Abstract

(GnRH-R) os níveis têm: Efeitos sobre a GnRH receptores das células do cancro da próstata leuprorrelina Acetato de Longa Duração foi demonstrado que tem uma grande influência sobre a extensão da inibição de crescimento de tumor mediada por agonista de GnRH. A capacidade do acetato de leuprorelina agonista da GnRH (LA) para induzir uma supra-regulação pós-transcricional da GnRH-I na membrana plasmática de células andrógeno-sensível (LNCaP) e -insensitive (PC-3) do cancro da próstata (CaP) tem sido previamente demonstrado por transferência de Western. Aqui foi realizada espectroscopia de força única molécula, utilizando microscopia de força atómica (AFM), que provou ser uma ferramenta poderosa que permite a investigação de funções biológicas da superfície da célula viva, tal como a interacção agonista /receptor de GnRH até agora claro. Assim, nas células PC-3-hormonais insensível, que caracterizou a força da ligação LA-receptor, e a quantidade e distribuição das moléculas de receptor funcional na superfície da célula. O efeito de um tratamento de longa e contínua (até 30 dias), com o agonista de (10

-11 e 10

-6 M) sobre os mesmos parâmetros também foi investigado. Observou-se um aumento da GnRH-I, atingindo o valor máximo (~ 80%) após 30 dias de tratamento com a dose mais elevada de LA (10

-6 M). O aumento induzido por análogo de GnRH-R também foi demonstrado por transferência de Western. Além disso, duas dosagens diferentes de receptores ligados foram detectados por AFM, o que sugere a existência de duas classes de GnRH-I. Uma distribuição homogénea dos eventos unbinding foi encontrado nas superfícies das células PC-3 não tratados e tratados. A persistência de níveis elevados do receptor na membrana destas células vivas podem garantir a manutenção da resposta a LA também em CaP-andrógeno não responde. Além disso, a determinação da força de ligação ligando /receptor poderia lançar luz sobre o evento mal compreendida de LA /GnRH-R interação e /ou o endereço otimizações /agonistas química estruturais

Citation:. Lama G, Papi M, Angelucci C, Maulucci G, Sica G, de Spirito M (2013) leuprorrelina Acetato de longa duração Efeitos sobre a GnRH receptores das células do cancro da próstata: Um Estudo de microscopia de força atômica de Agonist /Receptor Interação. PLoS ONE 8 (1): e52530. doi: 10.1371 /journal.pone.0052530

editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Itália |

Recebido: 29 Dezembro, 2011; Aceito: 19 de novembro de 2012; Publicação: 09 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lama et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Takeda Italia Farmaceutici SpA parcialmente financiado este trabalho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Em 2010, a Takeda Italia Farmaceutici SpA deu aos autores uma doação voluntária para apoiar a investigação científica de seu Instituto, não especificamente relacionado a este trabalho. Os autores indicaram o nome da empresa na justiça. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

O hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), um decapéptido segregado em uma forma pulsátil por neurônios do hipotálamo, controla a síntese de gonadotrofina e solte ativando (receptores de GnRH de tipo I-R), expresso em células da pituitária anterior. A infra-regulação e dessensibilização desses receptores hipofisários por administração contínua de GnRH análogos agonistas representam a justificativa para o uso clínico destes hormônios na terapia de cancros relacionados com o sistema endócrino, uma vez que leva à supressão esteróide gonadal [1] – [3]. A descoberta de expressão do GnRH /GnRH-I nestes tumores, bem como em tecidos não malignos [4] – [7], divulgada a possibilidade de as células de tecidos extrapituitário para ser directamente afectadas por análogos de GnRH. Diferentes estudos demonstraram o efeito inibidor dos agonistas da GnRH sobre o crescimento de vários tumores, incluindo o cancro da próstata (CaP) células [6], [8] – [14]. No entanto, alguns autores relataram que os agonistas de GnRH são ineficazes quando utilizados sozinhos enquanto contrariar ou mesmo suprimir hormonas ou proliferação celular estimulada por factor de crescimento [15] – [19]. Além disso, eles demonstraram que estes compostos são capazes de modular a expressão de PSA, bem como a expressão de vários genes /proteínas que regulam o crescimento e diferenciação, apoptose ou /adesão celular de células [20] – [23]. Mais recentemente, os efeitos do análogo de GnRH agonista acetato de leuprorelina (LA) sobre a expressão da GnRH-I foram investigadas por transferência de Western em duas linhas celulares de CaP humanos: as, células LNCaP sensíveis-andrógenos bem diferenciadas e baixos invasivos e o androgénio PC-3 células -insensitive, pouco diferenciadas e altamente invasivos [24]. Nestes dois modelos, o análogo em ambas as concentrações baixas e altas é eficaz na indução de um aumento pós-transcricional da expressão do receptor ao nível da membrana do plasma, depois de 4, 6 e 12 dias de tratamento contínuo.

