Sumário

vectores adenovirais específicos de tumores compreendem uma à base de gene área de pesquisa frutífera de diagnóstico por imagem e terapia para o estágio avançado de câncer, incluindo a doença metastática. No entanto, a tradução clínica de vetores virais encontrou obstáculos consideráveis, principalmente devido à resposta imune do hospedeiro contra o vírus. Aqui, nós exploramos a utilização de um imunossupressor, rapamicina, para contornar a imunidade anti-adenovírus em modelos de câncer de próstata murino imunocompetentes. A rapamicina diminuição da resposta imunológica aguda induzida por adenoviral-inibição da activação do NF-kB; É também reduzida à escala e atrasou o início da secreção de citoquinas inflamatórias. Além disso, verificou-se que a rapamicina revogada a produção de anticorpos anti-adenovirus retardado e a função de células mielóides e de linfócitos que foram activados após a administração virai em hospedeiros pré-imunizados. Assim, a co-administração de rapamicina prolongada e maior expressão do transgene entregues por adenovírus

in vivo

, e, assim, aumentou a capacidade de imageamento de vectores adenovirais em ambos os bioluminescentes e pósitrons modalidades de tomografia de emissão. Além disso, mostramos que, apesar de uma excelente resposta das células cancerosas para um vetor terapêutico gene citotóxico

in vitro

, foram observadas apenas o mínimo de efeitos terapêuticos

in vivo

em ratos pré-imunizados. No entanto, quando combinada com a terapia genética transiente de imunossupressão, a paragem do crescimento tumoral completa foi alcançada. No geral, a imunossupressão transitória por rapamicina foi capaz de impulsionar o utilitário de diagnóstico e terapêuticas potenciais de vetores adenovirais

Citation:. Jiang ZK, Johnson M, Moughon DL, Kuo J, Sato M, Wu L (2013) Rapamicina Melhora adenovírus-Mediated Cancer Imaging and Therapy em pr�imunizado Hosts murina. PLoS ONE 8 (9): e73650. doi: 10.1371 /journal.pone.0073650

editor: Maria G Castro, da Universidade de Michigan School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de maio de 2013; Aceito: 19 de julho de 2013; Publicação: 02 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado pelo Instituto Nacional do Câncer concede RO1CA101904 para LW. ZKJ é apoiado pela Universidade da Califórnia em Los Angeles comunhão predoctoral (UCLA) CMCA e comunhão Dissertação UCLA ano. DLM foi apoiado pelo Cancer Research Program DOD ovário; MJ e DLM foram apoiados por uma bolsa de formação Tumor Cell Biology (T32-CA009056). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os vetores adenovirais (ADS) são amplamente utilizados como

in vivo

agentes de entrega de genes em configurações pré-clínicos e clínicos, tanto para o câncer de diagnóstico e fins terapêuticos [1,2]. Recentemente, nosso grupo demonstrou a capacidade de anúncios para detectar especificamente a metástase do câncer após a administração viral linfático-dirigida ou sistêmica [2,3]. Apesar destes resultados encorajadores em modelos animais, vários obstáculos precisam ser superados antes da implementação da anúncios em aplicações clínicas, o obstáculo mais formidável sendo as respostas imunológicas do hospedeiro contra Ad (revisado por [4]). Estudos prévios com roedores e primatas não humanos têm mostrado que sistemicamente injectados Ad (serotipo 5) localizada predominantemente no fígado infectado e as células de Kupffer, células endoteliais e nos hepatócitos [5-7]. Ad infecção destas células dendríticas e as células esplénicas (DCs) inicia uma avalanche de citocinas e quimiocinas inflamatórias caracterizadas por indução precoce da interleucina (IL) -1 e o factor de necrose tumoral (TNF) -α [8,9] seguido por IL-2 , IL-6, proteína inflamatória de macrófagos 2 (IL-8), e regulados de células T expressa e segregada normal, (RANTES), IL-12 e interferão (IFN-γ) [10-15]. Esses fatores, por sua vez poderia recrutar e activar células efetoras, incluindo neutrófilos, monócitos, polymorphonucleocytes e

α14 invariante células assassinas naturais V (NK), o que poderia levar ao tecido (principalmente hepática) danos, choque asséptico e até mesmo a morte [16-18 ].

