Abstract

O nosso trabalho anterior identifica um local de ligação intermediário para taxanos no microtúbulos nanopore. O objectivo deste estudo foi para testar derivados de paclitaxel concebido para se ligar a este local intermédio diferencialmente, dependendo do isotipo de β-tubulina. Desde isotipos beta-tubulina têm dependentes de tecido de expressão especificamente, o isótipo βIII é muito abundante em tumores agressivos e muito menos comum em tecidos normais, isso deverá levar a tubulina alvo drogas que são mais eficazes e têm menos efeitos colaterais. Sete derivados de paclitaxel foram projetados e quatro deles eram favoráveis ​​para a síntese de pureza e rendimento para testes adicionais em linhas celulares de cancro da mama modelo suficiente. Nenhum dos derivados estudados foram superiores aos taxanos actualmente utilizados, no entanto, simulações de computador fornecidas insights sobre a atividade dos derivados. Os nossos resultados sugerem que nem a ligação ao local de ligação intermediário, nem o sítio de ligação final é suficiente para explicar as actividades dos derivados taxanos estudada. Estes resultados destacam a necessidade de melhorar de forma iterativa sobre a concepção de taxanos com base em sua atividade em sistemas modelo. Conhecimento adquirido sobre a capacidade das drogas projetadas para se ligar a alvos e trazer sobre a atividade de uma maneira previsível é um passo para personalizar terapias

Citation:. St. George M, Ayoub AT, Banerjee A, Churchill CDM, Inverno P, Klobukowski M, et al. (2015) Projeto e Testes de novos taxanos para sondar a Mecanismos altamente complexo pelo qual taxanos Bind aos microtúbulos e causa citotoxicidade para células cancerosas. PLoS ONE 10 (6): e0129168. doi: 10.1371 /journal.pone.0129168

Editor do Academic: Shian-Ying Sung, Taipei Medical University, TAIWAN

Recebido: 04 de fevereiro de 2015; Aceito: 05 de maio de 2015; Publicação: 08 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 St. George et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Financiado pelo mama concessão Canadian Cancer Foundation concedido a JAT, número de telefone: RES0010014. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os taxanos, incluindo paclitaxel e docetaxel, alvo tubulina, a proteína de subunidade de microtúbulos, e se ligam a um local bem caracterizada na β-tubulina [1]. Os mecanismos de ligação e acção, no entanto, são altamente complexas. Ao contrário de outros fármacos anti-tubulina, os taxanos alvejar especificamente a microtúbulos intacta e o seu local de ligação é no lúmen de microtúbulos [2]. Os trabalhos anteriores por Freedman et al. [2] mapeados os nanoporos ao longo da superfície do microtúbulo através da qual taxanos necessitam de passar a fim de alcançar o local de ligação. Um sítio específico no nanoporo foi identificado como um sítio de ligação intermédia taxano. Um segundo problema é que existem vários isotipos de β-tubulina e que estas diferem tanto na sua afinidade para os taxanos e as suas funções e localizações subcelulares [3]. O paclitaxel parece exercer o seu maior efeito sobre o isotipo βII [4], que é também o principal isotipo β-tubulina em neurónios [3], possivelmente representando a neuropatia associada com os taxanos. O isotipo βIII, que é muito abundante em tumores agressivos e muito menos comum em tecidos normais, parece ser uma boa alternativa alvo [5,6]. O nosso objectivo foi conceber racionalmente e novos derivados de taxano de teste que se ligam ao local de ligação de afinidade intermédia com diferencial dependendo do isotipo β-tubulina expresso em células.