o aumento na disponibilidade de receptor na superfície celular pode ser um problema terapêutico relevante uma vez que pode justificar a manutenção da resposta à terapia agonista [25]. Além disso, pode permitir o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, o que é particularmente importante para aqueles tumores que ou não respondem ou desenvolver resistência à terapia endócrina. Na verdade, mesmo que seja extremamente difícil prever o comportamento das células CaP

in vivo

, é presumível que, mesmo em hormona de responder APC, a administração agonista pode fornecer um resultado benéfico também devido ao efeito direto .

no presente trabalho, foi realizada a única força espectroscopia de molécula por meio de microscopia de força atômica (AFM), com o objetivo de caracterizar a força da ligação LA-receptor, e a quantidade e distribuição do receptor funcional moléculas na superfície das células andrógeno-indiferente PC-3. Nós também demonstrado o efeito de um tratamento de longo e contínuo com o agonista sobre os mesmos parâmetros. AFM, de facto permite a detecção de mudanças dinâmicas nas propriedades mecânicas da superfície célula viva [26], [27], bem como as medidas em ar ou fluido de amostras biológicas não coradas e não revestidos em ambientes controlados e em uma resolução nanoescala [28] – [31], sem a necessidade de qualquer tratamento especial que pode resultar na destruição de células ou alteração. Além disso, única espectroscopia de força molécula oferece uma oportunidade única para detectar o reconhecimento molecular entre ligantes e receptores individuais. Uma vez que a persistência de níveis de receptor de alta na membrana plasmática após um tratamento relativamente longo e contínuo com agonista de GnRH pode melhorar a eficácia de LA em androgénio-insensível APC, foi investigado o efeito do agonista a concentrações altas e baixas em células PC-3 por até 30 dias. informações intrigantes sobre a interação do receptor agonista de GnRH, até agora pouco claro pode derivar do estudo da força para que ocorra tal ligação e abordar otimizações /químicas estruturais do analógico.

Materiais e Métodos

celular linhas e condições de cultura

As células PC-3 hormônio-insensitive humanos [32] foram gentilmente doados pelo Prof F. Labrie (Universidade Laval, Quebec, Canadá). As células foram rotineiramente cultivadas em 25 cm

2 frascos de cultura de células em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Euroclone SpA, Milão, Itália), suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS, Euroclone), antibióticos (100 IU /ml penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, Euroclone), solução 10 mM de tampão Hepes (Euroclone), piruvato de sódio 1 mM (Euroclone) e 2 mM de L-glutamina (Euroclone).

As células embrionárias de rim humano (HEK293 ) não expressar qualquer endógena GnRH-R foram gentilmente cedidas pelo Prof RP Millar (Reprodução Humana Sciences Unit Medical Research Council, Instituto de Pesquisa médica da rainha, Edimburgo, Reino Unido), que os obtidos a partir de American Type Culture Collection Tissue. células HEK293 transfectadas estavelmente com GnRH-R (HEK293

[SCL60]) eram um presente de Prof. R. P. Millar e foram gerados em seu laboratório [33].