Enquanto Ad incorre insultos inflamatórios em cima anfitriões, desencadeando reacções imunitárias inatas [5,7,19], o sistema imunitário adaptativo pode células também limpar o vírus e viralmente transduzidas, prejudicando a eficácia da base-Ad imagiologia e abordagens terapêuticas [18,20,21]. Além disso, a maioria da população humana possui anticorpos anti-Ad, devido à exposição a este patogénio ubíquo; Por conseguinte, a administração repetida de vectores Ad seria privilegiada a expansão das células do plasma específicas do Ad, o que leva à secreção de anticorpo vigorosa secundário e subsequente depuração viral, reduzindo vector de biodisponibilidade e potenciar toxicidade para o hospedeiro [12,20]. Além disso, as células que expressam o transgene irá encontrar alívio imune mediada por células [22-24]. Notavelmente, tal eliminação não está limitado ao Ad dirigido a imunidade, mas também pode ser associado com o transgene estranho introduzido, se o produto do gene é imunogénica [19]. Como a maioria dos genes de imagiologia e terapêuticos são exógenas para o anfitrião, este problema imunogenicidade constitui um desafio significativo para alcançar êxito do diagnóstico baseado em anúncios e terapia genética.

Neste estudo, adotamos um imunossupressor aprovado pela FDA, rapamicina (Rapa), para avaliar o valor de imunossupressão transiente em conciliar estes conflitos entre AD e o sistema imune do hospedeiro. Rapa se liga a FKBP12 (proteína 12 de ligação FK) e inibe a actividade de quinase de mTOR complexo 1, uma enzima complexa vital para uma vasta gama de funções celulares necessários para as células de proliferação rápida [25,26]. Rapa dificulta a progressão do ciclo celular (G1 /S), a proliferação, a activação e diferenciação dos linfócitos T e B induzida em resposta a uma variedade de estímulos, bem como a resposta das DCs e outras células imunitárias inatas a estímulos inflamatórios [27-30]. Além disso, RAPA exibe apreciável anti-angiogênese e propriedades anti-câncer [20,31]. Neste estudo, nós relatamos que a rapamicina respostas imunitárias diminuídas com sucesso associada a Ad inata e adaptativa em hospedeiros imunocompetentes utilizando duas estirpes pré-imunizado do rato. A estratégia adotada aqui poderia servir como uma plataforma para melhorar o perfil de segurança e eficácia transgene expressão para Ad mediada imagiologia molecular e terapias.

Materiais e Métodos

cultura celular, adenovírus e drogas

linhas celulares de cancro da próstata murinos RM-9 (a simpática oferta do Dr. Timothy C. Thompson, Baylor College of Medicine [32]) e MycCaP (a simpática oferta do Dr. Charles Sawyers [33]) foram cultivadas em DMEM meio contendo soro bovino fetal a 10% e 1% de penicilina /estreptomicina. Intraperitoneal (i.p.) de dose de rapamicina (LC Laboratories, Woburn, MA) foi dissolvida em DMSO esterilizada e utilizada nas concentrações indicadas. Oralmente aplicado Rapamune foi adquirido a partir de Wyeth Pharmaceuticals Inc, Philadelphia, PA. O ganciclovir (GCV) (Cytovene-IV; Genentech, Roche grupo, South San Franscisco, CA) foi reconstituído com água estéril, diluiu-se com solução salina estéril e utilizou-se 50 mg /kg /dia para

in vivo ou

experiências dose indicada para

in vitro

experimentos

serotipo Ad 5 vectores foram construídos com base em um sistema AdEasy modificado -. sistema AdNUEZ, em que transgenes podem ser colocados na região E3 por múltiplos locais de clonagem . A recombinação homóloga de Padež e pShuttle foi realizado em

E. Coli

BJ5183 células competentes. Os clones virais foram rastreados, propagados, purificados e titulado como previamente descrito [3]. Todos os anúncios utilizados neste estudo são replicação-deficiente. O anúncio vazia contém E1 e E3-excluído backbone viral, sem transgenes. O título de todos os vetores de anúncios foi determinada por ensaios de placa, daí a formação de placa bacteriana unidade (UFP).

