Abstract

O presente estudo foi desenhado para determinar os efeitos biológicos da novela analógico alcalóide marinho 7- (4-fluorobenzilamino) -1,3,4,8-tetra-[4,3,2-de ] quinolin-8 (1H) -ona (FBA-TPQ) sobre células de cancro do ovário humano para o seu potencial anti-tumoral e os mecanismos subjacentes a como um novo agente quimioterapêutico. células cancerosas do ovário humano (OVCAR-A2780 e 3), e células humanas não tumorigénicas imortalizadas superfície epitelial do ovário (Iosé-144), foram expostas a FBA-TPQ por avaliação da citotoxicidade inicial (por meio do Kit de ensaio de MTS, Promega). O detalhado

in-vitro

(nível celular) e

in-vivo

(modelo animal) estudos sobre os efeitos anti-tumorais e possíveis mecanismos subjacentes de ação dos compostos foram então realizadas. FBA-TPQ exercida citotoxicidade potente contra o cancro do ovário A2780 e humano OVCAR-3 células como um inibidor eficaz do crescimento e proliferação celular, enquanto exerce efeitos menores em células não tumorigénicas Iosé-144. Um estudo adicional na linha celular OVCAR-3 mais sensível mostrou que poderia potencialmente induzir a apoptose de células (ensaio V-FITC anexina), G2 /M paragem do ciclo celular (análise de coloração de PI) e também dependente da dose inibem OVCAR-3 tumores de xenoenxerto ‘ o crescimento em ratos nus atímicos fêmea (BALB /c, nu /nu). estudos sobre os mecanismos (ambos

in vitro

e

in vivo

) revelou que FBA-TPQ pode exercer a sua actividade através de espécies reativas de oxigênio (ROS) activação -associated do receptor de morte, p53-MDM2, e PI3K-Akt em células OVCAR-3, que é de acordo com o

in vitro

análise de dados de microarranjos (microarrays genoma humano, Agilent) (GEO número de acesso: GSE25317). Em conclusão, a FBA-TPQ exibe actividade anticancerígena significativa contra células cancerosas de ovário, com o mínimo de toxicidade para células não tumorigénicas humanos Iosé-144, indicando que pode ser um agente terapêutico potencial para o cancro do ovário

citação:. Chen t, Xu Y, Guo H, Liu Y, P, Hu, Yang X et al. (2011) Experimental Terapia de cancro do ovário com Synthetic Makaluvamine Analógico:

In Vitro

e

In Vivo

Anticancer Atividade e Molecular mecanismos de ação. PLoS ONE 6 (6): e20729. doi: 10.1371 /journal.pone.0020729

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de novembro de 2010; Aceito: 11 de maio de 2011; Publicação: 06 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações de cem talentos Programa da Academia chinesa de Ciências, o National Nature Science Foundation (30870513, 31070680 e 91029715), do Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2007CB947100), a Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município ( 08391910800, 10391902100), Nacional de Ciência e Tecnologia Projeto principal “Key New Drug Criação e Programa Manufacturing” (2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011), a Comissão de Ciência e Tecnologia de Xuhui Distrital de Xangai Município (RCT201001, CRC2010002), Diretor da Fundação de INS (20090101), a Food Safety Research Center e chave do Laboratório de Nutrição e Metabolismo da INS, SIBS, CAS. R.Z. foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health /National Cancer Institute concede R01 CA112029 e R01 CA121211. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário, sendo responsável por cerca de 5 por cento dos cancros da morte das mulheres, é agora o quinto câncer comum nas mulheres nos Estados Unidos [1]. Cerca de 70% de todos os pacientes de cancro do ovário são diagnosticados em fases mais avançadas da doença, levando a um mau prognóstico [2], [3]. Ao longo das últimas duas décadas, embora a taxa de sobrevivência de cinco anos para os doentes com cancro do ovário, foi substancialmente melhorada em consequência da aplicação de sucesso da cirurgia e o desenvolvimento ou optimização de drogas tumoricidas, a sobrevivência ainda continua a ser baixa, em cerca de 30% [2] – [4]. Assim, existe uma necessidade urgente de desenvolver novos agentes terapêuticos que podem ser utilizados para tratar a doença.