[SCL60] células HEK293 e HEK293 foram utilizados como controle negativo e positivo para a expressão GnRH-R, respectivamente. As células foram cultivadas em DMEM, suplementado com FBS a 10%, antibióticos (100 IU /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina), solução de tampão Hepes 10 mM, piruvato de sódio 1 mM e 4 mM de L-glutamina.

todas as linhas celulares foram incubadas numa atmosfera humidif içada de 5% de CO

2-95% de ar a 37 ° C.

tratamentos com células

as células foram semeadas a uma densidade de 25.000 células /ml de meio de cultura padrão em placas de 40-mm TPP (tecno Plastic Products AG, Trasadingen, Suiça). Uma vez que aderiram às placas de cultura (após 24 h), o meio foi renovado com meio DMEM suplementado com tratados com carvão a 5% de FBS (CH-FBS) e 10

-6 M ou 10

-11 M LA ( gentilmente doado pela Takeda Pharmaceutical Company Limited, Osaka, Japão).

O meio foi trocado a cada 48 h, enquanto a LA foi adicionado diariamente para as culturas. PC-3 células foram expostas ao analógico para 6, 12, 18, 24 e 30 dias.

cada seis dias, as células foram tripsinizadas, semeadas (25.000 células /ml) em pratos de 40 mm TPP e , uma vez que adere às placas de cultura, tratada tal como descrito acima por mais um período de 6 dias. No final de cada período de tratamento, as células foram analisadas por AFM. Em todas as experiências, culturas de controlo foram executadas em paralelo.

Microscopia de Força Atômica (AFM)

Todas as medições foram realizadas por meio de um microscópio de força atômica

Nanowizard II

( JPK Instruments, Berlim, Alemanha), combinada com um microscópio óptico

Axio Observe

(Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Todas as aquisições foram cumpridas em uma solução PBS (pH = 7,4), sob uma temperatura controlada de 37 ° C.

Probe Preparação AFM

A fim de investigar interações específicas entre LA e GnRH- R na superfície de células PC-3, as moléculas analógicos foram imobilizados sobre pontas de AFM. Retangulares suaves microcantilevers de nitreto de silício com dicas ultrasharp cônicas com um raio de ~ 10 nm revestido em ambos os lados com ouro (CSC16, MicroMash, San Jose, CA) e calibrado conforme relatado por Papi et al. [34] foram usadas.

Antes da imobilização, microcantilevers Lavaram-se em clorofórmio para remover óleos e os contaminantes brutos e, em seguida, expostas durante 20 min a um aspirador de UV-ozono, de modo a remover contaminantes da superfície e outros orgânicos oxidáveis.

o processo de imobilização molécula análogo, um método utilizado frequentemente para a funcionalização ponta com uma molécula de ligando [35], baseia-se na utilização de um 8 nm reticulante longo flexível (piridil ditio-polietilenoglicol-succinimidilpropionato, PDP PEG-NHS, Polypure). O cantilever limpo foi imediatamente imersos numa solução de PDP-PEG-NHS /clorofórmio durante 3 horas (concentração de ligante: 2 mg /ml) e, em seguida, depois de duas etapas de lavagem em clorofórmio e uma em PBS, tratada com uma gota de solução de LA ( 2 mg /ml) durante a noite.

Após a funcionalização, consolas foram exaustivamente lavadas três vezes em solução tampão e em seguida armazenado a 4 ° C, sob condições estéreis, para utilização posterior nos ensaios. tempo de armazenamento foi sempre 1 semana. foi observada qualquer alteração significativa na interacção LA /GnRH-R durante este período. Antes de ser utilizada, a constante de cada cantilever primavera foi calibrado usando o método térmico [36].

