Abstract

Apesar de décadas de esforço para desenvolver uma terapia eficaz e para identificar novas drogas promissoras, o câncer de próstata é letal, uma vez que progride para castration- resistentes às doenças. Estudos mostram mis-regulação de múltiplas vias no câncer de próstata resistente à castração (CRPC), refletindo a heterogeneidade dos tumores e também sugerindo que a segmentação do receptor de andrógeno via (AR) por si só pode não ser suficiente para tratar CRPC. No presente estudo, nós apresentamos provas de que a via /β-catenina Wnt pode ser activado em células de cancro de próstata após a privação de androgénio-para promover o crescimento independente de androgénios, em parte através do aumento da interacção de β-catenina com TCF4. células de cancro de próstata independente de androgénios foram mais propensos a activar um Wnt-repórter, e inibição da via /β-catenina Wnt sensibilidade aumentada destas células para o anti-androgénico de segunda geração, enzalutamida. O tratamento combinado de enzalutamida e Wnt /inibidor da β-catenina mostraram aumento da repressão crescimento tanto em células de câncer de próstata andrógeno-dependentes e independentes de, sugerindo potencial terapêutico para esta abordagem

Citação: Lee. E, Ha S, Logan SK (2015) divergente receptor andrógeno e beta-catenin sinalização em células do cancro da próstata. PLoS ONE 10 (10): e0141589. doi: 10.1371 /journal.pone.0141589

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 04 de agosto de 2015; Aceito: 09 de outubro de 2015; Publicação: 28 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health R01CA112226 (SL) e da Sociedade americana de Câncer RSG-11-108-01-CDD (SL). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

abreviações : AR, receptor de androgénio; APC, polipose adenomatosa coli; CRPC, cancro da próstata resistente à castração; DHT, di-hidrotestosterona; GSK3, glicogénio sintase quinase 3; iCRT3, inibidor de transcrição catenina responsivo 3; De PI3K, phosphatidylinostitol-3-quinase; PTEN, fosfatase e homólogo de angiotensina; TCF4, fator de transcrição 4; UBE2C, ubiquitina-conjugando enzima E2C

Introdução

O câncer de próstata é a forma mais comum de câncer em homens [1]. Dado o papel fundamental do receptor de andrógeno (AR) de sinalização na progressão da doença, a abordagem convencional de corrente para tratar o câncer de próstata é a terapia de privação de andrógeno, muitas vezes combinado com o tratamento anti-andrógeno. Apesar da regressão do tumor inicial, doença agressiva progride para o cancro da próstata resistente à castração (CRPC), para o qual o tratamento é o principal desafio no campo. Novas drogas que alvejam a via AR, como o anti-andrógeno de segunda geração, enzalutamida [2] e de abiraterona que bloqueia a produção intratumoral de andrógeno [3] ter sido aprovado pela FDA para o tratamento da CRPC. Apesar da promessa destes e de outros agentes terapêuticos, eles prolongar a vida por apenas 6-8 meses [4, 5], indicando a necessidade de uma nova abordagem para o tratamento de doença avançada.

Devido às redes de sinalização complexas em avançado doença, inibição de uma via pode causar reações imprevisíveis [6, 7]. Neste contexto, tem sido sugerido que os tumores de próstata pode também activar as vias de sinalização alternativas para compensar as consequências da inibição AR [8, 9]. A interacção entre as vias de PI3K e Ar tem sido bem estudada e, de facto, o feedback recíproco entre os dois caminhos no cancro da próstata suprimido-PTEN foi reportado, indicando a importância da segmentação em ambas as vias doença suprimida-PTEN [10]. Mais recentemente, a regulação positiva do receptor de glucocorticóides (GR) foi reportada em tumores resistentes enzalutamida [11], e mostrou-se necessário que o fenótipo resistente. Portanto, abordagens terapêuticas que visam concomitantemente múltiplos caminhos podem ser mais eficazes no tratamento da CRPC [6].