Os organismos marinhos são uma rica fonte de compostos de chumbo com propriedades farmacológicas potenciais únicas [5], [6]. Numerosos produtos naturais marinhos com estruturas moleculares novas e diversas funções biológicas têm sido relatados durante as últimas décadas [7]. Makaluvamines, uma classe de alcalóides pyrroloiminoquinone marinhos isolados a partir de esponjas do género

Zyzzya

, foram relatados para ter potente

in vitro

e

in vivo

citotoxicidade contra vários cancros humanos linhas celulares, e esta actividade foi atribuída a sua actividade como inibidores da topoisomerase II [8] – [14]. Vários outros makaluvamines foram mostrados para causar danos no DNA direta levando a efeitos anti-tumorais [6], [15].

Temos sintetizado mais de 40 novos análogos makaluvamine e sistematicamente avaliadas as suas actividades anticancerígenos em células de câncer de mama linhas. Os nossos dados mostraram que o análogo makaluvamine potente, FBA-TPQ, pode inibir o crescimento do tumor através da activação de supressores de tumor, inibição de oncogenes e a activação da resposta de dano de DNA [6], [16]. No presente relatório, ampliamos nosso estudo para avaliar as actividades anti-tumorais de FBA-TPQ contra células de cancro do ovário e tentou elucidar os possíveis mecanismos de ação.

Resultados

O

in vitro

citotoxicidade da FBA-TPQ às células A2780 e OVCAR-3 foram inicialmente avaliada utilizando o ensaio de MTS (Promega). A2780 e OVCAR-3 e (células imortalizadas não tumorigénicas epitelial de ovário de superfície) do ovário humano IOSE144 células foram expostas a FBA-TPQ (ver Fig. 1A) a várias concentrações durante 48 horas. A viabilidade das células A2780 e células OVCAR-3 foram significativamente diminuído, com IC

50 a 1780 nM (A2780) e 980 nM (OVCAR-3) (Fig. 1B). A exposição a FBA-TPQ levou a dose-dependente efeitos sobre a sobrevivência das células, inibindo a viabilidade A2780 de 25,2%, 45,7%, e 65,8%, enquanto inibindo células OVCAR-3 viabilidade de 33,9%, 56,7%, e 73,7%, respectivamente, para o 0,5, 1,0 e 2,5 uM, respectivamente concentrações, (Figura 1, p . 0,05). Por outro lado, as células IOSE144 eram muito menos sensíveis ao tratamento com ACE-TPQ, com um IC

50 mais de 10 uM (Fig 1B, p. 0,01). A exposição a FBA-TPQ diminuiu a viabilidade de células Iosé-144 2,7%, 7,7% e 25,6%, respectivamente, para os uM concentrações de 0,5, 1,0 e 2,5 (Fig. 1B), o que indica que FBA-TPQ tem actividade selectiva contra células de câncer de ovário. Além disso, a FBA-TPQ inibida A2780 e OVCAR-3 células de proliferação de um modo dependente da dose (Fig. 1C e 1D), enquanto que os seus efeitos anti-proliferativos foram muito menos evidentes nas células IOSE144 tratadas com as mesmas concentrações de FBA- TPQ (Fig. 1E). Na verdade, a FBA-TPQ A2780 inibiu significativamente e OVCAR-3 células de proliferação começando na concentração de 0,5 uM (Fig 1C e 1D, p. 0,05) ao passo que não houve nenhuma inibição significativa nas células Iosé-144 em qualquer das concentrações ( até 1 uM; Fig. 1E, p 0,05). Estes dados sugerem que a ACE-TPQ pode inibir selectivamente A2780 e o crescimento de células do cancro do ovário OVCAR-3 e a proliferação enquanto exerce menos efeitos potentes sobre IOSE144 células não tumorigénicas.

A, a estrutura química e a fórmula molecular de FBA-TPQ ; B, A viabilidade celular (MTS) ensaio das células de carcinoma do ovário humano células OSE (A2780 e OVCAR-3) e não tumorigénica (IOSE144) após uma incubação de 48 h com FBA-TPQ; C D E, a inibição do crescimento celular após 0, 24, 48 ou 72 h de exposição de A2780 (C), células de FBA-TPQ (em concentrações de 0 OVCAR-3 (D) e Iosé-144 (E), 0,5 , 0,75 e 1,0 uM). Todos os valores são representativos de pelo menos três experiências independentes, com resultados semelhantes, e são apresentados como a percentagem de inibição do crescimento celular, em que as células foram tratadas com o veículo considerado (inibição do crescimento de 0%) 100% viáveis.