Os taxanos que estão entre os agentes anti-tumorais mais activos no tratamento de vários tipos de cancro, em particular cancro da mama, do ovário e cancro do pulmão [7,8]. A resistência à taxanos é um problema para a quimioterapia de sucesso e pode potencialmente surgir a partir de, pelo menos, três mecanismos distintos. Em primeiro lugar, há o mecanismo clássico resultante da acção de P-glicoproteína (P-gp, codificada pelo

O gene MDR1

), que, essencialmente, bombas fármacos para fora das células cancerosas [9]. Estruturalmente diferentes taxanos poderia, em princípio, têm diferentes sensibilidades à ação da P-gp. Em segundo lugar, β-tubulina, o alvo de taxanos, existe como numerosos isotipos diferem na sequência de aminoácidos e codificado por genes diferentes [3]. Um dos taxanos, paclitaxel, tem os seus efeitos mais fortes do isotipo βII [4]. Desde βII é sobre-expressos em muitos tumores [10] isso não é surpreendente, no entanto, βII é também um componente importante do sistema nervoso [5], o que pode explicar a neurotoxicidade dos taxanos. O isotipo βIII seria um alvo melhor, uma vez que ocorre principalmente em neurónios, mas a níveis muito mais baixos do que βII, enquanto que a sua expressão é muito comum em cancros metastáticos agressivos e [6]. Em terceiro lugar, a ligação de taxanos aos microtúbulos é muito complexo, e a droga tem de percorrer desde o ambiente exterior para o local de ligação no lúmen (interior) do microtúbulo [11] para gerar a sequência catalítica de eventos que conduz à polimerização ou despolimerização. Isto significa que o taxano tem primeiro de se ligar a um local intermédio da superfície do microtúbulo e, em seguida, fazer o seu caminho para dentro. Este local intermédio também difere entre os isotipos. As drogas descritas aqui foram projetados e testados tanto

in vitro

e

in silico

em um esforço para resolver todas as três questões acima referidas.

As estruturas químicas de paclitaxel e docetaxel são mostradas na Fig 1. A segunda geração de droga docetaxel semi-sintético difere em duas posições de paclitaxel. A substituição do éster de etilo na posição C-10 com um grupo hidroxilo faz com que o docetaxel e mais biodisponível que o paclitaxel [12,13], e como um resultado o docetaxel solúvel em água é o favorecido dos dois compostos para utilização em aplicações clínicas. Muitos medicamentos de terceira geração estão sendo desenvolvidos para melhorar os compostos parentais, com os objectivos de melhorar a solubilidade em água, a permeabilidade do tumor, e retenção celular, resultando em melhores resultados e maior tempo de sobrevida para os pacientes [14].

taxanos alvejar especificamente a subunidade β-tubulina do heterodímero α /β-tubulina [15,16]. A localização do local de ligação é encontrado no lúmen da estrutura de microtúbulos oco. Dado que os microtúbulos são compostos de repetir proteínas globulares, os espaços intersticiais (nanoporos) estão localizados ao longo do comprimento do microtúbulo entre protofilamentos adjacentes [2]. É através destas nanoporos que taxanos foram mostrados para mover e ter acesso ao local de ligação no lúmen [11,17]. Uma vez ligado ao local de ligação final de uma alteração conformacional ocorre, em que um motivo de β-tubulina conhecido como o M-loop é estabilizado, impedindo a desmontagem de microtúbulos [16]. Os taxanos que se ligam em uma proporção de 1: 1 com heterodímeros ao longo do comprimento do microtúbulo [18]. Embora taxanos potencialmente podem ser ligados a cada um heterodímero na estrutura de microtúbulos, apenas uma molécula de taxano é necessária para estabilizar centenas de heterodímeros de tubulina [18,19].

Ambos α-tubulina e β-tubulina são encontradas em múltiplos isotipos expressos por genes diferentes [20]. Existem, pelo menos, oito isotipos p-tubulina humanos, e a expressão destes isotipos tem sido observado que diferem em tecidos normais e amostras de tumores [21]. Classe III tem sido observado β-tubulina (βIII), em particular, a ser sobre-expressa em muitas formas de cancro, particularmente cancro resistente a drogas [6], ao passo que βI é constitutivamente expressa, e βII é altamente expresso em tecido do cérebro [21]. Com base na análise da estrutura de microtúbulos, o local de ligação intermédia no nanoporo, e as variações de sequência entre os isotipos de p-tubulina, a hipótese de que os taxanos engenharia para interagir diferentemente com tubulinas vai exercer actividades biológicas influenciados por factores e /ou afinidades de estéricos unidades de engenharia para sítios de ligação, a abundância relativa das isoformas de tubulina, barreiras impostas por bicamadas lipídicas (solubilidade relativa) e energias livres de associação ou dissociação [2]. Os objectivos específicos abordados neste estudo são:

Para investigar a ligação de hidrogênio entre o C-7 hidroxila de taxanos com Ser275 em

α

I e

β

II, suas interações em relação com nanopore, ea difusão resultante de taxanos ao local de ligação.

para investigar a ligação de hidrogênio entre Ser278 conservada em isotipos de tubulina (

β

I,

β

II e

β

III) com diferentes cadeias laterais modificadas no C-10 de taxanos, suas interações em relação com o nanopore e a difusão resultante de taxanos ao local de ligação.

a premissa subjacente para o primeiro objectivo baseia-se na modelação computacional, que descobriram que, em βIII tubulina, que tem alanina em vez de serina na posição 275, não é capaz de formar uma ligação de hidrogénio com o hidroxilo em C-7 em paclitaxel, que por sua vez enfraquece a interacção do paclitaxel com o nanoporo, inibe a difusão do paclitaxel, para o local de ligação intermédia, e resulta em uma perda de actividade efectiva de paclitaxel em microtúbulos βIII contendo tubulina [2].

o teste do primeiro objectivo requer a síntese de derivados do paclitaxel com o C-7 hidroxilo substituídos por um não-polar grupo funcional (Tx-a e Tx-B, Figura 1) ou flúor (Tx-C, Figura 1). Esperávamos ver diminuiu promoção de polimerização por paclitaxel em microtúbulos compostas de isótipo βIII. Quando qualquer Tx-A ou Tx-B é testada no entanto, nós esperamos ver que a promoção de polimerização é menos afetada pela isótipo β-tubulina; Em outras palavras, os efeitos de Tx-A ou Tx-B deve ser insensível (ou, pelo menos, menos sensível) com o isotipo β-tubulina. Tx-C não devem ter uma actividade intermédia, devido a menor energia associada com ligações de hidrogénio para o átomo de flúor (3 kcal /mole em comparação com 5 kcal /mol). Fomos capazes de sintetizar compostos Tx-A e Tx-C, e estes foram testados com

In vitro

ensaios de polimerização ou com os modelos de linhas celulares para a atividade citotóxica.

A premissa para a segunda objetivo é que uma diferença de entre 4 e 9 Å precisa ser calibrado para acessar Ser278 e, portanto, uma porção de cadeia lateral poderia ajudar a colmatar esta lacuna. ligação de hidrogénio entre o paclitaxel e Ser278 é previsto para causar a estabilização da interacção de taxano no nanoporo, resultando em movimento mais rápido do fármaco ao local de ligação no interior do microtúbulo, reforçada polimerização de microtúbulos, e aumento da citotoxicidade. O teste do segundo objectivo requer a síntese de várias modificações na posição C-10 de paclitaxel. Concebemos taxanos possuindo diferentes comprimentos de cadeia na posição C-10 utilizando uma guanidínio (compostos Tx-E e G-Tx, Figura 1) ou um carboxilato de metilo (compostos Tx-D e Tx-F, figura 1) do grupo funcional. Estes compostos deverão ser mais activo do que o paclitaxel. Fomos capazes de sintetizar compostos Tx-D e Tx-F e estes foram testados com

in vitro

ensaios de polimerização ou com modelos de linhas celulares para a atividade citotóxica.

Materiais e Métodos

Chemical Synthesis

Nós compostos inicialmente compradas Tx-a, Tx-C, Tx-D e Tx-F (entre o

in silico

compostos concebidos Tx-a a Tx-G ; a Fig 1), devido à sua relativa facilidade de síntese, com um rendimento e pureza suficientes em relação ao testar os objectivos propostos. As identidades dos compostos foram avaliadas por ressonância magnética nuclear (RMN), e a pureza por cromatograf ia em camada fina (TLC); compostos Tx-A, Tx-C, D e Tx-Tx-M foi de 88%, 94%, 94% e 96% puro, respectivamente, com rendimento de 6%, 10%, 3,6% e 3,3%, respectivamente. Todos os compostos foram sintetizados através de costume prestador de serviços contratuais Helios Biotech Ltd., Edmonton, Alberta, Canadá.