Recentes dados de sequenciamento do genoma mostrou misregulation do Wnt-pathway no câncer de próstata com a progressão da doença. A análise comparativa dos dois conjuntos de todo o exome de sequenciamento de dados separados, um de tumores primários [12] e outra de tumores metastáticos resistente à castração letais [13], revelaram que o gene APC (polipose adenomatosa coli) foi frequentemente mutado no ensino primário tumores, mas mutado de forma mais significativa na doença avançada [14]. Na verdade, os dados mais tarde mostra que a via de Wnt-se uma das vias mais significativamente mutado em CRPC [13]. Consistente com isto, a secreção WNT16B no microambiente tumoral promovido a resistência ao tratamento de cancro da próstata através da activação da via Wnt /β-catenina [15]. Mais recentemente, foi relatado que 18% dos casos de alterações expostas cancro da próstata metastático resistente à castração em via de sinalização Wnt [16]. Estes relatos sugerem que a via /β-catenina Wnt pode ser uma das vias compensatórias activados em cancro da próstata em resposta à terapia de privação de androgénio. Apoiando essa ideia, a expressão de uma mutação ativadora de β-catenina na próstata do rato permitiu o crescimento da próstata contínua após a castração [17].

O nosso grupo prova publicado anteriormente de conceito estudos que mostram que uma pequena molécula inibidora da Wnt /via β-catenina, iCRT3 (abreviado para C3) pode diminuir a expressão de ARNm de AR e a transcrição de genes alvo a jusante por interferência com a interacção β-catenina /TCF no promotor AR. Nós também mostrou que C3 poderia interferir com a interação de proteínas AR e β-catenina. Os estudos de interacção proteína mais tarde foram realizadas na presença de elevados níveis de androgénio para estabilizar os níveis de proteína AR de modo que não foram reduzidos na presença do inibidor de β-catenina [18].

trabalho descrito neste manuscrito mostra que a actividade da via /β-catenina Wnt é baixa em células de cancro da próstata provavelmente devido à preferência para interacção β-catenina com AR, em vez de TCF4 nestas células. Observamos que a supressão da atividade AR por de privação de androgênio, o tratamento anti-andrógeno ou AR knockdown promovido /expressão do gene β-catenina-alvo Wnt e este correlacionada com o aumento da interação entre TCF4 e β-catenina. A activação aumentada da via /β-catenina Wnt causou crescimento das células LNCaP dependente de androgénios, na ausência de androgénio ou na presença de anti-androgénico. A activação da via /β-catenina Wnt também foi examinado em um sub-linha independente de androgénios de células LNCaP, células LNCaP-abl (ABL). Abl células foram gerados por passagem contínua em meios de androgénio empobrecido e seleccionados pela sua capacidade para proliferar na condição de privação de androgénio [19]. Abl células foram mais propensos a activação de Wnt /β-catenina de células LNCaP, e a inibição da actividade β-catenina por um inibidor de molécula pequena ou siRNA sensibilidade aumentada em células enzalutamida abl. Além disso, o tratamento combinado de um inibidor enzalutamida e /β-catenina Wnt apresentaram maior inibição do crescimento em ambas as células LNCaP e abl, indicando o potencial terapêutico desta abordagem.

Materiais e Métodos

cultura celular

LNCaP (ATCC, CRL-1740) e LNCaP-abl (ABL) [19] (presente por Z. Culig), as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Cellgro) suplementado com 10% de FBS (Hyclone), e 10% de carvão despojado de FBS (CFBS; soro empobrecido de esteróides incluindo androgénios), respectivamente, e 1% de penicilina-estreptomicina (Cellgro). 22Rv1 (ATCC, CRL-2505) e HEK293 (ATCC, CRL-1573), as células foram cultivadas em DMEM (Cellgro) suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Os compostos que se seguem foram usadas para tratar células: C3 (ChemDiv, C523-1410), enzalutamida (Selleck Chemicals) e inibidor de GSK-3 (CHIR99021; Stemgent). Para a proliferação celular, qRT-PCR, imunotransferência, ensaios de imunoprecipitação e chip, as células LNCaP foram privadas hormona em 5% de meio CFBS durante 2-3 dias e, em seguida, tratada com androgénio com ou sem os compostos acima.