Desde FBA-TPQ dramaticamente reduzida a sobrevivência de células OVCAR-3 e a proliferação, o próximo escolheu esta linha celular de cancro do ovário mais FBA-TPQ-sensível para investigar o mecanismo subjacente responsável pela diminuição na viabilidade celular expostas ao composto. Primeiro, avaliamos se FBA-TPQ pode induzir a apoptose OVCAR-3 células “. Como mostrado na Fig. 2A e 2B, FBA-TPQ induziram fortemente a apoptose de uma forma dependente da dose durante a exposição de 24 h. Na concentração 0,5 uM, FBA-TPQ aumento da apoptose nas 3 OVCAR-células a 260% (das células de controlo), ao passo que a 1,5 ^ M de concentração, o índice de apoptose foi aumentada em cerca de 4 vezes (Figura 2B, p. 0,05 ). Os efeitos pró-apoptóticos foram mais profunda na concentração de 2,5 uM (índice apoptótico aumentada para cerca de 600% em comparação com o controlo) (Figura 2B, p. 0,01). Para concluir, os nossos dados demonstraram que ACE-TPQ pode induzir apoptose significativa nas células OVCAR-3 de um modo dependente da dose.

A, a apoptose de células OVCAR-3 tratadas com diferentes concentrações de ACE-para TPQ 24 h; B, resumo e análise do índice apoptótico de Dados (Q1 reflete necrose, Q2 reflete tarde apoptose, Q3 reflete população de células saudáveis ​​que não foi afectada por apoptose ou necrose, enquanto Q4 reflete apoptose precoce). C, Cell avaliação ciclo de OVCAR-3 células tratadas com concentrações seriadas de FBA-TPQ para 12 horas; D, A análise dos dados de células apresentados como a percentagem da distribuição de uma fase específica (*,

P

0,05 versus o controlo, **,

P

0,01 versus o controlo, respectivamente ). Os dados são representativos de valores a partir de pelo menos três experiências independentes, com resultados semelhantes.

também investigaram se FBA-TPQ tem qualquer efeito sobre a progressão do ciclo celular em células OVCAR-3. Para este ensaio, que diminuiu o tempo de incubação FBA-TPQ a 12 h, para se evitar a indução de alta apoptose. Como ilustrado na Fig. 2C e 2D, após um tratamento de 12 h, a FBA-TPQ induziu um aumento significativo no número de células em G

2 /H de fase no 1500 nM (aumento de 21.6% do controlo, P 0,05) e 2,5 uM (aumento de 30.0% do controlo, P 0,05) as concentrações. Além disso, o tratamento com ACE-TPQ também levou a um aumento significativo no número de células na fase S, na concentração de 2,5 uM (Fig 2D, p. 0,05). Conforme resumido na Fig. 2D, FBA-TPQ causou uma concomitante, dependente da dose, a diminuição do número de células no /G1-fase G0 (p 0,01). Tomados em conjunto, os nossos dados sugerem que os efeitos inibidores de ACE-TPQ sobre a viabilidade celular e o crescimento podem ser associadas com a sua indução de apoptose e paragem do ciclo celular.

No nosso trabalho anterior, que relatou que FBA-TPQ pode exercer danos no ADN em células de cancro da mama [6]; Aqui, nós investigamos se FBA-TPQ pode induzir estresse ROS celular e causar dano oxidativo ao DNA em células de cancro do ovário. Neste ensaio, que diminuiu o tempo de incubação de novo para 4 h (para evitar a atenuação ROS), enquanto o aumento das concentrações de série para 0, 1,0, 2,0 e 3,0 uM (para produzir indução rápida ROS para agarrar a imagem). Como mostrado na Fig. 3A e 3B, após 4 horas de incubação, a FBA-TPQ induziu um aumento significativo (p 0,05) aumento dose-dependente na produção de ROS celular em células OVCAR-3 (Fig 3B.). Com base na nossa observação de que FBA-TPQ poderia induzir a apoptose, foi avaliado o potencial mitocondrial transmembranar (

ΔΨm

) dissipação como indicador de ruptura da membrana mitocondrial e as células sofrem apoptose. Utilizando o corante JC-1, observou-se que o tratamento com ACE-TPQ resultou em um aumento significativo (p 0,05) dose-dependente