Para GCV

in vitro

ensaio de susceptibilidade, as células RM-9 e MycCap foram infectados por anúncios a multiplicidade de infecção (MOI) de 100 e tratados com GCV a partir do dia 2 ao dia 7 após a infecção (pi). A viabilidade celular foi medida utilizando Kit-8 de células Contagem (CCK-8) de acordo com as instruções do fabricante (Dojindo Laboratories, Japão).

experimentos resposta imune inata

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com Comitê de UCLA Institucional animal Cuidado e Uso, conhecido como Comitê do chanceler Pesquisa animal (ARC), orientações (ARC # 2002-049-33 aprovado através de 2014/03/20). 4-5 semanas de idade, ratinhos BALB /c (Taconic Farms, Germantown, NY) foram objecto de um tratamento oral diária de Rapamune (30 mg /kg; Wyeth, Madison, NJ), 3 dias antes de o (i.v.), injecção intravenosa viral. As amostras de soro de ratinhos foram recolhidos e citocinas ELISA foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (kit de ELISA de citoquinas do rato, BD Biosciences). tecidos de fígado de ratinhos foram lisadas e sujeitas a Western blot. De coelho anti-IkB-α (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-actina β (Sigma, St. Louis, MO), foram utilizados anticorpos com peroxidase de rábano conjugado com anti-coelho e anti-murganho secundário (Santa Cruz) .

SCID e experiência de comparação animais imunocompetentes

5-6 semanas de idade SCID machos e ratos BALB /C129 (Taconic Farms) foram tratados com Rapamune oral diária durante 3 dias e depois intraprostatically injectado com 2 × 10

8 UFP de Firefly luciferase (FL) -expressing Ad. a expressão de luciferase foi monitorizada utilizando uma câmara CCD arrefecida IVIS (Xenogen, Alameda, CA). As imagens foram analisadas com Software LivingImage IGOR-PRO (Xenogen).

experiência de imagem PET

subcutaneamente

RM-9 células foram implantadas no ombro direito do sexo masculino C57BL /6 (Taconic Farms), que, 7 dias mais tarde, receberam solução salina por via oral ou tratamento com Rapamune, durante 4 dias. 5 × 10

8 UFP Ad-expressando sr39tk intratumoral foi então injectado e 6 dias mais tarde os ratinhos foram submetidos a imagiologia de PET com

18F-FHBG como previamente descrito [3]. A sessão de imagem CAT de 10 minutos seguido de fornecer informações estruturais.

experimentos com imagens em modelos pré-imunizados

4 a 5 semanas de idade C57BL /6 e FVB ratos (Taconic Farms) foram implantados com RM-9 ou MycCaP tumores, respectivamente. Em ambos os modelos, os animais foram pré-expostos ao anúncio por i.p. injeção de 1 × 10

8 UFP do vírus vazio. Três semanas após a exposição viral primária, 2,5 × 10

5 RM-9 células ou 3 × 10

6 células MycCaP foram então implantadas subcutaneamente para o flanco direito dos animais em Matrigel (1: 1 v /v; BD Biosciences). dose indicada (para ratinhos C57BL /6) ou 5 mg /kg (por FVB) i.p. diariamente Rapa ou diluentes tratamento começou quando tumor eram palpáveis ​​(~ (5mm)

3) e 3 dias depois, os animais receberam injeção intratumoral de 1 × 10

8 UFP (para C57BL /6) ou 5,42 × 10

8 UFP (para FVB) Anúncios expressando FL. Os animais receberam diariamente continuou Rapa ou diluentes tratamento até ao final do estudo. imagiologia bioluminescente foi realizada em pontos de tempo indicados, como descrito acima.

coloração de imunofluorescência

tumores subcutâneos foram dissecadas e fixadas em cassete histologia em paraformaldeído a 3% a 4

° C durante a noite. Parafina secções de tumor incorporados (5 mm) foram feitas no laboratório de patologia na Universidade da Califórnia. Anti-F4 /80 (1: 500; Serotec, Raleigh, NC) e anti-CD31 (1: 300; BD Biosciences, Bedford, MA), anticorpos foram utilizados para corar as secções de tumores. Fotos foram tiradas usando Eclipse 90i microscópio da Nikon

A citometria de fluxo de tumores

tumores subcutâneos foram dissecados e dissociado fisicamente corte e tratamento de colagenase (Invitrogen, Carlsbad, CA;. 80 unidades /mL em meio DMEM contendo 10% de FBS) a 37

° C durante 1,5 horas. células mielóides são definidos por CD11b e CSF1R coloração enquanto os linfócitos são definidos como CD11b- CD4 + ou CD8 + CD11b-. Para fazer com que a forma “estimulação” utilizado na experiência reactividade das células T, 7,6 × 10

6 MycCaP células foram infectadas com 3,8 × 10

7 UFP Ad FL-expressando; 36 horas mais tarde, as células foram colhidas em 200 ul de tampão de lise passiva (Promega, Madison, WI), submetidos a três ciclos de congelação-descongelação e centrifugadas e. O meio de estimulação continha 120 ug ligado de células /mL e 3 × 10

7 UFP /mL vírus vazio. As suspensões de células de tumores dissociados foram então incubadas com ou sem formatação este meio de estimulação a 37

° C durante 3,5 horas. Todos citometria de fluxo anticorpos foram adquiridos da BD Biosciences.