A integração estável de eGFP Wnt-repórter em células de câncer de próstata

O lentiviral repórter eGFP Wnt, 7xTcf-eGFP /SV40-mCherry foi comprado de Addgene (24304). células de empacotamento (HEK293T /17) (ATCC, CRL-11268) foram transitoriamente transfectadas com 6 mg de construção repórter eGFP Wnt, 4 pg de plasmídeo de empacotamento (psPAX2) e 2 mg de envelope plasmídeo expressando (pMD2.G) usando Lipofectamine reagente 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os meios condicionados pelos transfectantes foi recolhido após 24 e 48 h. LNCaP, abl e 22Rv1 células foram infectadas por incubação em meios condicionados a noite e deixou-se recuperar durante um dia. As células infectadas foram passadas e seleccionadas por expressão mCherry utilizando citometria de fluxo.

quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR)

O ARN total foi isolado utilizando o kit RNeasy (Qiagen), e em seguida, a transcrição reversa a 55 ° C durante 1 h, usando Superscript III transcriptase inversa e oligo (dT) 20 primers (Invitrogen). PCR em tempo real foi realizado utilizando os iniciadores específicos do gene e 2XSYBR mistura de Taq-verde pronto (Sigma). Os dados foram analisados ​​pelo método DDCT usando RPL19 como um gene de controlo e normalizado para controlar amostras, que foram arbitrariamente definido como 1.

Immunoblot, imunoprecipitação e imuno

Para análise de imunotransf erência, as células foram lisadas em Triton tampão e suplementado com PMSF 1 mM, 1 mM de na

3VO

4, 10 mg /ml de leupeptina e 10 mg /ml de aprotinina. Os lisados ​​de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE e imunotransferidas com os seguintes anticorpos contra: Ar (441), β-catenina (H-102), TCF4 (H-125, Santa Cruz Biotechnology); ativo β-catenina (8E7 clone, Millipore); tubulina (Covance). As bandas de proteína foram visualizadas usando reagentes de detecção ECL Western Blotting (GE Healthcare). J software de imagem (NIH) foi utilizado para quantificar os níveis de proteína.

Em experiências de imunoprecipitação células foram lisadas, como descrito acima. Os anticorpos primários listados acima foram adicionados a, pelo menos, 1,5 mg de proteína total e incubou-se durante a noite a 4 ° C, seguido pela adição de /G esferas de agarose de proteína A (Santa Cruz Biotechnology) durante 2 h. Os complexos imunitários foram extensivamente lavadas com tampão Triton e solubilizadas utilizando um tampão de amostra de Laemmli (Biorad). IgG de rato normal (Santa Cruz Biotechnology) ou soro normal de coelho (Sigma) foram utilizados como controlos.

Para a coloração de imunof luorescência, as células foram fixadas com formaldeído a 4% em PBS durante 20 min, lavou-se três vezes com PBS, permeabilizadas com 0,2% de Triton X em PBS durante 20 minutos, bloqueou-se com 5% de cabra normal e 5% de soro de cavalo normal em PBS, durante 1 h, e incubadas com anticorpo contra β-catenina activo (Millipore), diluiu-se em tampão de bloqueio, durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, as células foram lavadas três vezes com PBS e depois incubadas com anticorpos secundários conjugados com FITC (Vector Lab) à temperatura ambiente durante 1 h. Subsequentemente, as células foram lavadas em PBS três vezes e com solução de montagem montado DAPI (Vector Lab). Para analisar os níveis de eGFP e mCherry em células estavelmente integrado com 7xTcf-eGFP /SV40-mCherry construções, as células foram fixadas, lavadas e permeabilizadas tal como descrito acima e montado com solução de montagem DAPI.

ensaio de proliferação celular

para o ensaio de proliferação de células CyQUANT, 3-4 X 10

3 células foram semeadas em cada poço da placa de 96 poços preta. As células foram plaqueadas em meio privado de hormona, contendo 5% CFBS e cultivadas durante 2 a 3 dias, e, em seguida, tratado com os reagentes indicados para cada experimento. Os reagentes foram adicionados a cada dois dias com mais meios de comunicação e uma quantidade igual de veículo adicionado ao grupo de controlo. Em intervalos de 2-3 dias, CyQUANT ensaio (Invitrogen, C35006) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, e analisadas num leitor de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices) que executa o software SoftMax Pro ®.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) Ensaio