ΔΨm

(redução dependente da dose de dissipação de JC-1 agregados é indicada pela diminuição da proporção do vermelho /intensidade de fluorescência verde), após 24 horas de exposição (Fig. 4A e 4B). Tomados em conjunto, estes resultados fornecem evidências de que FBA-TPQ induz a produção elevada celular ROS e perda de potencial de membrana mitocondrial, iniciando o ROS via de apoptose endógena acionados por estresse precoce celular

A . B, FBA-TPQ induz a dose -dependente ROS estresse nas células OVCAR-3 (a, o aumento dependente da dose na ROS, tal como indicado por CM-H

2DCFDA; B, dados resumidos como a percentagem em comparação com o controlo). C, a análise Western blot dos níveis de expressão de proteínas celulares da via relacionada, indicando FBA-TPQ pode demorar efeitos através do ROS-acompanhado, e PI3K-Akt mediada /p53-MDM2 relacionados com a proliferação celular, via de apoptose e ciclo celular progressão associada OVCAR-3 em linhas celulares de cancro de ovário, após 24 h de exposição (em 250,750 e 1000 concentrações nM).

a e B, a intensidade de fluorescência (JC-1 produz fluorescência vermelha dentro da mitocôndria como JC-1 -aggregates enquanto emite fluorescência verde quando vazamentos para o citoplasma como JC-1-monómeros; fluorescência mudança de intensidade entre o verde eo vermelho é proporcional ao

ΔΨm

mudança) valores de JC-1 corante em comprimentos de onda ea excitação específicas proporção de vermelho /verde mudança correspondente (% do controlo) após a exposição à FBA-TPQ durante 24 h (*,

P

0,05 versus controlo). C D, A inibição do crescimento do tumor em ratinhos portadores de OVCAR-3 tumores de xenoenxerto (*,

P

0,05 versus o controlo; **,

P

0,01 versus controlo) , e as correspondentes alterações de peso corporal durante os tratamentos (

P

0,05); E, análise de Western-blot de proteínas (dos ratinhos tumores de xenoenxertos após o tratamento FBA-TPQ de 0, 1 ou 10 mg /kg dose) envolvidas na FBA-TPQ-desencadeada, e PI3K-Akt mediado /p53-MDM2-relacionada via.

Para definir ainda mais os efeitos de FBA-TPQ na apoptose celular, progressão do ciclo celular, e a proliferação, nós investigamos o nível de expressão de um painel de proteínas envolvidas nestas vias de OVCAR-3 células (ver Fig. 3C). Após um tratamento de 24 h de FBA-TPQ (com concentrações de 0, 0,25, 0,75 e 1,0 ^ M), foi observado um aumento dependente da dose, na expressão de poli cleaved- (ADP-ribose) polimerase (PARP) e caspase 3, bem como a Bax, com uma diminuição dependente da dose na concomitante de Bcl-2. Nós investigamos ainda mais os possíveis mecanismos responsáveis ​​pelos efeitos reguladores anti-proliferativa e do ciclo celular da FBA-TPQ. Tal como referido acima, foi avaliado o nível de várias proteínas associadas com a proliferação e progressão do ciclo celular de expressão, e observou-se a sub-regulação de cdc25C, CyclinB1 e Ciclina Quinase Dependente (CDK) 1, que são responsáveis ​​pela transição de fase G2 /M, e encontraram um aumento na expressão de proteínas Rb, p21 e p27, bem como uma diminuição na proteína E2F1, todos os quais estão envolvidos na proliferação celular (Fig. 3C). Além disso, os nossos dados mostraram que FBA-TPQ pode diminuir a expressão e activação (indicado por fosforilação) de Akt, bem como a sua quinase a montante da subunidade catalítica da PI3K-110α de PI3K. Nós ainda avaliados os efeitos regulatórios da FBA-TPQ de p53, e descobriu que FBA-TPQ ativada p53, com um acompanhamento de baixo-regulação na expressão de MDM2 (ver Fig. 3C), e aumento da clivagem de PARP e caspases-3. Estas descobertas são indicativas de apoptose e /ou efeitos inibitórios anti-proliferativas e ciclo celular. Como demonstrado na Fig. 3C, também observamos uma dose-dependente, a regulação positiva de Fas, indicando que a via de receptor de morte, em conjunto com a p53, pode desempenhar um papel importante na resposta a FBA-TPQ e a sua estimulação de ROS stress. Tomados em conjunto, podemos concluir que a FBA-TPQ pode exercer seus

in vitro

efeitos através do ROS-associado, e /progressão associada vias de proliferação celular, apoptose e ciclo celular relacionados com o p53-MDM2 PI3K-Akt mediada (Fig. 5).