Força Atômica Espectroscopia

Para explorar interações moleculares individuais, o processo de dissociação de um ponta- ligando ligado a partir de um receptor de superfície celular ligado foi estudada através da aplicação de uma força de tracção para o complexo ligando-receptor até que a ligação entre ligando e receptor quebrou. forças de interação de ligantes ligados a ponta e receptores imobilizados superfície foram medidos em ciclos de força de distância. Numa posição fixa, a ponta foi abordado para a superfície da célula e, em seguida, retirado após um determinado intervalo de tempo (0,5 s), enquanto que foi observada a flexão do braço de suporte. Durante este ciclo, a dobragem do braço de suporte, a qual é proporcional à força, foi continuamente medida e representada graficamente em função de separação da ponta da superfície (isto é, distância). Duas curvas representativas força-distância são relatados na Fig. 1, quando interacções ligando /receptor não são detectados (quadrado preto) e quando uma interacção ligando /receptor é detectado (círculos vermelhos). No início da abordagem de ponta da superfície, a deflexão cantilever permanece zero. Após o contacto da ponta da superfície, o braço de suporte se dobra para cima, consistente com uma força repulsiva que aumenta com o recuo. Subsequente retracção da ponta da superfície (Fig. 1) em primeiro lugar leva ao relaxamento da deformação do cantilever até que a força repulsiva cai para zero. Após nova retracção, se a interacção entre o ligando e o receptor ocorre, o braço de suporte se inclina progressivamente para baixo, o que reflecte uma força atractiva que sobe com o aumento da separação da superfície da ponta (Fig. 1, círculos vermelhos). Em cada experimento, para cada ponto de tempo, foram realizadas ~1000 força-distâncias curvas.

Duas curvas típicas vigor distância quando as interações não são detectados (quadrado preto) e quando as interações são detectadas (círculo vermelho). O evento unbinding (ou ponto de ruptura) é destacada por meio da seta verde.

fracções enriquecidas com membrana plasmática análise Western blot

foram preparados a partir de 6 dias de cultura PC-3 ,

[] SCL60 células HEK293 e HEK293, de acordo com o protocolo relatado por Limonta et ai. [37]. O mesmo procedimento foi usado em células PC-3 não tratados ou tratados com LA (10

-6 M ou 10

-11 M) para 6, 12, 18, 24 e 30 dias. As amostras foram homogeneizadas em Tris-HCl a 10 (pH 7,6) contendo ditiotreitol 1 mM em gelo. Os homogenatos foram centrifugados duas vezes durante 10 minutos cada em 800

g

para remover os restos celulares e os sobrenadantes resultantes foram centrifugadas a 18.000

g

para sedimentar as fracções de membrana. Os sedimentos foram solubilizados em tampão RIPA [Tris-HCl 50 (pH 7,7), NaCl 150 mM, 0,8% de Triton X-100, 0,8% desoxicolato de sódio, 0,08% de SDS, 10 mM de EDTA, 100 ^ M de Na

3VO

4, NaF 50 mM, PMSF 0,3 mM e 5 mM de ácido iodoacético]. As amostras de proteína (100 ug /pista) foram sujeitas a electroforese num gel de poliacrilamida a 10% sob condições redutoras. As proteínas foram então electrotransferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA, EUA) que foi sondada (durante a noite, 4 ° C) com o anticorpo monoclonal de ratinho anti-GnRH-I (Laboratório de Visão Corporation, Fremont, CA, EUA) (1:100) em TBS contendo 0,02% de Tween 20 (TBS-T) e 5% de leite magro seco (tampão de bloqueio). O blot foi então coberta com o anticorpo secundário marcado com HRP (Vector, Burlingame, CA, EUA; 1:5,000) durante 40 minutos em tampão de bloqueio à temperatura ambiente. As bandas de proteína foram detectadas usando um sistema de quimioluminescência amplificada (ECL, Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) e visualizadas em Hyperfilm ECL (Amersham). As membranas foram sondado com um anticorpo anti-actina β mAb (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA; 1:10,000) como um controlo interno para a carga de proteína. Os sinais foram quantificados por densitometria (Documentação Doc System /Quantidade software Uma quantificação Chemi, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). unidades densitométrico de a proteína de interesse foram então corrigidos para as unidades densitométricas de β-actina. A proporção específica de proteína /β-actina a partir de cada amostra tratada foi dividida pelo valor obtido sob condições de controlo para se obter a mudança vezes no nível de GnRH-I.