chip foi realizada como previamente descrito [20]. As proteínas foram reticulado duplo com DSP (Pierce) durante 20 min e 1% de formalina durante 10 minutos. As células foram lisadas, núcleos recolhidas e ressuspensas em tampão de sonicação, e sonicationed durante 12 min (30 seg. Na, 30 seg. Desligado) num sonicador Bioruptor (Diagenode, modelo XL). lisados ​​sonicadas foram pré-liberado para 2 h com /G agarose Protein A bloqueados com DNA de esperma de salmão (Millipore). Os sobrenadantes foram em seguida incubadas durante a noite com os anticorpos seguintes: uma mistura de AR (441) e AR (N-20), ou β-catenina (H-102). Controle de cavacos foi realizado com IgG de rato normal e soros normais IgG de coelho. Os imunocomplexos foram então lavadas e reticulação invertida. O DNA foi isolado com o kit de purificação de PCR Qiagen e qPCR foi realizado. enriquecimento relativo foi calculado como uma percentagem do consumo de 4% normalizado para IgG.

RNA-interferência (RNA-i)

Para β-catenina e AR knockdown, siGENOME SmartPool siRNAs contra β-catenina AR ou foram usadas (Dharmacon). Para APC knockdown, foram utilizados o conjunto de três Silencer® Select siRNAs contra a APC (Ambion, s1433, s1435 s1434 e). As células foram transfectadas com o reagente de transfecção HiPerFect (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 1 X 10

5 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 24 poços em meio privado de hormona, contendo 5% CFBS e a mistura de reagente HiPerFect siRNAs e adicionou-se directamente em cima das células. As células foram cultivadas durante 2 dias e, em seguida, tratado com os reagentes indicados para cada experimento. Para o ensaio de proliferação CyQUANT, 3-4 X 10

3 células foram semeadas em cada poço de preto placas de 96 poços em meio privado de hormona, contendo 5% CFBS e a mistura de reagente e APC siRNAs HiPerFect foram adicionados directamente no topo do células. As células foram cultivadas durante 2 dias e, em seguida, tratado com os reagentes indicados para cada experimento. CyQUANT ensaio foi realizado em intervalos de 2-3 dias, tal como descrito acima.

As linhas celulares estavelmente empobrecido de β-catenina foram gerados com lentivírus pGIPZ shRNA contra β-catenina (Open Biosystems, RHS4430-98912789) ou um controle shRNA (Open Biosystems, RHS4743). Após a infecção, as células foram plaqueadas a uma densidade muito baixa e seleccionadas durante 10 dias com 1 ug /ml de puromicina (Sigma). Cada colônia de células resistentes foi recolhido e ampliado nos meios de selecção para rastrear os níveis de proteína beta-catenina. Duas linhas de células que mostram uma redução moderada de β-catenina foram seleccionados para testar a sensibilidade enzalutamida (SH-β-cat-1 e -2), para minimizar o efeito inibidor do crescimento robusto de knockdown β-catenina (25).

resultados

tratamento de andrógeno reprime a atividade Wnt-repórter em células LNCaP andrógeno-dependentes

Para estudar a atividade da via Wnt /β-catenina no câncer de próstata, que monitoraram a atividade /β-catenina endógena Wnt em um Wnt-repórter a montante do eGFP (7xTcf-eGFP /SV40-mCherry). O construto também expressa mCherry sob o promotor de SV40 constitutivamente activo, para indicar células infectadas positivamente [21]. LNCaP, LNCaP-abl (ABL) e 22Rv1 células de cancro da próstata foram infectadas com lentivírus contendo a construção repórter e células estavelmente integrado com a construção foram seleccionados por citometria de fluxo utilizando a expressão mCherry. a actividade do gene repórter de Wnt foi testada utilizando a GSK-3 inibidor (GSK3-i; CHIR99021), um potente activador de Wnt-[22, 23]. actividade repórter eGFP Wnt foi aumentada na presença da GSK3-i, mostrado pelo aumento da transcrição de GFP em células LNCaP-abl que expressam de forma estável o repórter. A transcrição eGFP foi diminuída na presença de siRNA alvejando β-catenina (Fig 1A). Usando este repórter, examinámos a actividade da via /β-catenina em células LNCaP de Wnt dependentes de androgénio, e células LNCaP-abl e 22Rv1 independente de androgénios [24, 25]. Apesar de níveis abundantes de activo, nuclear β-catenina (Fig 1B), as três linhas de células mostraram baixa actividade basal de Wnt-repórter (Fig 1C). O tratamento com o inibidor de GSK-3 (3 um) activado actividade de Wnt-repórter em abl independente de androgénios e de células 22Rv1 (Figura 1D), o que sugere que o aumento dos níveis de β-catenina foram necessários para activar a transcrição de Wnt /β-catenina-responsivo. No entanto, o tratamento de células LNCaP dependente de androgénios com 3 um de GSK3-I tinha um efeito muito pequeno sobre o repórter de Wnt (dados não mostrados). Além disso, o Wnt-repórter não foi activado na presença de concentrações mais elevadas de inibidor de GSK-3 (6 ou 9¼m) (Figura 1D). Fig 1E mostra os níveis de mRNA relativas de eGFP em cada estado, com aumento da transcrição eGFP in-3 GSK células ABL inibidores tratada, mas não em células LNCaP.