Eu estabeleci o modelo de xenotransplante tumoral OVCAR-3 para avaliar a

in vivo actividade anti-tumoral

da FBA-TPQ. O composto foi administrado durante 5 dias por semana i.p. a uma dose de 1 mg /kg ou 10 mg /kg. Os efeitos terapêuticos foram avaliados por análise de crescimento do tumor. Como mostrado na Fig. 4C, FBA-TPQ exibe significativa (p 0,01) inibição do tumor de um modo dependente da dose. Os efeitos inibidores do crescimento tumoral significativa começaram a ser evidentes no nono dia de tratamento (p 0,05). Após 18 dias de tratamento, FBA-TPQ resultou em 20,5% de inibição do crescimento do tumor (em comparação com o grupo de controlo) com a dose mais baixa de 1 mg /kg, e inibição do crescimento do tumor de 69,4% na dose de 10 mg superior /kg (Fig. 4C , p 0,01). Além disso, embora os ratinhos que receberam a dose de 10 mg /kg experimentou uma ligeira perda de peso corporal, não houve diferenças significativas na perda de peso corporal (P 0,05) entre os três grupos, indicando que FBA-TPQ pode ter um perfil de segurança aceitável (Fig. 4D).

Para validar o

in vitro

descobertas sobre o mecanismo de ação da FBA-TPQ, avaliou-se ainda mais o

in vivo

nível da expressão proteínas examinadas nas células em cultura (Fig. 4E). Consistente com o

In vitro

dados, os padrões de expressão da proteína no tecido de tumor de xenoenxerto tratado eram essencialmente as mesmas como as observações celulares (Fig. 3C e Fig. 4E), confirmando que os efeitos anti-tumorais de FBA-TPQ são, pelo menos parcialmente mediado através da indução do stress ROS e subsequente colapso mitocondrial, que levam a alterações nas cascatas celulares que estão envolvidas na apoptose, proliferação celular e na progressão do ciclo celular.

Discussão

o presente estudo é o primeiro a investigar sistematicamente o romance makaluvamine sintético analógico da FBA-TPQ

in vitro

e

in vivo

efeitos anti-tumorais em células de cancro do ovário. Nós demonstramos que FBA-TPQ exerce as suas actividades anti-cancro nas células A2780 e OVCAR-3 por inibição do crescimento e proliferação celular. Utilização posterior estudo a linha celular OVCAR-3 mais sensível revelou que poderia induzir a apoptose celular e a paragem do ciclo celular. Tais resultados funcionais são alcançados através de uma cascata de reações dentro destas vias, incluindo a indução de estresse celular ROS, a ativação do receptor de morte e colapso mitocondrial, e regulamentação subsequente de p53-MDM2 e PI3K-Akt percursos associados.

nossos estudos prévios, que mostraram que FBA-TPQ é o análogo mais potente makaluvamine no que diz respeito à indução de danos no DNA, a apoptose, a paragem do ciclo celular e inibição da proliferação em células de cancro da mama [6]. No entanto, os possíveis mecanismos subjacentes a essas actividades anti-tumorais e de aplicação potencial do composto para outros tipos de cancro não tinha sido elucidado. O foco do estudo foi determinar se FBA-TPQ poderia representar um candidato promissor para o futuro desenvolvimento de drogas anti-câncer, e para elucidar seu mecanismo (s) de ação.

Inicialmente observou que FBA- TPQ exerce citotoxicidade e proliferação celular efeitos significativos de inibição em relação A2780 e células OVCAR-3. avaliação subsequente revelou um efeito dependente da dose de FBA-TPQ em OVCAR-3 células de apoptose, e a progressão do ciclo celular (G2 /M célula fase de paragem do ciclo). Estas observações foram ainda apoiada pelo perfil de expressão de proteínas relacionadas em células OVCAR-3, utilizando transferência de Western. Na tentativa de explorar o mecanismo (s) de ação subjacentes às atividades biológicas observados de FBA-TPQ, descobrimos que FBA-TPQ pode induzir estresse ROS celular e subsequente colapso mitocondrial, fornecendo uma explicação potencial para a cascata provocando o

in vitro

efeitos anticancerígenos, incluindo a apoptose. Em seguida, avaliou-se a

in vivo

actividade da FBA-TPQ no modelo de xenotransplante de cancro do ovário OVCAR-3, e mostrou que FBA-TPQ pode voltar a exercer actividade tumoricida potente, com inibição do crescimento do tumor em até 69,4% em a dose de 10 mg /kg. Nós sistematicamente (ambos

in vitro

e

in vivo

) avaliaram seu mecanismo subjacente (s) de acções, e nossa

in vivo

estudos confirmaram que a FBA-TPQ exerce a sua efeitos anti-tumorais potentes principalmente por afectar a proliferação celular, induzir apoptose celular e a paragem do ciclo celular.