Os estudos terapêuticos

ratinhos FVB macho de 4 a 5 semanas de idade (Taconic Farms) foram pré-expostos ao anúncio por um i.p. injeção de 1 × 10

8 UFP do vírus vazio. 3 semanas mais tarde, 3 × 10

6 MycCap células foram implantadas subcutaneamente no flanco direito dos animais em um 1: /v mistura de PBS estéril e Matrigel (BD Biosciences) 1 v. Os tumores se tornaram palpáveis ​​(~ (5mm)

3) cinco dias depois e intraperitoneal diária Rapa ou diluente tratamento foi iniciado durante quatro dias consecutivos. Animais em seguida, recebeu a injeção intratumoral de 6 × 10

8 Controle UFP (FL-expressando) ou terapêuticas anúncios. Rapa tratamento ou diluente foi então continuada durante 7 dias. 50 mg /kg GCV /dia foi administrada com as coortes terapêuticos começando um dia após a injecção virai. Os tumores foram medidos com um paquímetro, duas vezes por semana até ao fim do estudo. Os animais foram sacrificados 30 dias após a implantação do tumor.

anti-adenovírus titulação de anticorpos

soro de ratinho foi obtido antes da administração virai e no ponto final do estudo por sangramento retro-orbital, seguida de centrifugação em uma centrífuga de mesa em 8000 tiros por minuto durante 10 minutos. placas de 96 cavidades foram revestidas com 1,5 × 10

7 PFU /poço de adenovírus em 100 ul de tampão de carbonato de sódio (0,1 mol /L, pH 8,8) e incubou-se a 4

° C durante a noite. Na altura do ensaio, a solução virai foi removido e a placa foi incubada com 6% de reagente de bloqueio (Roche, Indianapolis, IN) em 0,05% Tween-PBS a 37

° C durante 1 hora. As diluições em série de soro de ratinho foi efectuada em duplicado e incubadas a 37

° C durante 2 horas, seguido por lavagem 5 vezes com 0,5% de PBS-Tween. biotinilado de cabra anti-rato IgG e IgM (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), Os anticorpos foram usadas para incubar a placa à temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de 5 vezes de lavagem. Estreptavidina-HRP (PerkinElmer, Boston, MA) foi então utilizado para incubar a placa à temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido por lavagens e desenvolvimento com substrato TMB (Thermo Scientific, Rockford, IL). A densidade óptica da placa foi então lida a 450 nm de comprimento de onda. O título de anticorpos anti-adenovírus foi determinado como a diluição mais alta à qual o soro pós-viral tem uma leitura de 0,05 maior do que o soro pré-viral correspondente.

A análise estatística

análises estatísticas foram realizada utilizando não pareado ou emparelhado bicaudal

t

teste. Para todas as análises, P . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

rapamicina diminuídas as respostas imunitárias inatas provocou-Ad

Dependendo do tipo de célula alvo e mecanismo de entrada de célula, infecção ad pode desencadear um reportório diversificado de moléculas de sinalização, incluindo lípido de PI3K cinase, proteína quinase activada por mitogénio (MAPK), quinase de adesão focal-ERK1 /2, e vias JAK-STAT [4,5,8,11]. fator nuclear (NF) -κB é um efector a jusante comum para ativação de múltiplas vias de sinalização [8]. Em primeiro lugar, perguntou, interrogando a degradação do seu IkB inibidor, se RAPA poderia diminuir a activação de NF-kB induzida por Ad. Nós injectada solução salina ou 1 × 10

9 UFP de Ad por via intravenosa (i.v.) em diluente de controlo ou de ratinhos BALB /c tratados com rapa, tecido do fígado colhidas nos pontos de tempo indicados e submeteram a Western blot. Como mostrado na Figura 1A, Ad causou degradação de IkB pronunciada (e, assim, a activação de NF-kB) às 6 e 12 horas após a injecção (p.i.); Rapa revogada este efeito.

ratinhos /c (a) BALB receberam rapamicina oral diária (30 mg /kg) ou solução salina de tratamento de 3 dias antes da i.v. injeção de 1 × 10

