Abstract

Efeitos de promover câncer e anti-câncer bidirecionais de arsênico para as células cancerígenas foram reveladas em estudos anteriores. No entanto, cada um destes efeitos (promoção do cancro, ou anti-cancro) foi encontrado nas células diferentes em diferentes tratados com concentrações de arsénio. Neste estudo, pela primeira vez, indicaram que o arsênico na concentração de 3 mM, igual à concentração média na água potável em áreas câncer-propensos em Bangladesh, expressa simultaneamente os seus efeitos bidirecionais em células HSC5 humanos carcinoma de células escamosas com vias distintas. O tratamento com 3 uM de arsénio promovido invasão celular através de regulação positiva da expressão de MT1-MMP e regulação negativa da expressão de p14ARF e, simultaneamente, induzida apoptose celular através da inibição da expressão de N-caderina e aumento da expressão de p21 (WAF1 /CIP1), tanto a transcrição e os níveis de proteína em células HSC5. Nós também mostraram que a inibição da expressão MT1-MMP por NSC405020 resultou em diminuição da invasão mediada por arsénico de células HSC5 envolvendo diminuição de quinases reguladas por sinais extracelulares fosforilada (pERK). Tomados em conjunto, os nossos resultados biológicos e bioquímicos sugeriram que o arsénio expressa efeitos bidirecional como um carcinogéneo e um agente anti-cancro nas células HSC5 humanas de carcinoma de células escamosas com vias distintas. Nossos resultados podem desempenhar um importante evidente científica de mais estudos para descobrir uma maneira melhor no tratamento de cancros induzidos por arsênico, especialmente no carcinoma de células escamosas

Citation:. Thang ND, Yajima I, Kumasaka MY, Kato M (2014) funções bidirecionais de arsênico como uma substância cancerígena e um agente anti-cancro em humanos carcinoma espinocelular. PLoS ONE 9 (5): e96945. doi: 10.1371 /journal.pone.0096945

editor: Shrikant Anant, Universidade de Kansas School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de fevereiro de 2014; Aceito: 13 de abril de 2014; Publicado em: 09 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Thang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa é financiado pela Fundação Nacional do Vietnam para a Ciência e Tecnologia para o Desenvolvimento (NAFOSTED) sob o número de concessão de 106 NN.02-2013.07. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a contaminação por arsênico em beber água de poço é um grave problema de saúde pública no mundo [1], [2]. O arsênico é um carcinogéneo humano bem documentado. exposição de dose baixa crónica de arsénio causada descoloração da pele, indigestão crónica, hipertensão, doença vascular periférica, doença cardíaca isquémica, e diversos tipos de cancros, incluindo a pele, pulmão, bexiga, fígado e cancros do rim [3]. Efeitos de arsénio como um agente para a carcinogénese ou a progressão do tumor ou um fármaco anti-tumor depender da sua concentração [4] – [6], a duração da exposição [6], [7] e de células de cancro tipos de [3] – [7] . Previous estudos animais radiográficos mostraram que o carcinoma de células escamosas cutâneas (SCC) é um dos cancros representativos mediada por arsénio [8]. Embora o arsénio tem sido amplamente reconhecido como um carcinogéneo, também tem sido utilizado clinicamente como um agente quimioterapêutico eficaz no tratamento de leucemia nos seres humanos [9]. Arsénio também expressou seus efeitos anti-câncer em vários cancros sólidos, incluindo carcinoma cutâneo, através da promoção de morte apoptótica celular [10], [11]. Os efeitos promover câncer e anti-câncer bidirecionais de arsênico em células cancerosas têm levado a uma situação difícil para esclarecer o mecanismo de cancro mediada por arsênico. Embora houvesse muitos estudos sobre revelando o mecanismo de efeitos do arsénio em células cancerosas, ainda não está claro.