A análise estatística

Os dados foram analisados ​​pela ANOVA de uma via seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

GnRH-R quantificação e força obrigatório em células não tratadas PC-3

Na Fig.. 2A uma distribuição representativa dos eventos unbinding (ciclos ~1000 força distância a uma velocidade de 2 m /s) obtida em células PC-3 não tratadas depois de 6 dias é mostrado. A distribuição bimodal é caracterizada pela presença de dois, picos bem evidentes, cada recuperado por um ajuste de Gauss. O primeiro pico (linha roxa) foi detectado com uma força inferior (f~37 PN), enquanto o segundo (linha verde), a uma força superior (f~65 PN). A presença destes dois picos sugere a existência de dois interacções distintas. A partir da distribuição bimodal, uma probabilidade unbinding geral (isto é, a probabilidade de gravar um evento unbinding partir de uma única curva força-distância) de cerca de 13% foi obtida (Fig. 2A, linha azul). A distribuição bimodal em conjunto com a probabilidade unbinding não se alterou durante até 30 dias (dados não mostrados).

Distribuição de eventos unbinding obtidos a uma taxa de carga de 2 m /s em não tratadas (A) e LA ( 10

-6 M) tenha sido tratada com (B) células células após 30 dias de cultura e em HEK293

[SCL60] PC-3 (C). Frequência corresponde ao número de eventos. Em ambas as células não tratadas e tratadas com LA PC-3 uma distribuição bimodal (linha azul) é claramente detectado e quantificado por meio de duas curvas de distribuição de Gauss (roxo e verde linhas a tracejado). O primeiro pico foi detectado, a uma força inferior (f~37 PN) enquanto que a segunda, a uma força mais elevada (f~65 PN). Em HEK293

[SCL60] células eventos unbinding em forças superiores são menos frequentes.

Para avaliar a quantidade de possíveis eventos unbinding não específicos que ocorrem devido ao processo de ponta a funcionalização específico e a sensibilidade do a nossa abordagem, realizamos os mesmos experimentos de espectroscopia vigor em HEK293 e HEK293

[SCL60] células. Como esperado, em células HEK293 tipo selvagem muito poucas interações ponta /amostra foram encontrados (~ 3%). Pelo contrário, na GnRH-R-expressando HEK293

[] SCL60 células várias interacções ponta /amostra foram detectados (~59%). Curiosamente, nestas células a distribuição bimodal de forças unbinding não era evidente uma vez que os eventos unbinding a forças mais elevadas (~ 65 PN) são claramente menos provável em comparação com os eventos unbinding mais frequentes a forças mais baixas de ~37 pN (Fig. 2C).

GnRH-R quantificação e força de ligação em células PC-3 tratadas

Um aumento nos agonistas eventos unbinding /GnRH-R foi observado em células PC-3 durante 30 dias de exposição ao LA (10

-6 M ou 10

-11 M) (Fig. 3A). O aumento foi detectável em todos os intervalos de tempo considerados (a partir do 6

th a 30

th dias; p 0,001) e atingiu o valor máximo de -80% em relação ao controle após 30 dias de tratamento com a dose mais elevada do análogo. Uma diferença estatisticamente significante foi sempre encontrados no efeito desencadeado pelas duas concentrações da droga, com a dose mais elevada de ser mais eficaz na promoção do aumento.

(A) histogramas de LA /GnRH-R eventos unbinding em LA- trataram células PC-3. Em cada medição, a cada 6 dias, a contagem é normalizado ao obtido com células não tratadas (controlo) definido como 1. Colunas, significa; Barras, DP. * P 0,001

vs

controle,

• p 0,001

vs

10

-6 M LA (one-way ANOVA e testes de comparações múltiplas de Tukey). (B) Modelagem da expressão taxa de GnRH-R. A quantidade de eventos unbinding detectado no PC-3 células tratadas com 10

-6 M LA (diamantes azuis) ou 10

-11 M LA (quadrados vermelhos) foi normalizada para a quantidade de eventos unbinding em células não tratadas ( controle) definido para 1. a curva de Gompertz foi montado para ambos os dados experimentais (azul ou vermelho linhas tracejadas). As taxas de crescimento GnRH-R eram claramente diferentes [(9,3 ± 0,1) dias

-1 para 10

-6 M LA e (6,1 ± 0,1) dias

-1 para 10

-11 M LA] mas tendia para o mesmo valor (1,9 ± 0,1) em tempos longos (para além do 30

° dia). Os dados são apresentados como média ± DP de duas experiências independentes.