Cultura celular

linhas celulares de cancro da mama SK-BR-3 [22], MDA-MB -231 [23], e T-47D [24] foram gentilmente cedidas pelo Dr. Ing Swie Goping (University of Alberta, Canadá). Estas são as linhas celulares de cancro da mama representativos que reflectem a heterogeneidade molecular observado em tumores em um ambiente clínico. A ajuda linhas de células selecionado na generalização dos resultados e ajuda a descartar uma influência direta do genótipo-fenótipo de uma linha celular sobre o potencial de ligação e citotóxico do paclitaxel e seus análogos. Além disso, as linhas celulares de cancro da mama seleccionados foram previamente referido como exibindo graus variáveis ​​de resistência ao paclitaxel [25], e o nosso interesse foi a reproduzir estes resultados e para interrogar se a resistência intrínseca dificulta as relações estrutura-actividade em análogos do taxano descritos na objetivos do estudo. tumores de cancro da mama são caracterizados em termos da sua expressão de vários receptores de superfície celular, tais como HER2 (receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2), receptor de estrogénio (ER) e o receptor de progesterona (PR), que estão envolvidos na sinalização celular e a proliferação celular.

A linha celular SK-BR-3 é HER2

+, ER

– e PR

-.

A linha de células MDA-MB-231 não expressa ou tem uma expressão muito baixa para os receptores (HER, ER ou PR) e é denominado triplo negativo. Os pacientes com status de receptores triplo negativo submeter a tratamentos com terapias citotóxicas tais como paclitaxel ou docetaxel

A linha de células T-47D é ER

+ mas HER2

. -. Tumores que são ER

+ e HER2

– (seja PR

+ ou PR

-) são chamados de tumores A luminais

O prognóstico é melhor para luminal A. e pior para o triplo negativo; HER2

+ tumores (Her2

+ e ER

-) têm um prognóstico intermediário [26]

Um segundo conjunto de linhas celulares de cancro da mama não-também foram utilizados para avaliar a generalidade. das conclusões relativas ao paclitaxel e seus análogos, exceto que estas linhas celulares estão bem caracterizados para a P-glicoproteína (P-gp) expressão, e são classificados como fenótipos uma ou outra droga sensíveis ou resistentes. MES-SA (P-gp negativo, tipo selvagem) [27] e MES-SA /Dx5 (P-gp positivo, resistente à droga) [28] linhas de células de sarcoma uterino, e K-562 (P-gp, tipo selvagem negativo ) [29] e K-562 /R7 (P-gp positivo, resistente a drogas) [30] linhas de células de leucemia mielóide crônica foram gentilmente cedidas pelo Dr. Charles Dumontet (Universidade de Lyon, França). Este painel foi selecionado para determinar se as alterações feitas às estruturas do taxano teve um efeito sobre a especificidade do substrato para a bomba de efluxo multirresistência, P-gp. MES-SA e MES-SA /Dx5 são células aderentes, enquanto que o K-562 e K-562 /R7 são células em suspensão. Foi relatado anteriormente que a MES-SA /Dx5 e K-562 linhas celulares /R7 sobre-expressar a proteína P-gp e apresentam resistência cruzada a uma variedade de compostos quimioterapêuticos [28,31].

Todos célula as linhas foram mantidas em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), a 37 ° C, 5% de CO

2 e num ambiente humidif içado. As células aderentes foram mantidas em meio até ~ 90% confluentes. As células foram tratadas com tripsina, numa solução de tripsina-EDTA (Gibco, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EUA) a uma concentração final de 0,25%.

A polimerização de microtúbulos Ensaio

tubulina de cérebro bovino preparação e purificação da apli e αβIII dímeros (α-tubulina foi uma mistura de isotipos; única β-tubulina foi purificado em βII e βIII, respectivamente) foram realizados como previamente descrito [32]. Os ensaios de polimerização em microtúbulos foram realizados como previamente descrito [33]. -Se aliquotas (200 ul) de isotypically puro tubulina de cérebro bovino (1,4 mg /ml) em tampão de tubulina (100 mM de MES-Na, EGTA 1 mM, EDTA 0,1 mM, MgCl 0,5 mM

2, GTP 1 mM, pH 6,4) foram incubadas na presença de droga (1-16 uM) a 37 ° C durante 15 minutos num espectrofotómetro de modelo DU (Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN, EUA) e a turbidez das amostras foram monitorizadas a 350 nm cada 8 s. Os dados brutos foram adquiridas e processadas utilizando o software KINLOTUS. Os dados brutos foram posteriormente de base corrigida e os valores de turbidez foram plotados contra o tempo.