A

, knockdown -catenina diminuída a activação de Wnt-repórter em resposta ao inibidor de GSK-3. células ABL foram infectados com eGFP Wnt-repórter (7xTcf-eGFP /SV40-mCherry) e transfectadas com si-controle ou si – catenina. As células foram cultivadas durante 2 dias e, em seguida, tratados com o veículo, 2 pM ou 3 uM de inibidor de GSK-3, durante 24 h. Os níveis de ARNm relativos de eGFP indicando actividade Wnt foram analisados ​​por qRT-PCR.

B

, os níveis de -catenina nuclear (verde) em LNCaP, células cancerosas da próstata ABL e 22Rv1 foram determinados por imunofluorescência.

C

, imagens de fluorescência representativos que mostram o baixo nível de atividade eGFP Wnt repórter em LNCaP, abl e 22Rv1 células: atividade Wnt (verde), presença de células (mCherry, vermelho), e localização nuclear (DAPI, azul ).

D e E

, abl andrógeno-independentes e células 22Rv1 são mais propensas a ativação de Wnt-repórter. As células foram tratadas com o inibidor de GSK-3, durante 24 h e submetida a imagiologia por fluorescência (

D

) ou qRT-PCR para medir os níveis de ARNm relativos de eGFP (

E

). Em

A-E

, as experiências foram realizadas no meio de crescimento normal, de cada linha de células, tal como descrito nos Materiais e Métodos.

F e G

, hormonal de privação de maior ativação de Wnt-repórter em células LNCaP, que é diminuída pelo tratamento de andrógeno. As células foram tratadas com 9 uM de inibidor de GSK-3 completo (i) ou meio com privação de hormona com /sem 10 nM de di-hydrotestosterone (DHT) durante 24 h (ii e iii). As células foram então submetidas a imagem de fluorescência (

F

), ou qRT-PCR para medir os níveis de ARNm relativos de eGFP (

L

). Os dados apresentados são representativos de três experiências independentes e o erro indicado é o desvio padrão.

Dado que β-catenina interage com AR em uma maneira dependente de androgénios [26-28], nós concluímos que de privação de androgênio pode melhorar a interação β-catenina com TCF, aumentando assim a atividade de Wnt-repórter. Em apoio a esta ideia, o tratamento de células LNCaP com inibidor de GSK-3 em hormônio regulares contendo media (condição i) em comparação com os meios de comunicação privados de hormona (condição II) resultou no aumento da activação repórter (Fig 1F) na condição hormonal privados. O tratamento com di-hydrotestosterone (DHT) diminuiu esta activação repórter (figura 1F, condição III), sugerindo que o tratamento de androgénio reprime a actividade repórter de Wnt em células LNCaP. O nível relativo de ARNm eGFP em cada condição é mostrada na Figura 1G.

A inibição da actividade de AR aumenta Wnt /β-catenina-responsivo transcrição

Como se observou aumento da activação do Wnt-repórter em condições de privação de hormônio, a hipótese de que a inibição da actividade AR pode melhorar Wnt /transcrição-β-catenina responsivo. Para testar essa ideia, atividade AR foi reprimida por qualquer hormona-privação, o tratamento anti-andrógeno (enzalutamida; [2]) ou o esgotamento AR mediada por siRNA. As células foram tratadas com concentrações crescentes de inibidor de GSK-3 para induzir Wnt /β-catenina responsivo a transcrição e os níveis de ARNm relativos do Wnt-repórter (eGFP) e o gene alvo de Wnt /β-catenina endógeno,