9 UFP Ad-CMV-FL ou soro fisiológico. tecidos do fígado destes ratinhos foram colhidas nos pontos de tempo indicados, lisadas e sujeitas a Western blot para analisar a degradação IκBα. β-actina foi utilizado como controlo de carga. M1, M2 e M3: Rato 1, 2 e 3 em cada grupo em cada ponto de tempo. (B) Os soros destes ratinhos foram recolhidos em 1, 6 ou 12 horas e os níveis de citocinas foram testados por ELISA. As barras de erro: média + EPM (n = 3). ns, não significativo; *, P 0,05; **, P 0,01; *** P 0,001 por bicaudal

t

teste em comparação ao anúncio único grupo

Uma vez que a atividade de NF-kB está ligada à transcrição de muitos fatores inflamatórios, a. resultados na Figura 1A sugeriu que RAPA pode efetivamente reduzir a tempestade de citocinas provocou-Ad nos animais. Para acompanhar este problema adicional, foram examinados os níveis de soro de um painel de citocinas e quimiocinas a partir destes ratinhos. IL-1 e TNF-α estão entre os primeiros citocinas que são activados por Ad; eles conduzem a expressão de outros factores a jusante e também para retransmitir sinais do sistema imune adaptativo [24]. IL-6 e IL-8 desempenham papéis essenciais no recrutamento de células efetoras, tais como neutrófilos, ao fígado e estão ligadas diretamente a lesões hepáticas relacionadas com a Ad; IL-10 é um regulador essencial do desenvolvimento da imunidade humoral [10,11,13,34]. Como mostrado na Figura 1B, Ad marcadamente aumentada de TNF-α, IL-6, MKC (rato derivadas de queratinócitos de citocinas, análoga à IL-8 humana), IL-10 e IL-12p70 na secreção de 1 e 6 horas e IL nível -1β 6 horas pi; Rapa bloqueou significativamente a indução destas citocinas. Além disso, o início da produção de IFN-γ foi atrasada por Rapa de 6 a 12 horas pi. Assim, estes resultados sugerem que o tratamento Rapa pode reduzir a magnitude ou retardar o aparecimento de componentes da tempestade de citocinas induzida por Ad.

a rapamicina potencializado expressão do transgene entregou-Ad

expressão do transgene robusta e persistente é crucial para garantir a eficácia de diagnóstico e terapêutica de anúncios. Portanto, partimos para determinar o impacto do sistema imune do hospedeiro na expressão do transgene mediado-Ad. Nós injetamos luciferase de pirilampo (FL) -expressing Ad na próstata de imunocompetentes BalbC /129 ou ratos imunodeficiência combinada grave (SCID) e usou imagens de

in vivo

bioluminescente para monitorar a expressão FL mais de 5 semanas. Como mostrado na Figura 2A, tanto a duração e magnitude da expressão do transgene foram grandemente reduzida em BALBC /129 ratinhos que possuíam funções imunitárias intactas em comparação com os ratinhos SCID. Em seguida, se perguntado se RAPA poderia atenuar esses efeitos inibitórios apresentados pelo sistema imunitário adaptativo host. Como o objetivo final deste estudo é o de facilitar a tradução clínica de anúncios, examinamos se RAPA poderia aumentar a imagem do câncer mediada por Ad usando tomografia de emissão de positrões (PET), uma modalidade de imagem clinicamente relevante. O gene repórter de imagem utilizada neste experimento é o HSV1-sr39tk, uma forma variante melhorada do gene quinase timidina do vírus herpes simplex, e a sonda para este gene é seu substrato

18F-FHBG [35]. RM-9 tumores da próstata foram implantados em singeneicos, imunocompetentes C57BL /6 ratos e os ratinhos portadores de tumores foram tratados com veículo ou Rapa antes da injecção de Ad-CMV-sr39tk intratumoral. análise PET seis dias após a injeção viral revelou nitidamente intensificada específicos de sr39tk

18F-FHBG sinal tumoral em todos os quatro ratos no grupo tratado com Rapa; Em contraste, apenas um ratinho no grupo de controlo exibiu sinal fraco (Figura 2B). Estes resultados indicaram que RAPA pode potenciar a expressão do transgene mediado-Ad em hospedeiros imunocompetentes, boding bem para a utilidade de combinar esta forma de imunossupressão transiente com diagnóstico de imagens Ad abordagens em contexto clínico.