MTS Ensaio

A viabilidade celular na presença do fármaco foi determinada utilizando o CellTiter 96 AQ

ueous Non Ensaio de Proliferação de -Radioactive celular (MTS) (Promega, Madison, WI, EUA). As células foram semeadas em placas de 96 poços (Nalge Nunc International, Rochester, NY, EUA) a níveis proporcionais à sua taxa de crescimento (que varia de 5 a 10.000 células por poço), a um volume de 100 ul e deixadas aderir à placa durante a noite. No dia seguinte as células foram tratadas com uma gama de 100 ul de concentrações de droga 2x para uma concentração final de 1x droga por poço. Cada concentração de droga foi administrada a seis poços diferentes, para avaliar a reprodutibilidade técnica do ensaio. Este tratamento foi mantida inalterada durante um período de 72 horas. Após 72 horas de tratamento, 30 ul de reagente MTS foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas a 37 ° C durante um período de tempo de 30 minutos a 4 horas, dependendo do desenvolvimento de cor, uma taxa que era variável de linha celular para linha celular. viabilidade celular relativa foi determinada através da medição da absorvância de cada poço a 490 nm e converteu-se em percentagem de viabilidade total em comparação com um controlo não tratado. Os resultados experimentais são uma média de, pelo menos, n = 3 experiências.

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Gel de Poliacrilamida A electroforese (SDS-PAGE) foi realizada análise por transferência de Western. 10% de gel de poliacrilamida (a partir de uma solução estoque de 40% 29: 1 de acrilamida /solução de bis, 0,375 M de Tris, 0,1% (v /v) de SDS, 0,1% (v /v) de persulfato de amónio, 0,1% (v /v) TEMED (N, N, N ‘, N’-tetrametiletilenodiamina), água para volume) foram utilizados para todas as experiências de transferência de western. Poliacrilamida (7,5%) géis foram usadas para análise de transferência de Western de proteína P-gp (170 kDa) para a resolução necessária de bandas de proteínas nesta gama de tamanho. Os lisados ​​de proteína total (25 ug) foram carregados em 10 ou 15 géis de poliacrilamida usando bem 1x tampão Laemmli Amostra (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EUA). Os géis foram corridos a 200 V durante ~ 1 h, em 1x tampão Tris /glicina /SDS tampão de corrida (ICN Biomedicals Inc., Irvine, CA, EUA) antes de ser removido e coradas com azul de Coomassie ou transferidos para membrana de nitrocelulose para análises de Western blot. géis corados com Coomassie foram descoradas utilizando uma solução de 50% H

2O, 40% de metanol, e 10% de ácido acético glacial. geles descorados foram digitalizados em um CanoScan LiDE 600F (Canon Inc., Tóquio, Japão) e visualizada utilizando Adobe Photoshop 6.0 software (Adobe Systems, San Jose, CA, EUA).