Axin2

, foram analisados. Em comparação com células de controlo, de indução mais elevada de Wnt-repórter e

Axin2

níveis de ARNm foi observada em células cultivadas em meios LNCaP privadas de hormonas, na presença de enzalutamida ou tratadas com ARNsi de AR (Figura 2A-2C). Como uma alternativa para a GSK-3 tratamento inibidor também repetida a experiência usando APC knockdown para activar a via /β-catenina Wnt. A APC é um componente do complexo de destruição β-catenina e APC deleção ou mutação de perda de função tem sido mostrado para estabilizar β-catenina e activar a transcrição de Wnt /β-catenina-responsivo [29, 30]. Consistente com os resultados em GSK 3-inibidores de células tratadas (Fig 2A-2C), APC knockdown induzida maior ativação do gene Wnt-repórter e

Axin2

transcrição em células enzalutamida tratada ou privados de hormona (Fig 2D e 2E ), sugerindo que a repressão AR promove /β-catenina-activação de Wnt em células LNCaP. No entanto, as células abl exibiram elevados níveis de repórter de Wnt e

expressão Axin2

em resposta ao inibidor de GSK-3, que foram apenas modestamente aumentada na ausência de DHT ou presença de enzalutamida (Figura 2F e 2G) com a excepção de

Axin2

, que não foi afetada pelo tratamento enzalutamida em comparação com células de controlo (Fig 2G). Depleção de AR por siARN mostrou um aumento na actividade do gene repórter de Wnt e

Axin2

ARNm tanto em células LNCaP e abl (Figura 2C e 2H) sugerindo que a depleção de AR proteína resulta na libertação de mais β-catenina numa piscina celular disponível para ativar a via Wnt /β-catenina

células LNCaP foram tratados com 6 mM ou 9 mM de inibidor de GSK-3 (

AC

.); abl células foram tratadas com e 2 uM ou 3 uM de inibidor de GSK-3 (

M-H

).

A e F

, as células foram, durante 3 dias e, em seguida, tratados com o veículo ou o aumento da concentração de inibidor de GSK-3 com /sem 10 nM de DHT durante 24 h privados de hormona.

B e G

, as células foram tratadas com o veículo ou o aumento da concentração de inibidor de GSK-3 com /sem 10 uM enzalutamida (Enz) durante 24 h.

C e H

, as células foram transfectadas com Si-Si-controlo ou AR, cultivadas durante 2 dias e, em seguida, tratados com o veículo ou o aumento da concentração de inibidor de GSK-3, durante 24 h.

D e E

, as células LNCaP foram transfectadas com Si-controlo ou de quantidades crescentes de Si-APC e, ou durante 2 dias e, em seguida, tratados com veículo ou 10 nM de DHT durante 24 h (com privação de hormona

D

), ou cultivadas em meio completo, durante 2 dias e, em seguida, tratados com veículo ou enzalutamida 10 uM, durante 24 h (

e

). Os níveis de ARNm relativos dos genes indicados são analisados ​​por qRT-PCR. Os dados apresentados são representativos de três experiências independentes e o erro indicado é o desvio padrão.

No seu conjunto, estes resultados sugerem que em células LNCaP dependente de androgénios, a inibição da AR pode permitir que as células de tumor para activar a via Wnt /β-catenina. Sob condições de privação hormonal isto pode ocorrer após a exposição a sinais de Wnt-provavelmente presentes no microambiente tumoral [15, 31, 32]. Em contraste, as células abl independente de androgénio, que são derivados a partir de células LNCaP, parecem prontas para Wnt /β-catenina por activação em ambos presença e ausência de actividade de AR, o que indica que a interacção entre as vias /β-catenina AR e Wnt pode ter sido modificada durante a progressão para a independência de androgénio.

hormonal privação aumenta a interação β-catenina com TCF4

Dado que β-catenina interage com AR ou TCF para ativar AR ou Wnt /β-catenina responsivo transcrição, respectivamente, no cancro da próstata [33, 34], foi examinada a ocupação β-catenina em sítios de ligação de AR e TCF utilizando imunoprecipitao da cromatina (ChIP) ensaios. As células LNCaP foram tratados com DHT, inibidor de GSK-3 ou uma combinação de ambos durante 4 h em meio com privação de hormona. Os níveis relativos de mRNA de Wnt /β-catenina (eGFP Wnt-repórter e