detenção do ciclo celular e apoptose estão relacionadas à morte celular e devem ser considerados como aspectos importantes para o câncer tratamento [12] – [15]. Estudos anteriores mostraram que o arsénio induz a apoptose em células cancerosas através da activação da expressão de supressores de tumores de p21 (WAF1 /CIP1) e p14ARF (p19ARF no rato) [12] – [15]. p21 (WAF1 /CIP1) e p14ARF desempenham papéis importantes no controlo da paragem do ciclo celular através da regulação da actividade de ciclinas e quinases dependentes de ciclina (CDK) [16] – [19]. p21 (WAF1 /CIP1) e p14ARF são capazes de inibir o crescimento celular através de paragem do ciclo celular de células de cancro da pele, incluindo melanoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células basais [20] – [24]. Outros relatórios revelaram que a exposição a transformação celular causa arsênico através da inibição de ambos expressão da proteína e do gene da supressores de tumor p19ARF [22] – [24].

Invasion é marca do salão para grau de malignidade das células cancerosas. Relata-se que o arsénio reduz as propriedades invasivas e metastáticas de células tumorais de glioma através da inibição da activação de metaloproteinase de matriz-14 (MT1-MMP) [7], [25], que é capaz de dirigir a invasão de células cancerosas, em grande parte através da degradação de ECM barreiras. MT1-MMP, também é considerado um montante de ERK. ERK é uma molécula-chave nos principais cassetes de sinalização da via de proteína cinase activada por mitogénios [26],. ERK desempenha um papel importante no desenvolvimento do cancro, [26], [27]. Assim MT1-MMP pode ser capaz de regular o nível de fosforiladas ERK [26], [27]. No entanto, nos outros estudos, de alta concentração de arsénio aumenta a expressão MT1-MMP em células de fibroblastos [28] – [30]. Estudos anteriores também relataram que o arsênico reduz a expressão de E-caderinas [31], [32]. Regulação negativa de E-caderina está correlacionada com a regulação positiva de N-caderina, uma molécula de promotor invasão [33] -. N-adesão dependentes de caderina prejudica a regulação positiva da p21 inibidor de quinase dependente da ciclina [37], [38]. A expressão ectópica de N-caderina aumenta a motilidade celular tumor [35], [39].

O nosso relatório anterior mostrou que há cerca de 3 m (210,7 mg /L) de arsênico na água potável bem-poluída arsénio (n = 72) em áreas câncer-propensos em Bangladesh [40]. Existem muitos tipos de cancros, incluindo carcinomas de células escamosas (SCC) que ocorrem nessas áreas [40]. Neste estudo, pela primeira vez, mostrou que o arsénio na concentração de 3 mM atuam simultaneamente como o cancro-promotor e droga anti-câncer em células HSC5 humanos carcinoma de células escamosas com vias distintas.

Materiais e Métodos

Reagentes

arseneto de sódio (arsênico) foi adquirido de Sigma. NSC405020 foi adquirido da Millipore. Arsénio foi dissolvido em água para utilização. NSC405020 foi dissolvido em DMSO para uso.

cultura celular

queratinócitos humanos transformados HSC5 células [40] (Ciências da Saúde de Recursos de Investigação do Banco, Japão) foram cultivadas em meio RPMI-1640, suplementado com 10% soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO2.

cristal violeta ensaio

ensaio de violeta cristal foi efectuada utilizando o método anteriormente descrito [40]. Resumidamente, as células (3 x 10

4 células) foram plaqueadas em placas de seis poços e cultivadas durante 24 h. As células foram então tratadas com arsénio e cultivadas durante mais 3 dias. As células aderentes viáveis ​​foram fixadas com formalina a 10% e coradas com violeta de cristal a 0,1%. A absorvância a 595 nm de células coradas solubilizado com 0,1% de SDS foi medido utilizando um leitor de microplacas.

ensaio de invasão

capacidade celular invasão foi avaliada por ensaio de invasão de acordo com o método relatado anteriormente [41 ]. Resumidamente, 2 × 10