(A) 2 × 10

8 UFP específico da próstata-FL expressar anúncio foi ortotopicamente injetado na próstata de imunocompetentes BalbC /129 ou SCID imunodeficientes. FL imagiologia foi realizada em pontos de tempo indicados após a administração virai. bar Color: fótons /segundo /cm

2 /sr. (B) ratos machos C57BL /6 ratos portadores de tumores subcutâneos RM9 receberam soro fisiológico ou tratamento de rapamicina durante 4 dias começando no dia 7 pós-implantação do tumor. Então, 5 × 10

8 UFP Ad-expressando sr39tk foi injetado intratumoral. PET imagiologia foi realizada 6 dias mais tarde com

18F-FHBG. tumores subcutâneos foram indicados por setas vermelhas.

Para avaliar mais aprofundadamente esta droga combinados e abordagem de imagem molecular em cenários clinicamente relevantes, pedimos se o efeito de aumento de Rapa pode ser estendido para animais com pré-existente anti imunidade -Ad. Nós empregamos duas linhagens de camundongos imunocompetentes, C57BL /6 e FVB e imunizados-los com uma dose intraperitoneal (i.p.) de 1 × 10

8 UFP Ad vazio (linha do tempo experimental mostrado na Figura 3A). Este esquema de imunização viral levou ao desenvolvimento de anticorpos anti-Ad resposta imune humoral robusta nestes ratinhos (Figura S1 S1 no ficheiro). tumores da próstata singeneicas (RM-9 ou MycCaP [36]) foram, em seguida, estabelecido por via subcutânea, 3 semanas após a imunização primária viral. O modelo subcutâneo foi escolhido em detrimento do um ortotópico para este estudo inicial de prova de princípio, devido à viabilidade prática de administração intratumoral viral, a avaliação do tamanho do tumor, bem como a atenuação dos sinais bioluminescentes dos tumores prostáticos mais profunda. Quando os tumores se tornaram palpáveis ​​(4-5 dias para RM9; 5-7 dias para MycCaP), i.p. diária injecção de Rapa ou diluente foi administrado. 3 dias mais tarde, os animais receberam a injecção intratumoral secundário de FL-expressando Ad (1 × 10

8 UFP para RM9; 5 × 10

8 UFP para MycCaP). a imagem de bioluminescência foi realizada para monitorar a expressão FL. No modelo de tumor de RM-9, elevada (5 mg /kg), média (1,5 mg /kg) e baixa (0,5 mg /kg) doses de Rapa foram testados; todas as dosagens expressão aumentada FL no dia 4 em relação aos ratos que receberam o solvente (controlo). expressão do transgene desapareceu no dia 7 em ratinhos de controlo, mas ainda era detectável em Rapa coortes tratados (Figura 3B). No modelo de tumor MycCaP compatível FVB, apenas 5 mg /kg Rapa foi testada; ratinhos foram seguidos por imagiologia para 21 dias. Como mostrado na Figura 3C-D, Rapa aumento do nível de expressão FL no dia 4, e estendeu significativamente transgene persistência durante pelo menos 21 dias, que foi o último ponto de tempo testado. Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstram que, mesmo sob o desafio de imunidade pré-existente, Rapa pode aumentar a expressão do gene repórter de imagem Ad-entregue e prolongar a janela de diagnóstico. Estes dados também suportam que os efeitos facilitadores da RAPA não são tumor modelagem ou específicos de estirpe de ratinhos.

(A) A linha do tempo para os modelos pré-imunidade. Os animais foram imunizadas com uma dose intraperitoneal de 1 × 10

8 UFP Ad vazio e, 3 semanas mais tarde, tumores subcutâneos foram inoculados. tumores RM9 tornou-se palpável 4-5 dias pós-implantação; MycCaP tumores se tornaram palpáveis ​​5-7 dias após a implantação. Neste ponto, a rapamicina ou de controlo e o tratamento iniciado vectores de imagem intratumoral Ad foram administrados 4 dias mais tarde. O tratamento diário de rapamicina foi continuada até o final do estudo. imagiologia bioluminescente FL foi realizado em pontos de tempo indicados em B e C. (B) FL imagiologia bioluminescente de RM-9 rolamento ratinhos C57BL /6 no dia 4 e 7. Alta: 5 mg de rapamicina /kg /dia; Meio: 1,5 mg /kg /dia; Baixa: 0,5 mg /kg /dia. n = 3. (C) FL imagiologia bioluminescente de MycCaP ratinhos FVB rolamento (n = 3 ou 4) em pontos de tempo indicados. (D) Quantificação de sinal de imagem da barra de C. Cor de imagem de bioluminescência: contagem de fótons. As barras de erro: média ± SEM (n = 4 por apenas Ad; n = 3 para Ad + Rapa). * P 0,05, ** P . 0,01 por bicaudal