Axin2

) e AR-alvo (

PSA

) genes em cada condição foram analisados ​​(Fig 3A). β-catenina ocupação em TCF ou Ar sítios de ligação foi também examinada (Fig 3B) para determinar se o recrutamento β-catenina correlacionada com a expressão do gene alvo. Como esperado, Wnt-repórter e

Axin2

níveis de mRNA foram aumentados de GSK-3 em células de inibidor tratadas, mas diminuiu na presença de DHT e de GSK-3 inibidor (Fig 3A). Consistente com os níveis de ARNm, β-catenina foi recrutado para locais de ligação no TCF Wnt-repórter e

Axin2

em resposta ao inibidor de GSK-3, mas não nas células co-tratadas com o inibidor de GSK-3 e DHT (Fig 3B). Transcrição de

PSA

ocorreu em resposta a DHT, e isso não foi afectada pela co-tratamento com DHT e GSK-3 inibidor (Fig 3A). β-catenina ocupação foi observada no

PSA

potenciador mediante tratamento de DHT, mas foi diminuída com a co-tratamento com DHT e de GSK-3 inibidor (Fig 3B), sugerindo que, neste contexto β-catenina não é essencial para

PSA

transcrição. AR também foi analisado; mostrando ocupação em

PSA

em resposta ao tratamento DHT, mas nenhuma ligação foi detectada em sites Tcf de genes alvo Wnt /β-catenina em qualquer tratamento (Fig 3C).

A

, a expressão de genes Wnt /-catenina alvo (repórter eGFP e

Axin2

) e o gene alvo AR (

PSA) foi analisado. As células LNCaP foram durante 3 dias e, em seguida, tratado com veículo, 10 nM de DHT, 9 uM inibidor de GSK-3 ou uma combinação de ambos, durante 24 h privados de hormona.

B e C

, -catenina ou Ar vinculam genes alvo foi analisada utilizando cromatina-imunoprecipitação. As células LNCaP foram durante 3 dias e, em seguida, tratados com veículo privado de hormona, 100 nM de DHT, 9 uM GSK3-i ou uma combinação de ambos, durante 4 h.

D e E

, interação -catenina com TCF4 ou AR foram analisados ​​utilizando co-imunoprecipitação. As células LNCaP foram durante 3 dias e, em seguida, tratados com o veículo, com 100 nM de DHT, 9 uM inibidor de GSK-3 ou uma combinação de ambos, durante 4 h privados de hormona. Os lisados ​​de proteína foram quer coradas imunologicamente com anticorpos indicados (

D

) ou submetido a co-IP estudos (

E

) Quantificação de β-catenina e os níveis de proteína β-catenina activas são mostrados abaixo painéis in (

D

). densitometria Relativa é normalizado ao veículo sozinho, definido como 1. Os dados apresentados são representativos de três experiências independentes e o erro indicado é o desvio padrão.

Para determinar se a AR e β-catenina ocupação no alvo genes está correlacionada com a ligação β-catenina, quer AR ou proteína TCF4, realizamos ensaios de co-imunoprecipitação. As células LNCaP foram tratados tal como descrito para os ensaios de ChIP acima, e os lisados ​​de proteína foram imunoprecipitadas com o anticorpo β-catenina. Figura 3D mostra que a RA é estabilizado por tratamento com DHT. Enquanto que os níveis totais de β-catenina permaneceram inalterados por 4 horas de GSK-3 tratamento com inibidor, a GSK-3 de inibição aumentou ligeiramente a expressão de proteínas da forma activa de β-catenina (não fosforilada na serina 37 e a treonina 41, [35]), independente da presença de DHT (Fig 3D). No geral, o tratamento com DHT aumento AR /interacção β-catenina e diminuição da interacção TCF4 /β-catenina em comparação com tratamento com veículo (Figura 3E), como relatado anteriormente [34, 36]. Consistente com os resultados do chip (Fig 3B), inibidor de GSK-3 aumentou a interacção /β-catenina TCF4 mas o tratamento com DHT combinatória diminuiu esta interacção (Figura 3E). Além disso, as células tratadas com DHT observado aumento na interacção AR /β-catenina, que foi reduzida na presença de inibidor de GSK-3 (Figura 3E) consistente com a diminuição da AR no no

