S2

E

.

Consistência análise

Para identificar o mais mudanças microbioma imperativas durante a formação do CRC, a consistência entre os pacientes foi calculado para cada taxon individualmente, dando-lhe uma pontuação de “-1” se o número normalizado de sequência lê desse taxon no tecido tumoral foi maior do que na correspondência off-tumoral mucosa, “1” se o taxon era mais abundante na mucosa sã e “0”, se não foi detectado em todos nesse paciente. Somando essas pontuações em todo pacientes resultou em uma pontuação de consistência de -6 a 6 para cada taxon (Tabelas 2 e S4, Figura S4

A

e

B

). Deve-se notar que algumas sequências são melhor anotado por EMBL do que pela RDP, e

vice-versa

(ver Figura S4C), de modo registramos em vez de confiar preferencialmente qualquer uma destas anotações taxonômicos. Esta abordagem mostrou que o tecido CRC foi consistentemente associada a sobre-representação da subclasse de

Coriobacteridae

, especialmente os gêneros

Slackia

e

Collinsella

, que pode ser considerado como comensais do intestino. Por outro lado, os membros da

Enterobacteriaceae

, como

Citrobacter

,

Shigella

,

Cronobacter

,

Kluyvera

,

Serratia

e

Salmonella spp

. (pontuação entre 4 e 6, Tabela 2; Figura S4

A

e

B) foram sub-representadas no tecido CRC. Embora estes resultados foram consistentes, a abundância relativa destes taxa difere consideravelmente entre ligado e desligado mucosa tumor dos pacientes investigados, conforme ilustrado na Figura 3.

Distribuição relativa do CRC selecionado acima /abaixo taxa representada foi calculada como a sequências fração anotada do número total de leituras em que a amostra específica. pontuação consistência para o taxon indicada (ver Tabela 2) é dado entre parênteses e reflete como consistentemente clades foram enriquecidos em toda pacientes A-F; barras verdes indicam a fração em

off

-tumor e barras vermelhas indicam fração deste taxon

de

-tumor.

Discussão

A observação mais marcante do nosso estudo foi a dramaticamente diferentes microbiomes no tecido CRC e mucosa não maligno adjacente em 5 dos 6 pacientes investigados. Para nossa surpresa, no entanto, não foi encontrada sobre-representação consistente de potenciais bactérias patogênicas no tecido CRC. Em contraste, as espécies sobre-representados membros preocupados do género

Coriobacteridae

,

Roseburia

,

Fusobacterium

e

Faecalibacterium

, que são geralmente considerados como comensais do intestino com características pró-bióticos. Isto sugere que as mudanças observadas microbianas são causadas pelas alterações fisiológicas e metabólicas bastante dramáticos que resultam de cólon em si carcinogénese [38] – [40], e que estas espécies podem ser considerados como passageiros CRC. De fato, estudos recentes revelaram metabolômica condições nutricionais extremamente alterados no microambiente tumoral CRC comparado a mucosa não-malignas [41]. Os achados mais proeminentes e consistentes em causa uma redução drástica na glicose e piruvato e um aumento na concentração de lactato (pH baixo), aminoácidos, lípidos e ácidos gordos. A variabilidade intra-paciente em alterações microbioma poderia refletir a variabilidade intra-individual no microambiente tumoral CRC [42], resultando no recrutamento preferencial de diferentes classes de espécies intestinais. Nomeadamente, a redução do número de

Collinsella

spp. e

Roseburia

spp. tenham sido previamente encontrados em indivíduos idosos que usam drogas não esteróides anti-inflamatórios em comparação com os não-usuários (AINE [43];. sugerindo que essas bactérias precisam nichos inflamatórios para otimizar a colonizar a parede do intestino Curiosamente, os gêneros

Roseburia

,

Fusobacterium

e

Faecalibacterium

, que são moderadamente enriquecido em tumores pertencem ao grande butirato produzindo bactérias intestinais. butirato é pensado para ser protetor de encontro ao CRC induzindo uma paragem do ciclo celular dependentes de p21 resultando num aumento da taxa de apoptose das células cancerígenas [44]. os efeitos de butirato são no entanto ainda sob debate como a inibição do tumor pode por exemplo ser restrita às fases iniciais da carcinogénese. marcadamente, demonstrou-se que

Faecalibacterium prausnitzii

segrega factores anti-inflamatórios que bloqueiam a activação do NF-kB e a produção de IL-8 em um modelo animal experimental para a doença de Crohn [45]. Além disso, os pacientes com doença inflamatória do intestino, que estão em risco aumentado de CRC, têm sido associadas com números mais baixos de

F. prausnitzii

na população intestinal [46]. Finalmente,

Slackia

spp. são conhecidos para converter as isoflavonas na dieta em anti-oxidantes mais potentes [47], capazes de induzir vias apoptóticas em células tumorais [48]. Assim, em vista dos nossos dados actuais, que se poderia tirar a conclusão de que o microambiente do CRC é preferencialmente colonizada por bactérias intestinais com propriedades anti-tumorigénica e anti-cancerígenas, que, assim, podem impedir a progressão rápida da doença. No entanto, também se pode argumentar que por exemplo butirato proporciona uma fonte adicional de energia para as células tumorais, ao passo que a resposta inflamatória amortecimento pára o sistema imune inato de atacar o tumor incipiente. Assim, tanto supressores de tumor ou cenários promotores de tumor pode ser possíveis resultados da colonização diferencial de tecido CRC e, ainda, investigações detalhadas, serão necessários para elucidar esta questão.