A mesma distribuição bimodal (com um pico a f~37 pN e outra em f~65 PN) detectada em células não tratadas de PC-3 foi observada em células LA-tratados ao longo do tempo (a partir do 6

th a 30

° dia), independentemente do tratamento administrado às células. Na Fig. 2B, uma distribuição representativa dos eventos unbinding obtidos a uma taxa de 2 | iM /s em células PC-3 tratadas durante 30 dias com 10

-6 M LA é ilustrado. A curva azul mostra a distribuição bimodal dos eventos desvinculando e uma probabilidade unbinding global de cerca de 22%.

Modelagem da expressão taxa de GnRH-R no PC-3 células

Para lançar luz sobre a dinâmica específica descrevendo o aumento nos receptores expostos, comparou-se a quantidade diferente de receptores obtidos durante o tempo de tratamento nas duas concentrações analógicos utilizados (Fig. 3B). As taxas de crescimento foram claramente diferente, mas tendem para o mesmo valor, por vezes longos (para além do 30

th dia). Este comportamento pode ser comparado aos observados em células tumorais, onde o seu crescimento é limitado pelo espaço finito no qual as células estão confinadas e pela disponibilidade de nutrientes, como modelado pela curva de Gompertz [38]: em que X (t) representa o número da GnRH-I, X (0) o número de receptores no tempo de observação de partida (aqui normalizada para um), K o número máximo de receptores que podem ser expressos na superfície da célula e ct uma constante que caracteriza a taxa de aumento da GnRH-I .

Figura 3B mostra as curvas de melhor ajuste aos dados experimentais obtidos para PC-3 células expostas a 10

-6 M (linha vermelha) ou 10

-11 M (linha azul) LA. Em ambos os casos, a qualidade notável do ajuste permite a recuperação de valores da taxa de incremento do receptor e do planalto. O valor plateau (K = 1,9 ± 0,1) foi o mesmo em ambas as concentrações LA usados. Uma vez que K foi definido como 1 para amostras não tratadas, o valor de patamar obtidos indicam que, em células tratadas com LA PC-3 do número de receptores pode aumentar até 90% em comparação com células não tratadas, independentemente da concentração de agonista utilizado. Por outro lado, a taxa de aumento foi fortemente influenciada pela concentração de LA [α = (9,3 ± 0,1) dias

-1 para 10

-6 M LA e α = (6,1 ± 0,1) dias

– 1 para 10

-11 M LA], portanto, quanto maior a concentração mais rápida é a expressão GnRH-R.

distribuição topográfica dos sítios de ligação

Um mapa bidimensional de eventos unbinding realizada sobre a superfície da célula fornece uma clara visualização da distribuição espacial da GnRH-I (Fig. 4). unbinding eventos que ocorrem na força 50 (pN. correspondente ao primeiro pico da distribuição bimodal na Fig 2A) são representadas a azul, enquanto que as do intervalo de 50-100 pN (que corresponde ao segundo pico da Fig. 2A) , em vermelho. A distribuição espacial da GnRH-R sobre a superfície de células PC-3 aparece homogênea. Os tratamentos com o agonista não influenciar a distribuição espacial do receptor (Fig. 5), bem como os intervalos de tempo, mas o aumento do nível do receptor. Raramente foram encontrados alguns agregados (dados não mostrados).