A clivagem de PARP e pro-caspase-3 são os indicadores bem documentados de apoptose [18], [19]. Os membros da família Bcl-2, tais como Bcl-2 e Bax, são conhecidos os reguladores críticos responsáveis ​​pela sobrevivência celular /apoptose [20] – [22]. Nós demonstramos uma clivagem dependente da dose da PARP e pro-caspase-3, bem como uma diminuição dependente da dose na proporção de Bcl-2 /Bax em células-TPQ-tratados FBA e tumores, fornecendo indícios de que FBA-TPQ induz apoptose. Com base em nossos dados anteriores que mostram que a FBA-TPQ pode agir como um agente de degradação do DNA, foi avaliado o nível de ROS em células OVCAR-3 após a FBA-TPQ incubação, como a oxidação (em conjunto com a metilação, depurinação e deamination) causada por ROS stress pode contribuir para danos no ADN [23]. Com efeito, observou-se um aumento dependente da dose no nível celular ROS, assim como uma dissipação de dose-dependente do potencial de membrana mitocondrial. Uma vez que a perda de potencial de membrana mitocondrial é considerado um evento precoce na apoptose [18], [24], pode-se concluir que FBA-TPQ desencadeia a apoptose observada em OVCAR-3 células por indução de um nível elevado de ROS celular, que conduz à subsequente colapso mitocondrial membrana [23], [24].

células utilizar os checkpoints do ciclo celular para garantir a correcta execução do ciclo celular, a fim de proteger as células em divisão de danos no DNA potencialmente fatal [25], [26]. As células podem ser presos na fase G2 /M, a fim de se submeter a reparação do ADN ou morte celular apoptótica [26], [27]. Para investigar ainda mais os efeitos de FBA-TPQ na paragem do ciclo celular como um resultado da sua indução de dano do ADN, foi avaliada a sua modulação da expressão de proteínas-chave envolvidas na G2 /sinalização M, e observou-se um decréscimo dependente da dose na expressão de cdc25C e CDK1 /ciclina B1, cuja ativação são a chave para o G2 /M progressão [26], [28], [29]. Isto confirma que ACE-TPQ promove G2M prisão /de OVCAR-3 células seguintes dano induzido por ROS.

Activação de p53 é um importante mecanismo de acção de diversos agentes que danificam o ADN [6]. Observou-se um aumento dependente da dose na expressão mutante de p53 em células OVCAR-3, o que é consistente com o nosso relatório anterior que as células respondem a danos FBA-TPQ independentemente do seu estado de p53 [6]. Observou-se também a infra-regulação de MDM2 e uma diminuição concomitante no E2F1, e aumento da expressão de Rb, p21 e p27 [30], [31], o que indica que a activação do circuito fechado de realimentação de p53-MDM2 é provavelmente responsável pela FBA- aumento da apoptose e ciclo celular prisão e a diminuição no crescimento e proliferação celular em células A2780 e células OVCAR-3-TPQ tratamento induzida. A via de sinalização de Akt desempenha um papel crítico na regulação da sobrevivência celular [32], [33]. A activação de Akt por PI3K (fosfoinositide-3-OH-cinase) quinase pode regular factores de transcrição que são responsáveis ​​por proteínas pro- e anti-apoptóticas, bem como factores de crescimento para a sobrevivência em resposta a estímulos extracelulares ou danos [32]. Akt fosforilada (P-Akt) é relatado para ser capaz de impedir a apoptose e supressão de crescimento dependente de p53 por MDM2 fosforilar [34]. Os nossos dados mostraram um decréscimo dependente da dose na P-Akt (e t-Akt) e o seu activador a montante de PI3K (subunidade catalítica) e um aumento na Fas (receptor de morte), o que sugere que o estímulo FBA-TPQ -suppresses a PI3K-Akt (P-Akt) via e fosforila MDM2 para regular a expressão de factores de crescimento (E2F1, Rb, p21 e p27, etc.) ou por apoptose (PARP, Bcl-2, Bax e caspase-3, etc.) e do ciclo celular relacionada (cdc25C, CDK1 e ciclina B1, etc.) proteínas, resultando em efeitos anti-câncer sustentada do composto