Outra observação notável em causa a presença diminuída de membros

Enterobacteriaceae

, como

Citrobacter

,

Shigella

,

Cronobacter

,

Kluyvera

,

Serratia

e

Salmonella spp

. em tecido de tumor de pacientes de CRC investigados. Estes dados podem sugerir que estas bactérias são parte da microbiota intrínseca de pacientes de CRC, mas outcompeted pelas bactérias comensais-Como mencionado anteriormente, mediante a progressão da doença. Embora percebemos que, na ausência de um grande banco de dados de referência de microbiomes mucosas de indivíduos saudáveis, é difícil tirar conclusões sobre esta observação, gostaríamos de aproveitar a oportunidade para rever em breve porque a colonização intestinal Enterobacterial pode ser associado com um risco aumentado para CRC. Em primeiro lugar, os estoques metagenomic do microbioma intestinal humano mostrou que

Salmonella

,

Citrobacter

, e

Cronobacter

estavam entre as espécies intestinais abundantes baixas ou foram mesmo completamente ausentes em indivíduos saudáveis [15], [49], que é totalmente em linha com seu caráter patogênico [50]. Contrariamente, essa família bacteriana foi detectável presente em amostras de mucosa do cólon não-malignas de pacientes de CRC [36], enquanto Shen e colegas demonstraram recentemente que

Shigella spp

exibida uma maior abundância na microbiota intrínseca (não-maligna) de adenoma pacientes [51]. Mais importante, o potencial de enterobactérias para iniciar CRC já foi demonstrado para

Citrobacter

espécies em um modelo animal [52], e acredita-se que este aumento da susceptibilidade para CRC é causada por uma assintomáticos, mas crónica, inflamatória resposta na mucosa do cólon [53]. Além disso, várias cepas de enterobactérias produzir DNA danificando genotoxinas [54] e pode, assim, contribuir activamente para a acumulação de mutações que caracterizam a sequência adenoma-carcinoma [55]. Neste contexto, os nossos dados podem sugerir ainda que mediante a progressão CRC, as mudanças microambiente do tumor, de tal forma que enterobactérias são substituídas por espécies comensais-like ou bactérias com propriedades probióticas propostas que aumentaram o acesso e /ou pode de forma mais eficiente de forragem em o microambiente do tumor alterada. O desaparecimento do CRC-condução bactérias patogênicas de tecido avançada tumor CRC pode ser análoga ao que foi relatado por

Helicobacter pylori

durante a progressão do cancro gástrico [56].

Ao todo, o nosso estudo fornece uma importante primeiro vislumbre do microbioma CRC-associados e indica uma relação altamente dinâmica entre bactérias intestinais e desenvolver tumores. No entanto, muitas questões em aberto devem ser abordadas em estudos futuros, incluindo a análise microbioma profunda de grupos alargados de amostras de tumores de diferentes fases da doença, incluindo adenomas e biópsias de um grande conjunto de pacientes não-cancerosas para servir como base de referência. Além disso, para fins de diagnóstico, será importante para investigar como as mudanças microbioma associados a tumores locais referem-se à composição da microbiota fecal [57]. Uma análise mais detalhada de CRC (meta-) genomas bacterianos e transcriptomes é necessária para identificar os genes que causam a colonização diferencial no microambiente tumoral e para definir melhor as populações microbianas de alto risco. Posteriormente, populações bacterianas de alto risco e de baixo risco devem ser validados em modelos (animais) para CRC esporádica, e os mecanismos de interferência bacteriana no CRC tem que ser desvendado em mais detalhes. All-in-tudo, este define a agenda para uma nova era emocionante na pesquisa do câncer colorretal, integrando microbiologia e ecologia microbiana com a biologia do tumor. Isso nos levará para uma maior compreensão das forças motrizes da CRC, bem como novas ferramentas de diagnóstico relacionados com o microbioma e intervenções terapêuticas.

Informações de Apoio

Figura S1.

RISA fingerprinting de tecido CRC e mucosa adjacente não-malignas. A região espaçadora intergénica entre os genes 16S e 23S foram amplificados com os pares de iniciadores conservados (Tabela S1) e analisados ​​utilizando um Agilent Bioanalyzer. As características dos pacientes podem ser encontrados na Tabela 1; off de tecidos, não-malignas; em, tecido tumoral

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020447.s001

(PDF)

Figura S2.

A

, Leia comprimentos por amostra, com X

off e X

em vir a partir de amostras fora do tumor e on-tumor no assunto X, os dados foram derivados dos comprimentos de leitura pós-processamento através do pyropipeline RDP.

B

, curvas Rarefraction para cada amostra, a chave da amostra é a mesma como para uso Figura S1. Estas curvas foram geradas usando MOTHUR, cortou valores são mostrados.