Western Blot Analysis

Após a electroforese em gel e transferência de proteínas para membranas de nitrocelulose, as membranas foram bloqueadas com 5% de tampão salino Tris (TBS), além de leite e Tween (TBSMT) (Tris-HCl 154, 1,37 M de NaCl, 0,1% (v /v ) de Tween 20, 5% (w /v)), solução de leite durante 1 hora. As proteínas nas membranas foram expostas durante a noite a solução de anticorpo primário-TBSMT. No dia seguinte, as membranas foram lavadas em tampão salino Tris, mais Tween (TBST) (Tris-HCl 154, NaCl 1,37, 0,1% (v /v) de Tween 20, pH 7,6), durante 6 ciclos, com 5 min de lavagem /incubação para cada ciclo em TBST para remover o anticorpo não ligado. As membranas foram depois expostas ao anticorpo secundário em TBST durante 30 minutos. A seguir à incubação do anticorpo secundário, as membranas foram lavadas em TBST durante 12 ciclos com 5 min de lavagem /incubação durante cada ciclo em TBST para remover qualquer anticorpo secundário não ligado. As proteínas foram detectadas após uma exposição de 5 minutos a qualquer ECL Primeiro Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Little Chalfont, Inglaterra) ou Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EUA) e o filme exposto foi desenvolvido usando um KODAK M35A processador X-OMAT (Eastman Kodak, Rochester, NY, EUA). As proteínas detectadas utilizando anticorpos anti-humanas de rato primários foram: βIII (ab14545; Abcam, Cambridge, Inglaterra) utilizado a uma diluição de 1 em 1000, P-gp (ab3366; Abcam, Cambridge, Inglaterra) utilizado a uma diluição de 1 em 2000 , e de cabra anti-actina humano (sc-1616, Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, EUA) utilizado a uma diluição de 1 em 4000. Os anticorpos secundários foram de cabra anti-rato (115-035-003; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA), a uma diluição de 1 em 10.000 e de coelho anti-cabra (305-035-045; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA) utilizado a uma diluição de 1 em 40.000. Os filmes originais foram digitalizados e as imagens foram importadas para o PowerPoint. As bandas situadas no intervalo de tamanho esperado foram recortadas dos filmes. Tamanho e contraste de cada figura foi ajustada de tal forma que todos os valores combinados em tamanho e, em seguida, agrupados. O contraste de todo o grupo foi ajustada de modo que as bandas podem ser melhor visualizado e a cor foi consistente.

Análise estatística

6 GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA) foi utilizado para criar figuras e efectuar análises estatísticas dos resultados. T-teste de Student padrão foi utilizado para comparar os resultados de citotoxicidade para cada um dos análogos relativos ao paclitaxel induzidas perfis citotóxicos; como também para todos os resultados do ensaio citotóxico com e sem outras variáveis ​​(por exemplo, verapamil). Uma maneira ANOVA (análise de variância) foi usado para mostrar a significância estatística entre baixa, média e alta resistência às drogas em linhagens de células tratadas com paclitaxel e derivados.

Computacional Simulações

Ligação ao taxano local de ligação.

as coordenadas do complexo receptor-ligando tubulina-taxano foram obtidos a partir da estrutura de cristal APO 1JFF [34], que representa o paclitaxel co-cristalizado com a tubulina. As coordenadas de estrutura cristalina desta foram usados ​​para construir os complexos de outros derivados de taxano. As estruturas foram construídas usando Avogadro 1.0.3 software [35]. Nove complexos foram construídos, incluindo Tx Tx-A a-L, bem como paclitaxel e docetaxel como controlos. O receptor foi preparada através da remoção da sub-unidade alfa de 1JFF, uma vez que não contribuem directamente para a ligação de taxanos. O primeiro resíduo metionina em falta foi adicionada e o C-terminal foi tampado com um resíduo N-metil. O difosfato de cofactor guanosina (GDP) também foi incluído na estrutura e os seus parâmetros foram obtidos a partir de Meagher et al. [36] ionização estados de resíduos de proteínas foram atribuídos utilizando o servidor PROPKA [37-39]. Os ligantes foram parametrizadas de acordo com o campo AMBER geral vigor (GAFF) [40] e cargas parciais foram atribuídos com o método AM1-BCC [41] usando o