(A), uma imagem representativa de alta resolução de área de superfície de células PC-3 considerados para o mapeamento do receptor. (B) Um mapa representativo da força unbinding LA /GnRH-R obtido no PC-3 células tratadas durante 30 dias com 10

-6 M LA. Em azul estão representados eventos unbinding que ocorrem em vigor 50 pN enquanto em vermelho as que estão em vigor no intervalo de 50-100 pN

A distribuição homogênea das moléculas receptoras não foi influenciada pelo tratamento. com o análogo (10

-6 M) e não variou através dos intervalos de tempo. Em azul estão representados eventos unbinding que ocorrem em vigor 50 pN enquanto em vermelho as que estão em vigor no intervalo de 50-100 pN

GnRH-R quantificação por análise de Western blot

análise de transferência de Western de células a GnRH-I-expressam (HEK293

[] SCL60) revelou uma banda clara com aproximadamente 60 kDa, a massa molecular do receptor de tipo I pituitária relatado na literatura [39]. Células PC-3 revelou uma banda menos intensa, na mesma posição. Um sinal negligenciável foi detectada em células HEK293 não transf ectadas (Fig. 6A)

análise por Western blot da GnRH-R em (A):. As células PC-3, células HEK293 expressando de GnRH (não-R) e HEK293

[] SCL60 (células transfectadas de forma estável com a GnRH-I) após 6 dias de cultura. (B) Western blot que mostra o reforço LA-triggered da GnRH-R em células tratadas durante 6-30 dias com o análogo (10

-11 ou 10

-6 M) PC-3. borrões representativos de duas experiências separadas que produzam resultados semelhantes são mostrados. (C) dados agrupados densitométricos de análise Western blot de GnRH-R. A intensidade dos sinais foi quantificada por varrimento densitométrico e normalizada para a da β-actina (utilizado como um controlo de carga). Os dados são a razão entre os valores de amostras tratadas e não tratadas (controlo, configurado para 1) e que são apresentados como média ± DP de 2 expericias independentes. * P 0,001

vs

controle,

• p . 0.001

vs

10

-6 M LA (one-way ANOVA e testes de comparações múltiplas de Tukey)

Em células PC-3, um tratamento de 6-30 dias com ambas as concentrações de LA (10

-11 e 10

-6 M) induziu um aumento estatisticamente significativo (de 70% a 110 %, P 0,001) nos níveis de receptor (Figura 6b e 6c), os dados de suporte a partir de espectroscopia de força atómica.. Mesmo que a dose mais elevada LA parecia ser mais eficaz na promoção aumento GnRH-R, a significância estatística nem sempre foi alcançado (Fig. 6C).

Discussão

Os efeitos extrapituitário diretos de análogos de GnRH pode ser considerada o resultado de um mosaico complexa de acontecimentos moleculares que são necessariamente dependente da quantidade de moléculas de GnRH-I disponível na superfície da célula e a via de sinalização activada, ambos os quais diferem entre tecidos [4], [40].

pouca informação está disponível sobre os efeitos dos análogos de GnRH em GnRH-R. A maioria dos estudos publicados sobre os efeitos dos agonistas GnRH sobre a expressão GnRH-R foram realizadas em

in vitro

In vivo

modelos pituitária Comprar e. Nestes estudos, os efeitos observados parecem ser estritamente dependente da modalidade de administração, em que uma pequena ou pulsátil exposição ao agonista levou a uma regulação positiva dos níveis de receptores ao passo que os tratamentos contínuos e prolongados determinou uma redução ou deixado inalterado [41] – [43]. Na APC, resultados muito heterogéneos têm sido relatados. Um estudo imunohistoquímico descreveu uma diminuição da GnRH-I em amostras de CaP de pacientes submetidos a uma terapia hormonal neo-adjuvante de 3 meses de duração com leuprolide e o antiandrogénio bicalutamida, em comparação com a observada imunorreactividade em amostras de doentes sem tratamento [44]. Este achado foi atribuído pelos autores à ligação do análogo às células APC. Também em DU-145 xenoenxertado APC, uma ligeira diminuição induzida pelo agonista nos níveis da GnRH-I foi descrito, enquanto não há variações significativas foram observadas nos níveis de ARNm do receptor [45]. Resultados semelhantes foram obtidos quando as células de fibroblastos e APC, isolados a partir de amostras dos pacientes, foram co-cultivados e expostos a leuprolida [46]. Por outro lado, um forte aumento da GnRH-R mRNA foi descrito na próstata do rato após 28 dias de tratamento com goserelina [43]. Neste contexto, observou-se por transferência de Western que LA foi capaz de induzir uma regulação positiva pós-transcricional da membrana GnRH-R após 4, 6 e 12 dias de tratamento no PC-3 células andrógeno-insensitive, altamente invasivo e pouco diferenciado [24 ].