Considerando a alta taxa de mortalidade de câncer de ovário [1] – [4]., é necessidade de explorar novos agentes que podem agir através de novos mecanismos de ação para melhorar a terapia de câncer de ovário. O presente estudo sugere que o análogo de makaluvamine mais eficaz, FBA-TPQ, pode ser uma nova e agente anti-cancro do ovário promissor, na medida em que pode preferencialmente e inibem de forma potente de células OVCAR-3 do cancro do ovário (mas não não-tumorigénica de células OSE) crescimento. De acordo com a nossa

in vitro

e

in vivo

dados, acreditamos que a FBA-TPQ pode inibir o crescimento de carcinoma de ovário, desencadeando o relacionado com o Fas /ROS-associado e PI3K-Akt mediada /p53-MDM2 relacionadas com aumento da apoptose celular e a paragem do ciclo celular e a diminuição na proliferação celular (Fig. 5). Estas conclusões foram confirmadas ao nível da proteína em

in vitro

e

in vivo

, e foram consistentes com a nossa análise de dados microarray (ver texto S1, Fig. S1, Tabelas S1, S2, S3 ), que FBA-TPQ exerce a sua actividade principalmente através da sua indução de ROS e danos no ADN, a regulação da “via de cancro”, “via de sinalização de p53” e “sistema de sinalização fosfatidilinositol ‘(por exemplo, PI3K-Akt), bem como sua regulação negativa de CDK (por exemplo, CDK1 eo cdc25C relacionado e CyclinB1).

Em conclusão, nosso estudo demonstrou que a FBA-TPQ pode exercer citotoxicidade e proliferação celular efeitos inibição potente em relação A2780 e células OVCAR-3. Excepto para a indução de apoptose, também pode induzir a paragem do ciclo celular e inibir o crescimento de OVCAR-3 ‘tumores de xenoenxerto através da iniciada pelo receptor de ROS /morte, e PI3K-Akt mediado /p53-MDM2-relacionada a proliferação celular e a apoptose e o ciclo celular vias associado de progressão (ilustrado na Fig. 5). No entanto, o mecanismo exacto (s) do composto, e se exerce os mesmos efeitos em outros tipos de tumores têm ainda de ser bem elucidado. No futuro, o presente estudo, juntamente com os nossos achados anteriores [6], com certeza vai melhorar a nossa compreensão sobre os mecanismos de ação dos analógico makaluvamine e também irá fornecer uma base para o futuro desenvolvimento clínico da FBA-TPQ como um romance anti agente -Câncer.

Materiais e Métodos

compostos e reagentes

Todos os produtos químicos eram todos de grau analítico. FBA-TPQ foi uma simpática oferta do Professor Sadanandan Velu (UAB, Birmingham, AL, EUA). iodeto de propídio (P4170) foi comprado na Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, EUA). O JC-1 de corante (5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3, 3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodeto) (T-3186), o reagente TRIZOL e CM-H

2DCFDA [5- (e-6) -Clorometil-2 ‘, 7’- acetil éster diacetato dichlorodihydrofluorescein] (C6827) foram adquiridos a partir de Invitrogen Molecular Probes Co. (cidade, estado, EUA). O celular CellTiter 96® AQ

ueous One Solution (G3580) Ensaio de Proliferação (ensaio MTS) kit foi adquirido de Promega Co., Ltd. (Madison, WI). O kit de ensaio de proteína DC (500-0113) foi obtido a partir de Bio-Rad (Hercules, CA, EUA), e o sistema de ECL mais foi comprado de Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, Reino Unido). Todas as fontes de cultura de células foram obtidas de Invitrogen-Gibco Co. (cidade, estado, EUA). O anticorpo anti-MDM2 humano foi obtido a partir de Calbiochem® EMD Chemicals Inc. (Darmstadt, Alemanha), o anticorpo da Caspase-3 (8G10) foi adquirido a Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EUA), e o anticorpo anti anticorpo -humana β-actina (CA-74) foi obtido a partir de Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). p53 anti-humano (SC-98), Fas (SC-8009), PI3K110a (SC-7189), PI3K85a (SC-423), AKT (SC-8312), p-AKT (SC-7985-R), a PARP (H-250, SC-7150), Bax (SC-493), Bcl-2 (SC-509), Rb (SC-50), p21 (SC-817), p27 (SC-528), E2F1 (SC -193), CDK1 (SC-8395), ciclina B1 (SC-595), e cdc25C () anticorpos SC-13138, em conjunto com todos os anticorpos secundários (anti-rato, anti-cabra e anti-imunoglobulina G de coelho) foram adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EUA).