módulo antecâmara

de AMBER 12 [42]. Os complexos foram então construídas usando o

tleap

módulo de AMBER 12, em que a proteína foi parametrizado usando o campo de força AMBERff12SB [43,44]. O complexo foi solvatado em uma caixa de octaedro truncado que se estende 12 Å em cada sentido. O complexo foi então neutralizada pela adição de 16 iões de sódio. Outros 22 iões de sódio e de cloreto foram adicionados para alcançar uma concentração de sal de 100 mM. Cada complexo foi então minimizado com restrições pesadas (500 kcal /(mol a)) sobre a proteína e sem tremer em átomos de hidrogênio para 1000 mais íngreme descida corre seguido por 1000 execuções gradiente conjugado. Outra minimização com 3000 mais íngremes execuções descida seguido por 3000 execuções gradiente conjugado foi realizada sem quaisquer restrições. O aquecimento a uma temperatura de 300 K em volume constante e com agitação de restrições sobre a proteína foi realizada utilizando um termostato de Langevin de 20 ps. Densidade de equilíbrio a uma pressão constante para 200 ps foi então realizada utilizando AGITAÇÃO em átomos de hidrogénio e sob a diminuir gradualmente as restrições em átomos pesados. Isto foi seguido por uma fase de produção de 10 ns a 300 K sob pressão constante onde as coordenadas foram gravadas a cada 2 PS. Todas as simulações foram feitas sob condições de contorno periódicos de partícula de malha Ewald método para o tratamento de longo alcance a electrostática. Densidade, temperatura, a energia total e RMSD foram verificados por razões de equilíbrio. Os últimos 2 ns da campanha de produção, foram pós-processados ​​para o cálculo da energia livre de ligação usando as Mecânica Molecular Área /Poisson-Boltzmann Superfície (MM /PBSA) [45] ou Mecânica /Área de Superfície Nascido generalizada Molecular abordagens (MM /GBSA) [46]. Foram extraídos 200 instantâneos uniformemente espaçados dos últimos 2 ns do ciclo de produção e os usou para o MM /PBSA e cálculos MM /GBSA. Nós também realizadas análises modo normal para cada complexos usando 100 instantâneos uniformemente espaçados que foram extraídos dos últimos 2 ns do ciclo de produção. Uma vez que a análise no modo normal é muito demorado, utilizou-se uma abordagem em que a proteína é truncado. Especificamente, todos os resíduos mais longe do que 12 Å do ligando foram truncado, e a análise foi realizada apenas no sistema restante. Esta abordagem tem sido provado eficiente e suficientemente precisos por Genheden et al [46]

Em nossa abordagem, a energia livre de ligação é calculado de acordo com a fórmula:. (1) onde é a energia mecânica molecular médio incluindo as contribuições de ligação, ângulo, diedro, van der Waals e termos eletrostáticas. é a energia de solvatação livre calculada resolvendo a equação de Poisson-Boltzmann (ou Generalized Born) para obter a energia livre de solvatação polar e estimando energia livre de solvatação não-polar usando um termo área de superfície. –

TS

MM

é o termo entropia estimada usando a análise de modo normal. Uma vez que a energia livre média é calculada para o ligando, do receptor, e complexo, a energia de ligação é obtida por meio da equação seguinte:. (2)

A ligação ao sítio Nanopore Intermediário

microtúbulo nanoporo modelo foi construído através da combinação de dados de microscopia electrónica por um microtúbulo (1XRP) [47] com os dados de raios X para um heterodímero αβ-tubulina (1JFF) [34]. Começando a partir dos componentes de proteínas e nucleótidos do cristal 1JFF, faltando resíduos (especificamente alfa: 1,35-60 e beta: 1) foram retirados de 1TUB [1] e sobrepostos em 1JFF. Em seguida, o estado de protonação de resíduos ionizáveis ​​em 1JFF foi determinada utilizando PROPKA e átomos de hidrogénio adicionado para se obter um heterodímero completo αβ-tubulina. Finalmente, este dímero foi utilizado para a construção de uma porção de um microtúbulo usando dados de microscopia electrónica de 1XRP. O modelo utilizado era para a poro de tipo 1 [2], e apenas os quatro monómeros tubulina adjacentes ao poro foram retidos.

O modo de ligao do paclitaxel ao local de ligação intermédia foi feita a partir de Freedman et al. [2] e sobreposta por cima da estrutura nanoporo descrito acima, resultando no modelo nanoporo-paclitaxel utilizado neste estudo (Figura 2) na forma de uma estrutura de partida para definir o local de ligação intermédia de encaixe nos cálculos. Note-se que os contactos interdimer não ter sido equilibrada neste modelo. O modo de ligação de paclitaxel no local de ligação intermédia relatado por Freedman et ai. difere do que relatado por Maccari et ai. [48], que está localizado mais perto de a

3-tubulina. É provável que ambos os locais são estados estáveis ​​ao longo da mesma via de internalização.