PSA

potenciador na presença de inibidor de GSK-3 e DHT (Fig 3C). Não se sabe por AR ligação a

PSA

e interação com β-catenina são menores quando DHT é co-tratados com inibidor de GSK-3, mas este nível reduzido de AR no

PSA

potenciador ainda era suficiente para

PSA

transcrição (Fig 3A, os níveis de mRNA PSA em DHT vs DHT + GSK3-i).

em resumo, tanto chip e co-IP resultados do ensaio sugerem que β- interacção catenina com TCF4 (Figura 3E) e do recrutamento de genes alvo Wnt /β-catenina (Figura 3B) foi aumentada na ausência de androgénio, consistente com o Wnt transcrição /β-catenina responsivo reforçada sob condições empobrecido-hormonas (Figs 1F, 2A e 2D).

a inibição das vias de AR e de Wnt /β-catenina aumenta a repressão do crescimento de células LNCaP

uma vez que uma das respostas celulares da via Wnt-se para promover a proliferação [37, 38], testou-se a activação melhorada do Wnt via /β-catenina na ausência de androgénio ou presença de enzalutamida (Figura 2A, 2B, 2D e 2E) também promoveu a proliferação de células. células LNCaP cultivados nos meios de comunicação privados de hormona de crescimento foram presos como esperado [39], mas GSK-3 tratamento inibidor ou APC knockdown induzida crescimento similar ao tratamento DHT (Fig 4A e 4E). tratamento enzalutamida crescimento também reprimida de células LNCaP como observado anteriormente [2] no entanto, este efeito inibidor do crescimento foi aliviada no GSK-3 tratamento inibidor ou APC knockdown (Fig 4B e 4F). Examinámos também a transcrição de um gene regulador do ciclo celular fase M,

UBE2C

, previamente demonstrado que é importante para o crescimento de células de cancro de próstata independente de androgénios [40]. O tratamento com inibidor de GSK-3 resultou na supra-regulação de

UBE2C

transcrição semelhante ao tratamento de DHT (Fig 4C), bem como de-repressão de

UBE2C

em células co-tratadas enzalutamida (Fig 4D). Estes resultados sugerem que a activação de Wnt /β-catenina promove o crescimento de células LNCaP na ausência de androgénio ou na presença de enzalutamida, acompanhada por sobre-regulação de

UBE2C

. O tratamento de células com um inibidor da via Wnt /β-catenina, iCRT3 (C3) [41], diminuiu o efeito de promoção do crescimento de inibidor de GSK-3 numa forma de dose de resposta (Figura 4G e 4H), indicando ainda que a via /β-catenina Wnt dirige andrógeno-independentes crescimento de células LNCaP.

AF

, GSK-3 tratamento inibidor ou APC knockdown promove o crescimento de células LNCaP em privou-hormonal ou enzalutamida ( Enz) tratados mídia.

A e B

, as células foram privadas de hormona durante 3 dias e, em seguida, tratado com veículo, 10 nM de DHT ou 6 uM GSK3-I (

Um

), ou 10 nM de DHT com /sem 10 uM Enz ou 6 uM GSK3-I (

B

) de dois em dois dias.

C e D

, as células foram tratadas como descrito em (

Um

) ou (

B

) durante 24 h e em seguida os níveis de ARNm relativa de

UBE2C

foram analisadas por qRT-PCR.

E e F

, as células foram transfectadas com Si-Si-controlo ou APC, durante 2 dias e, em seguida, tratados com veículo ou 10 nM de DHT privados de hormona (

E

), ou 10 nM DHT com /sem 10? M Enz (

F

) a cada dois dias.

G e H

, tratamento de células com inibidores da via Wnt /β-catenina (C3) diminui o efeito de promoção do crescimento da GSK3-i. As células LNCaP foram para 3 dias e, em seguida, tratada com privação de hormônio GSK3-i veículo ou 6? M (

G

), ou 10 nM DHT mais 10? M Enz (

H

) com /sem concentrações crescentes de C3 a cada dois dias.

I

, Co-tratamento de Enz e C3 mostra um aumento da inibição do crescimento das células LNCaP.