5 as células em meio de cultura de 300 ml com 0,5% de FBS foram aplicados à câmara superior revestida de matrigel de 8 mm de diâmetro (8 mm de tamanho de poro). Em seguida, as câmaras superiores foram colocadas em placas de cultura de 24 cavidades contendo 600 ml de meio condicionado com FBS a 0,5% para desencadear a actividade invasão e foram incubadas durante 12 horas. células invasoras foram coradas com hematoxilina-eosina ou violeta de cristal e contadas sob um microscópio.

análise por PCR em tempo real

O ARN total foi preparado a partir de amostras de linhas de células utilizando um kit de ARN alta Pure (Roche Diagnostics) de acordo com o método anteriormente descrito [41]. O ADNc foi então sintetizados por transcrição reversa de RNA total usando Super-criptTMIII transcriptase inversa incluída na mistura de enzima RT e RT mistura reaccional de acordo com o protocolo previamente descrito [41]. Em tempo real quantitativa de RT-PCR com SYBR Green foi realizada usando energia verde SYBR1 PCR Master Mix (Applied Biosystems) em um sistema de detecção de sequência ABI Prism7500 (Applied Biosystems). Os níveis de expressão de p14ARF, p21 (WAF1 /CIP1), MT1-MMP e transcritos de N-caderina medido por RT-PCR quantitativo (real-time PCR) foram ajustados através do nível de expressão do transcrito de TATÁ de ligação caixa de proteína (TBP) . A PCR foi realizada usando 10 ml de poder SYBR1 verde PCR mestre Mix (Applied Biosystems), contendo 900 nM de iniciador de sentido directo e 900 nM de iniciador de sentido inverso, num volume final de 20 ml. Sequências de iniciadores são apresentados como abaixo:

Forward: GTGGTCTCGGACCATGTC

e Reverso: GTAGCCATATTGCTGTAGCC para MT1-MMP

Para a frente:. ATTGCTGTTTTGGACCGAGA

e Reverse: CACTTGAGGGGCATTGTCAT para N-caderina

para a frente:. AAGTCAGTTCCTTGTGGAGC

e reverso:. ATTAGCGCATCACAGTCGCG para p21 (WAF1 /CIP1)

Forward: ATGGTGCGCAGGTTCTTGGT

e reverso : TGCCCATCATCATGACCTGG para p14ARF

para a frente:. CACGAACCACGGCACTGATT

e Reverso:. TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC para TBP

análise Immunoblot

a análise de imunotransferência foi realizada de acordo com o método descrito anteriormente [42]. primeiro coelho policlonais Os anticorpos contra fosforilada treonina 202 de ERK1 e tirosina fosforilada 204 em ERK2 (Cell Signaling), anti-metaloproteinase de matriz-14 (MT1-MMP) dobradiça de anticorpos região (Millipore), a ERK1 /2 (Cell Signaling), anticorpos policlonais de cabra contra p14ARF e p21 (WAF1 /CIP1) (Santa Cruz), anticorpo monoclonal contra a N-caderina (

BD

Biosciences) e anticorpo monoclonal contra a alfa-tubulina (SIGMA).

estatística análise

a análise estatística neste estudo foi realizado de acordo com o método descrito anteriormente [40]. Os resultados de três experiências independentes em cada grupo foram analisados ​​estatisticamente pelo teste t de Student. A SPSS (versão 18) pacote de software (SPSS Japan Inc.) foi utilizada para estas análises estatísticas, eo nível de significância foi fixado em p . 0,05

Resultados

Arsénio apoptose induzida de HSC5 células

O nosso trabalho de campo anterior mostrou que a concentração de arsênico na água potável contaminada com arsénico em áreas câncer-propensos em Bangladesh é de cerca de 3 m (210,7 mg /L) [40]. No entanto, não é um facto que é difícil identificar o efeito do arsénico no desenvolvimento do cancro [3] – [11], portanto, nós decidimos investigar os efeitos de arsénio na apoptose de células HSC5. HSC5 células foram tratadas com o arsénio, a 0, 1,0, 3,0, 5,0 e 10,0