t

teste

A rapamicina suprimida anti-Ad adaptativa respostas imunes

Para investigar ainda mais a mecanismo subjacente efeitos promotores da expressão do transgene no rapa Ad em hospedeiros pré-imunizados, examinamos primeiro o título de anticorpos anti-Ad em soros de ratinhos no final dos estudos anteriores. No modelo de RM-9, ambas as doses elevadas rapa médio e, mas não a dose baixa Rapa, impediu a produção secundária de IgG anti-Ad em pré-imunizados ratinhos C57BL /6 (Figura S2 no ficheiro S1). Um ensaio com tamanho maior coorte revelou que altas doses de Rapa reduzida título de IgG de 1,36 ± 0,33 × 10

5-9,88 ± 2,02 × 10

3 (P = 0,0021, bicaudal

t

teste ; n = 8) (Figura 4A). Da mesma forma, reduzida Rapa-ponto final título de IgG de quase 3 vezes em ratinhos FVB pré-imunizados (P = 0,0368, bicaudal emparelhado

t

teste; n = 3-4) (Figura 4A). Estes dados são consistentes com estudos anteriores mostrando a inibição rapa na activação da célula B induzida e o Ad-a produção de IgG [20]. De nota, nós nos concentramos em títulos de IgG ao longo IgM porque a secreção de IgM precedeu o de IgG e foi de uma magnitude menor nesses animais pré-imunizados. Além disso, a exposição virai secundário iria induzir a troca de isotipo de IgG [37]. No entanto, Xu et al. relataram recentemente os efeitos inibidores de anticorpos IgM naturais na transdução de Ad [38]; À luz destes resultados, mostramos que RAPA também exibiu efeito supressor sobre o nível de IgM que podem ligar-se a Ad (Figura S3 em S1 Arquivo).

(A) FVB e camundongos C57BL /6 foram tratados de acordo com o protocolo mostrado na Figura 3A. amostras de soro de rato foram recolhidos no final do estudo e submetidos a ELISA para titulação de anticorpos anti-Ad (FVB: significa a partir de 3 ensaios independentes; *, P = 0,0368 por bicaudal emparelhado

t

teste C57BL /. 6: dados representativos de 2 ensaios independentes (n = 10); **, P = 0,0021 por bicaudal

t

teste). As barras de erro: média + SEM. (B) coloração de imunofluorescência Representante de lâminas delgadas de RM-9 tumores com tratamento indicado. Rosa, macrófagos F4 marcador /80; verde, vaso sanguíneo marcador CD31; azul: DAPI. Barra de escala = 200 pm. (C) RM-9 de tumor dos grupos de tratamento indicados foram dissociadas e submetido a análise de citometria de fluxo de células mielóides e T populações. linhagem de células mielóides foi definido por coloração com CD11b. As barras de erro: média ± SEM (n = 5). ns, não significativo; **, P 0,01; *** P 0,001 comparado com Ad único grupo por bicaudal não pareado

t

teste. (D) tumores MycCaP de controlo ou com animais tratados com rapamicina (n = 3) foram recolhidas em 1,5 cm de diâmetro, dissociadas, e depois incubaram-se com meios simples ou meio contendo adenovirus e Ad-infectadas lisado celular MycCaP durante 3,5 horas a 37 ° C , coradas com anticorpos de IFN-gama intracelulares e submetido a citometria de fluxo. expressão de IFN-γ com a estimulação foi, em seguida normalizada para o controle correspondente não-estimulada (estabelecida como 100%). subconjuntos de células T foram delineadas por células T CD4 e CD8 coloração. As barras de erro: média + EPM (n = 3). *, P = 0,0431 por bicaudal não pareado

t

teste.