linhas celulares e Cultura celular

Human ovário A2780 carcinoma e OVCAR-3 células e IOSE144 ovário humano (Imortalizada não- de superfície do ovário células epiteliais tumorigênicos) que foram originalmente obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) foram presentes de Dr. Jing fang (Instituto de Ciências da Nutrição, Xangai, China). Todas as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina /estreptomicina de acordo com as instruções do ATCC. FBA-TPQ foi dissolvido em DMSO, em seguida, diluída em meio de cultura celular ( 0,1%, a concentração de incubação final).

Ensaio de viabilidade celular

O crescimento celular e a viabilidade foram determinados pelo ensaio de MTS utilizando o CellTiter 96® AQ

ueous Uma Solução de Proliferação celular Assay kit (G3580, Promega). Em resumo, 4 × 10

3 células (por poço) foram semeadas em placas de 96 poços e foram tratadas durante 48 h com FBA-TPQ (dissolvido em DMSO 0,1%, concentração final) em concentrações em série (0 , 100, 500, 750, 1000, 1500 e 2500 nM), ou foram tratados durante vários tempos (0, 24, 48 e 72 h) com FBA-TPQ em concentrações de 0, 500, 750 e 1000 nM. Após o tratamento 24~72 horas, 20 ul de solução de MTS foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas durante um período adicional de 2~4 horas a 37 ° C, após o que a absorvância a 490 nm foi registada usando um SpectraMax

190 leitor de microplacas (Molecular Devices, EUA) para calcular as percentagens de sobrevivência celular.

Detecção de apoptose

apoptose celular foi detectado por meio de um kit de anexina V-FITC comprado de BioVision, Inc [6], [17]. Resumidamente, 1 x 10

6 as células foram semeadas em placas de 6 cm e tratou-se com o composto de teste (FBA-TPQ) a 0,5, 1,5 e 2,5 uM durante 24 horas antes da análise. As células aderentes e flutuantes tripsinizadas foram recolhidas e preparadas para a detecção de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram analisadas com um citómetro de fluxo FACSAria ™ (Becton Dickinson, EUA) após a incubação no escuro à temperatura ambiente durante 5 min. Células positivas para apoptose precoce (anexina V-FITC única manchadas, consulte Q

4 na Figura 2A) e para o final de apoptose (anexina V-FITC e PI manchado, consulte Q

2 na Figura 2A) foram combinadas.

análise do ciclo celular

iodeto de propídio (PI) a coloração foi realizada para determinar os efeitos de FBA-TPQ sobre o ciclo celular [6]. Em resumo, 6 × 10

5 células que foram semeadas em placas de 6 cm foram expostas a FBA-TPQ (a 0, 0,5, 1,5 e 2,5 uM) e incubou-se durante 12 horas antes da análise. As células foram tripsinizadas, lavadas com PBS e fixadas em 1 ml de etanol a 70% (700 mL de 100% de etanol adicionada a 300 ul de PBS) a 4 ° C durante a noite, seguido por centrifugação (3000 rpm, 5 min), a incubação com RNase (100 ug /ml) e coloração com iodeto de propídio (50 ug /ml) durante 15 minutos no escuro. O conteúdo de DNA foi analisado por um laboratório celular Quanta ™ SC citômetro de fluxo (Beckman Coulter, EUA).

Medição de espécies reativas de oxigênio (ROS)

A produção de ROS foi medido utilizando 5- (e-6) -Clorometil-2 ‘, 7’- éster diacetato acetil dichlorodihydrofluorescein (CM-H2DCFDA). Resumidamente, as células (~ 7 × 10

5) foram semeadas em placas de 6 cm e exposta a FBA-TPQ durante 4 horas, em concentrações em série (0, 1,0, 2,0 e 3,0 uM), após o que as células foram colhidas e lavou-se uma vez com PBS, depois incubadas com 5 ^ M CM-H2DCFDA (em DMSO) durante 30 min a 37 ° C em meio RPMI 1640 isento de vermelho de fenol-.