Com o objectivo de obter insights sobre as propriedades funcionais de GnRH-R expostas na superfície da célula e, portanto, ativamente envolvidos na sinalização do receptor agonista, uma abordagem baseada em AFM em que vivem as células PC-3 foi adoptada pela primeira vez no presente estudo. Os efeitos de um tratamento de longo e contínuo com LA em aspectos cruciais da membrana GnRH-R (ou seja, a quantidade dos eventos unbinding, a força da ligação de análogo do receptor e distribuição do receptor) foram investigados.

Ao detectar o montante e a força da interacção, foi demonstrada a capacidade da hormona para aumentar a expressão /disponibilidade da GnRH-I na superfície de células PC-3, quando administrado continuamente para as células, com um aumento máximo de ~ 80% após 30 dias de tratamento com a dose mais elevada de LA.

neste contexto, também estudaram a cinética da exposição a GnRH-I em células PC-3 tratadas com concentrações de agonista de alta e baixa. Cinética foi analisada através do ajuste da curva de Gompertz, uma curva logística amplamente adoptada para descrever o aumento da população em vários sistemas biológicos. A curva de Gompertz bem recupera o aumento dependente do tempo da GnRH-I na superfície da célula. De acordo com este modelo, a taxa de expressão do GnRH-R em células tratadas com LA depende da concentração de agonista utilizado, enquanto que o valor assintótico é independente da concentração do LA e relacionados com as características de células específicos e condições experimentais utilizadas. Esta evidência, ao mesmo tempo que estabelece claramente a ocorrência de uma regulação positiva LA-desencadeada longa duração do seu próprio receptor na superfície da célula, permite a detecção da quantidade máxima de receptores que a célula pode expressar. Este último achado permite o ajuste fino da relação dose /efeito, alterando a concentração LA. De acordo com os resultados acima são dados a partir de análise de imunotransf erência de membrana de GnRH-I realizada em células PC-3 tratadas durante 6-30 dias com o análogo, que mostrou claramente a eficácia LA na indução de uma regulação positiva significativa do receptor, tal como anteriormente demonstrado pela a mesma técnica até 12 dias de tratamento [24]. resultados de Western blot de acordo com dados AFM como a dose mais elevada LA parecia ser mais eficaz na promoção do aumento GnRH-R, embora a significância estatística não foi sempre alcançado. Isto pode ser devido a diferenças intrínsecas entre os dois métodos.

Como para os mecanismos responsáveis ​​para o reforço do receptor induzida por análogo, vários parâmetros funcionais podem estar envolvidos na determinação da quantidade de receptores disponíveis na membrana plasmática. O nosso estudo anterior sobre a supra-regulação induzida por LA da GnRH-I na superfície de células PC-3 demonstraram que um tal efeito ocorreu a um nível pós-transcricional [24]. Assim, é concebível que o agonista pode actuar aumentando a taxa de tradução da transcrição do receptor e /ou a degradação da proteína retardando. Com base na literatura, é também possível especular que um dos mecanismos envolvidos podem ser representados pela capacidade agonista para promover a saída da GnRH-I a partir do retículo endoplasmático (ER), portanto, favorecer o tráfico anterógrada receptor, dentro de vesículas de transporte intracelulares, para a membrana plasmática. Isto seria consistente com a observação de que outros sete transmembranar (7TM) receptores, tais como receptores de peptídeos de ô-opióides, que são amplamente guardados dentro de er, são enviadas para a superfície celular em resposta à activação de uma pequena sub-população de receptores de membrana [47 ]. Uma vez que os receptores 7TM também sofre um transporte retrógrado a partir da superfície da célula através de endossomas, uma explicação alternativa é possível que a activação de GnRH-R pode inibir a internalização do receptor, que para o tipo I de mamífero a GnRH-I é conhecido por ocorrer muito lentamente, [48].