Em seguida, nós exploramos o papel de Rapa na modulação da imunidade anti-Ad-base celular [26,28]. Especificamente, foram avaliadas tanto a infiltração e activação de células imunes em tumores Ad-injectados. No modelo de RM-9, coloração de imunofluorescência revelou uma maior infiltração de macrófagos F4 /80 positivos desencadeadas por injecção Ad. No entanto, a infiltração de macrófagos era marcadamente suprimida por Rapa (Figura 4B). Em seguida, usamos citometria de fluxo para conseguir uma melhor quantificação das populações de células mielóides intratumorais (CD11b + /CSF1R +). Consistente com os resultados de coloração de imunofluorescência, tratamento Rapa diminuiu significativamente a infiltração mielóide nos tumores (Figura 4C, primeiro painel). Em particular, as células que expressam o receptor de estimulação de colónias factor-1 (CSF1R), uma molécula importante para a diferenciação de macrófagos, as DCs, e outros monócitos derivadas de mielóides [39], foram quase completamente eliminada por Rapa (Figura 4C, segundo painel) nestes tumor infiltrado de células mielóides. Além disso, tanto madura (CD69 +) e imaturos (CD62L +) fenótipos de células T CD4 + (CD11b- /CD4 +) foram reduzidos por Rapa (Figura 4C, o terceiro painel), o que implica que tanto o recrutamento e activação de células T CD4 + foram impedidos. As células T citotóxicas CD8 + (CD11b- /CD8 +) também pareceu ser reduzida por Rapa (Figura 4C, último painel), embora o teor de CD8 + de RM-9 tumores foi muito baixo, e, portanto, difícil de medir com precisão. Curiosamente, consistente com outros relatos [20], Rapa diminuiu a angiogénese tumoral, como reflectido pela coloração reduzida do marcador vasculatura CD31 (Figura 4B), oferecendo um outro mecanismo possível subjacente inibição da infiltração de células imunitárias e a activação observada neste modelo rapa.

em seguida, procurou-se determinar se RAPA poderia afetar a reatividade do tumor infiltrando células imunes no sentido Ad e, as células cancerosas que expressam transgenes Ad-infectados. IFN-γ, uma citocina reguladora chave para o desenvolvimento de células T e a activação, foi escolhido como uma leitura para a funcionalidade das células imunes. MycCaP tumores, estabelecidos em ratos com pré-imunidade ao anúncio, como observado na Figura 3A e C, foram colhidas em 1,5 cm de diâmetro e dissociado de células individuais. As células dissociadas foram então incubadas com meio ou com um cocktail “estimulação”, composto de partículas adenovirais e ligado de células a partir de células infectadas com vírus MycCaP FL-expressar. a produção de IFN-γ a partir de células T mediante a estimulação foi, então, avaliada por coloração intracelular e citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 4D, na coorte Rapa sem tratamento (-, controlo), a estimulação mediada pelo anúncio resultou num aumento de 35% da expressão de IFN-γ em células T CD4 + através da (meios simples) da linha de base não-estimuladas; No entanto, as células T a partir de Rapa tumores tratados não eram responsivas a estes estímulos. A reactividade das células T CD8 + raros em tumores MycCaP parecia ser inalterado por Rapa. Colectivamente, a adição de Rapa com o protocolo de transferência de genes do tumor mediada por Ad diminuição da infiltração de células mielóides e imunitárias T no ambiente tumoral; ele também embotado reactividade de células T no sentido de estímulos relacionados a vírus.

A rapamicina potencializado Ad-sr39tk /terapia genética GCV em ratos pré-imunizados

Em seguida, testaram a capacidade da rapamicina para aumentar mediada por anúncio terapia do gene suicida através reforçada vírus herpes simplex timidina cinase (HSV-TK) do gene, sr39tk, e o seu pró-fármaco ganciclovir (GCV) [40]. Para escolher um modelo adequado para estudar a terapia sr39tk /baseada em GCV, a suscetibilidade das células RM9 e MycCap foram avaliados. Ambas as linhas celulares foram infectadas pelos anúncios que expressam sr39tk a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 e tratou-se por doses indicadas de GCV do dia 2 ao dia 7 PI. A viabilidade das células RM9 não foi alterada pela expressão de sr39tk ou o presença de GCV, enquanto que as células MycCap foram sensíveis a este tratamento (Figura 5A). Por conseguinte, o modelo MycCap é seleccionado; Além disso, a HSP-TSTA [3] promotor específico da próstata exibiu actividade transcripcional robusto em células MycCap (Figura 5A e S4 em S1 Ficheiro) e, assim, ele será usado nas seguintes experiências terapêuticas.

(A ) células MycCap e RM9 foram infectadas pelo Ad-PSES-TSTA-sr39tk, Ad-CMV-sr39tk ou nenhum vírus em MOI = 100 e tratados por concentrações indicadas de GCV do dia 2 ao dia 7 pi. a viabilidade celular foi medida por CCK- 8 ensaio no dia 7 e normalizada para o sem-vírus, de zero condição GCV (a linha tracejada).