Nanopore é visto a partir de microtúbulos exterior. O círculo azul indica o sítio de ligação intermédia

cálculos de ancoragem foram realizadas com o ambiente molecular Operacional (MOE; Computing Group Chemical, Montreal, Canadá).. MOE foi selecionado para o encaixe devido ao seu protocolo de acoplamento do induzir-ajuste e capacidade de modelar facilmente ligantes com diferentes taxas e estados de ionização. Os quatro heterodimeros que compõem a poro de tipo 1 foram utilizados para definir o receptor, e cinco taxanos (paclitaxel, Tx-A, Tx-C, D e Tx-Tx-F) foram ancorado ao sítio identificado por Freedman et ai. [2]. Devido ao baixo de pKa dos grupos funcionais de ácido carboxílico em TX-D e F-Tx, estes dois taxanos foram modeladas como aniónico (desprotonado) para melhor representar a sua estrutura, a um pH fisiológico. Scoring foi inicialmente calculado com a função de pontuação Londres dG, retendo 30 conformadores (com duplicatas removidas). Posteriormente, o refinamento foi realizada utilizando o método de Campo de Força e rescoring adicional usando a função de pontuação GBVI /WSA dG. Quatro protocolos de encaixe diferentes foram usados ​​com diferentes tamanhos de local de ligação e com qualquer um flexível ou um receptor rígida.

Resultados e Discussão

Tubulin Polimerização Usando Paclitaxel e sintetizados Derivados

ensaios de tubulina de polimerização foram realizadas utilizando os derivados do paclitaxel para medir

in vitro

actividade de polimerização em comparação com paclitaxel. Estes experimentos utilizados βII e βIII isotipos de tubulina purificados por afinidade a partir de uma fonte de cérebro bovino; o α-tubulina foi uma mistura de isotipos; estas formas de tubulina são referidos como apli e αβIII, respectivamente.

curvas de polimerização foram estabelecidos utilizando o paclitaxel e quatro dos seus derivados com qualquer apli e αβIII. As curvas de polimerização a concentrações de droga de 10 fiM são mostrados na Figura 3A concentração de droga de 10 mM foi a concentração a que as diferenças entre os efeitos de todas as drogas eram mais claramente visível; No entanto, as mesmas tendências foram observados a todos os níveis de concentração testados (1-16 uM).

Isotypically puro tubulina de cérebro bovino (apli ou αβIII) a 1,4 mg /mL foi incubado na presença de fármacos e a absorvância a 350 nm foi medida a intervalos de 8 segundos durante pelo menos 11 minutos. A concentração de cada droga foi de 10 uM. PTX é paclitaxel.

Os resultados mostram que o paclitaxel corresponde à taxa mais elevada de montagem de microtúbulos. Isto é seguido pela Tx-A, seguida pela Tx-C. Tx-D e Tx-F apresentaram valores semelhantes, com as taxas mais lentas de montagem de microtúbulos. Nenhum dos derivados testados ultrapassado paclitaxel em termos da taxa de polimerização da tubulina. Houve um aumento na taxa de montagem para o paclitaxel com seguido de Tx-A, seguida pela Tx-C. Tx-D e Tx-F apresentaram valores semelhantes, com as taxas mais lentas de montagem de microtúbulos

Os resultados não foram consistentes com as previsões anteriores [2] e a premissa subjacente descrito para o primeiro objectivo:. Paclitaxel não foi observado ter diminuído de polimerização com βIII tubulina (a observação foi o inverso da expectativa), e, além disso, Tx-a e Tx-C não possuem o comportamento esperado. Nem foram os resultados consistentes com a premissa subjacente descrito para o segundo objetivo: Tx-D e Tx-F não eram mais ativos do que paclitaxel. Portanto, esta experiência não suporta a importância de resíduos de 275 ou 278, ou o papel previsto do sítio de ligação intermediário na nanopore microtúbulos.

citotoxicidade do Paclitaxel Análogos contra linhas celulares de cancro da mama.